莊齊斌,鄭曉春,楊德勇,彭彥昆,*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院,北京 100083;2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心,北京 100083)
肉品在我國(guó)膳食結(jié)構(gòu)中占有重要的地位,然而在生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)及銷售過程中因腐敗變質(zhì)而影響其品質(zhì)安全[1-2]。因此,對(duì)肉品的質(zhì)量檢測(cè)具有重要意義。揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量和菌落總數(shù)(total viable count,TVC)是評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[3-4],通過這些指標(biāo)判斷肉品是否符合食用標(biāo)準(zhǔn)。然而,常規(guī)的檢測(cè)方法具有破壞性、檢測(cè)效率低的弊端。因此,研究肉品快速、無損檢測(cè)方法具有重要意義。
TVB-N含量與TVC作為判斷肉品新鮮度和腐敗程度的主要依據(jù),可以通過其含量檢測(cè)肉品的貨架期[5-8]。許多學(xué)者做了相關(guān)的研究,取得了較好結(jié)果。佟懿等[9]利用TVB-N含量與TVC建立帶魚貨架期預(yù)測(cè)模型,模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到±10%以內(nèi)。秦瑞升等[10]以TVB-N含量與TVC為指標(biāo)研究溫度對(duì)貨架期的影響,表明凍藏可以減緩菌落生長(zhǎng)延長(zhǎng)貨架期。何帆等[11]基于不同包裝條件建立菌落總數(shù)生長(zhǎng)模型,擬合微生物的真實(shí)生長(zhǎng)情況,取得較好效果。陳睿等[12]通過菌落總數(shù)及感官指標(biāo)的變化確定早餐腸最小腐敗量為6.49(lg(CFU/g)),建立的貨架期模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值相對(duì)誤差值在1 d左右浮動(dòng)。然而綜合現(xiàn)有研究來看,目前的文獻(xiàn)多數(shù)通過TVB-N含量與TVC研究肉品的貨架期,并沒有對(duì)肉品的新鮮度與腐敗程度做進(jìn)一步分析。
高光譜檢測(cè)技術(shù)以快速無損檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在肉品檢測(cè)中備受關(guān)注[13-18]。Kamruzzaman等[24]利用900~1 700 nm波段高光譜技術(shù)研究羔羊肉的化學(xué)成分,建立的蛋白質(zhì)模型其預(yù)測(cè)集決定系數(shù)R2為0.63。Dai Qiong等[4]利用400~1 000 nm高光譜技術(shù)建立的TVB-N含量預(yù)測(cè)模型實(shí)現(xiàn)了不同新鮮度對(duì)蝦的分類。宋育霖等[19]利用400~1 000 nm高光譜技術(shù)結(jié)合洛倫茲函數(shù)探究預(yù)測(cè)生鮮豬肉細(xì)菌總數(shù)的可行性,預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)高于0.85。而Huang Lin等[20]利用450~900 nm高光譜技術(shù)建立豬肉TVC的反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propagating artificial neutral net,BP-ANN)預(yù)測(cè)模型,預(yù)測(cè)集決定系數(shù)R2達(dá)到0.830 8。
本實(shí)驗(yàn)利用相同豬肉樣品在相同貯藏環(huán)境條件下,對(duì)比分析TVB-N含量與TVC在4 ℃貯藏時(shí)的含量隨時(shí)間的變化規(guī)律,探究豬肉新鮮度與腐敗程度的關(guān)系。并在此基礎(chǔ)上,利用高光譜技術(shù)建立豬肉新鮮度與腐敗程度的快速檢測(cè)方法。
選擇屠宰后經(jīng)24 h冷卻排酸的豬背最長(zhǎng)肌部分,購買于北京清河農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)大紅門品牌店的大白豬肉。購買后利用蓄冷裝置迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,在無菌條件下將豬肉切塊去除脂肪及結(jié)締組織并將其分割成8 cm×5 cm×2.5 cm表面平整的樣本,每個(gè)樣本單獨(dú)保存于滅菌的自封袋內(nèi),無積壓的放置于4 ℃冰箱中冷藏15 d,分析豬肉在腐敗過程中TVB-N含量與TVC的變化規(guī)律。
KDY-9820型半自動(dòng)凱氏定氮儀 北京通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限公司;ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
可見-短波近紅外(400~1 000 nm)高光譜反射系統(tǒng),由CCD相機(jī)、成像光譜儀、鹵鎢燈光源、激光位移探測(cè)器、平移臺(tái)、升降臺(tái)、采集控制用計(jì)算機(jī)組成。采集樣品高光譜數(shù)據(jù)前30 min預(yù)熱光譜儀,并通過控制軟件將樣本高度調(diào)整到最佳采集距離。
1.4.1 TVB-N含量的測(cè)定
根據(jù)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》方法,測(cè)定豬肉的TVB-N含量[2,14]。計(jì)算方法如式(1)所示:
式中:X為樣本中TVB-N含量/(mg/100 g);V1為測(cè)定樣本消耗的鹽酸體積/mL;V2為空白消耗的鹽酸體積/mL;c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度/(mol/L);m為樣本質(zhì)量/g。
1.4.2 TVC測(cè)定
根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行菌落培養(yǎng)與計(jì)數(shù)[21-22],菌落總數(shù)計(jì)算如式(2)所示:
式中:N為菌落總數(shù);C為適宜平板菌落數(shù)之和;n1為低稀釋度平板菌落數(shù);n2為高稀釋度平板菌落數(shù);d為稀釋因子。
為減少光源、檢測(cè)器靈敏度、相機(jī)和成像系統(tǒng)物理結(jié)構(gòu)差異造成的影響,采集樣本高光譜數(shù)據(jù)前需要進(jìn)行黑白參考校正,將獲取的原始高光譜圖像通過黑參考圖像和白參考圖像校準(zhǔn)為反射率模式。用相機(jī)蓋完全覆蓋相機(jī)鏡頭后,采集光譜圖像,獲得黑參考圖像(0%反射率),然后去除相機(jī)蓋采集標(biāo)準(zhǔn)白板硫酸鋇(100%反射率)獲取白參考圖像[23],樣本光譜反射率計(jì)算如式(3)所示:
式中:R為樣本反射率;I0為樣本的原始反射光譜圖像;Br為黑參考圖像;Ir為白參考圖像。
利用ENVI5.3軟件,手動(dòng)獲取2 500 像素的矩形感興趣區(qū)域,感興趣區(qū)域盡量選擇樣品的中心位置,將感興趣區(qū)域的平均光譜作為樣本的光譜數(shù)據(jù)。采集的樣本高光譜數(shù)據(jù),由于受到光的散射、外界環(huán)境、豬肉表面平整度以及顏色的差異的影響,導(dǎo)致采集的高光譜數(shù)據(jù)含有噪聲信號(hào)。因此,需要通過預(yù)處理去除光譜的噪聲影響提高模型的預(yù)測(cè)能力。本研究采用Savitzky-Golay(S-G)平滑、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate transformation,SNV)、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、一階導(dǎo)數(shù)(first derivatives,1stDER)和二階導(dǎo)數(shù)(second derivatives,2ndDER)5 種預(yù)處理方法增強(qiáng)高光譜數(shù)據(jù)信號(hào)。
通過相關(guān)系數(shù)R、校正集標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error of calibration,SEC)、預(yù)測(cè)集標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error of prediction,SEP)和實(shí)測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測(cè)集的標(biāo)準(zhǔn)誤差比值(relative percent deviation,RPD)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)效果[24-26],預(yù)測(cè)模型的R越大越好,SEP越小越好。當(dāng)RPD小于2表明模型的預(yù)測(cè)能力較差,在2~2.5之間表明模型定量預(yù)測(cè)可行,大于2.5表明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力[27]。
2.1.1 TVB-N含量變化規(guī)律分析
按照1.1節(jié)方法制備實(shí)驗(yàn)樣品,使用KDY-9820型半自動(dòng)凱式定氮儀參照GB 5009.228—2016的方法檢測(cè)豬肉TVB-N含量。每次測(cè)量3 個(gè)樣品,每天測(cè)量2 次,每12 h測(cè)一次,共持續(xù)15 d,共獲得90 個(gè)有效樣本,將每次測(cè)得的3 個(gè)樣本結(jié)果取均值,獲得4 ℃冷藏豬肉TVB-N含量隨時(shí)間的變化規(guī)律(圖1)。在本研究中,新鮮豬肉的TVB-N含量約為5 mg/100 g。豬肉在4 ℃冷藏的TVB-N含量隨時(shí)間變化成“J”型規(guī)律,且在第7.5天達(dá)到15 mg/100 g,變成次新鮮肉或者變質(zhì)肉,此時(shí),TVB-N含量進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段。豬肉的TVB-N含量第15天已達(dá)到134 mg/100 g,幾乎是初始階段的27 倍。另外,從圖1可以推測(cè)15 d后豬肉的TVB-N含量可能繼續(xù)增加,遠(yuǎn)超15 mg/100 g。
圖1 豬肉TVB-N含量隨冷藏時(shí)間的變化規(guī)律Fig. 1 Variation in TVB-N content in pork during cold storage
2.1.2 TVC變化規(guī)律分析
按照1.1節(jié)方法制備樣品,每天測(cè)量2 次,每12 h測(cè)一次,每次測(cè)量3 個(gè)樣品,共持續(xù)15 d,共獲得90 個(gè)有效樣本,參照GB 4789.2—2016方法計(jì)算豬肉的TVC,將每次測(cè)得的3 個(gè)樣品結(jié)果取均值,獲得豬肉在4 ℃冷藏的TVC隨時(shí)間變化規(guī)律(圖2)。結(jié)果表明,豬肉在冷藏期間的TVC隨時(shí)間變化成“S”型規(guī)律,TVC的初始值為3.73(lg(CFU/g)),且進(jìn)入遲滯期,第3.5天進(jìn)入對(duì)數(shù)期,第5.5天超過6.00(lg(CFU/g)),第10天進(jìn)入平穩(wěn)期,第15天TVC已經(jīng)接近了10(lg(CFU/g)),但仍未見進(jìn)入衰亡期的跡象。
圖2 豬肉TVC隨冷藏時(shí)間變化規(guī)律Fig. 2 Variation in TVC in pork during cold storage
微生物的一級(jí)模型主要用于描述成S型變化趨勢(shì)的微生物生長(zhǎng)規(guī)律[28],圖2表明豬肉在冷藏期間的TVC隨時(shí)間成S型的生長(zhǎng)趨勢(shì)。而修正的Gompertz方程是常用擬合微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)的一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[29]。因此,選用修正的Gompertz方程擬合豬肉的菌落生長(zhǎng)規(guī)律,菌落生長(zhǎng)規(guī)律的擬合方程為N(t)=3.957 6+5.795 8×e-e-0.3976(t-5.6013),決定系數(shù)R2為0.993 9(圖3),說明本研究中生鮮豬肉的TVC生長(zhǎng)符合經(jīng)典修正型Gompertz模型。根據(jù)擬合方程計(jì)算當(dāng)t等于5.498 1,即約貯藏5.5 d,TVC超過6(lg(CFU/g)),成為“腐敗肉”。
圖3 TVC實(shí)測(cè)值與生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算值對(duì)比Fig. 3 Comparison of measured value and model-calculated value of TVC
2.1.3 TVB-N含量與TVC的變化規(guī)律分析
根據(jù)圖1、2中TVB-N含量與TVC的變化規(guī)律,將二者描述在同一張圖上進(jìn)行比較。從圖4可以看出,當(dāng)豬肉TVC在第5.5天超過了國(guó)標(biāo)規(guī)定腐敗限定值6.00(lg(CFU/g))時(shí),豬肉的TVB-N含量還遠(yuǎn)未達(dá)到15 mg/100 g。在第7.5天時(shí),當(dāng)TVC達(dá)到7.92(lg(CFU/g))時(shí),TVB-N含量為16.50 mg/100 g,剛超過15 mg/100 g。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)豬肉的TVB-N含量與TVC的限定,即當(dāng)TVC超標(biāo)時(shí),TVB-N含量還未超標(biāo),當(dāng)TVB-N含量超標(biāo)時(shí),TVC已遠(yuǎn)超標(biāo)。
圖4TVB-N與TVC隨冷藏時(shí)間變化規(guī)律對(duì)比Fig. 4 Comparison of TVB-N and TVC in pork during cold storage
根據(jù)微生物學(xué)理論,豬肉在腐敗變質(zhì)過程中,TVB-N含量的變化與積累主要是由微生物的繁殖分解豬肉中蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致的。微生物的生長(zhǎng)要經(jīng)歷遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及消亡期4 個(gè)階段,不同階段微生物對(duì)肉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解速率及消耗量均不同,使得TVB-N含量亦隨之發(fā)生變化。
2.2.1 理化數(shù)據(jù)分析
采用1.1節(jié)方法,制備一批大小為8 cm×5 cm×2.5 cm的樣本,平整放置于4 ℃的冰箱中進(jìn)行貯藏。每24 h從冰箱隨機(jī)取4 塊樣本在室溫下回溫30 min,用于高光譜數(shù)據(jù)的采集及理化值測(cè)定,實(shí)驗(yàn)周期為15 d,共獲得有效樣本56 個(gè)。采用X-Y共生距離的樣本劃分(sample set partitioning based on jointX-Ydistances,SPXY)方法將56 個(gè)樣本按3∶1劃分為校正集和預(yù)測(cè)集[30]。冷藏期間豬肉樣本的TVB-N含量與TVC統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示,其中校正集樣本的含量范圍包含了預(yù)測(cè)集樣本的含量范圍。這樣有利于構(gòu)建穩(wěn)定的預(yù)測(cè)模型。
表1 樣本各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results for TVB-N and TVC of samples
2.2.2 光譜數(shù)據(jù)分析
采集的樣本高光譜數(shù)據(jù)通過ENVI軟件獲取感興趣區(qū)域的平均光譜數(shù)據(jù)。圖5是樣本的原始曲線,分別采用S-G平滑、SNV、MSC、1stDER、2ndDER對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。S-G平滑預(yù)處理后光譜數(shù)據(jù)在400、900、1 000 nm波長(zhǎng)處的噪聲信號(hào)明顯減弱,而SNV與MSC預(yù)處理能消除豬肉樣本表面顆粒散射的影響,1stDER預(yù)處理的光譜在460、530、560、590、610、880、920 nm波長(zhǎng)處有明顯的峰,而經(jīng)2ndDER預(yù)處理的光譜在460、520、540、560、580、595、620、640、880、920 nm波長(zhǎng)處有峰值[31],970 nm附近的峰谷是O—H倍頻吸收帶,是水分的特征峰,920 nm附近的峰是C—H伸縮振動(dòng)四級(jí)倍頻[32],800~850 nm處是N—H鍵倍頻吸收峰[33]。光譜在這些波長(zhǎng)處的變化是豬肉在腐敗過程中因微生物群的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生的代謝物導(dǎo)致其化學(xué)成分變化引起的。
圖5 豬肉的不同預(yù)處理光譜Fig. 5 Raw and preprocessed spectra of pork samples
2.3.1 TVB-N含量建模與分析
建立不同預(yù)處理光譜數(shù)據(jù)與TVB-N含量的偏最小二乘回歸(partial least square regression,PLSR)預(yù)測(cè)模型,結(jié)果如表2所示。無預(yù)處理原始光譜建立的模型有較好的預(yù)測(cè)效果,模型的預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.915 4。除2ndDER預(yù)處理,其他幾種預(yù)處理方法都提高了模型的預(yù)測(cè)效果。其中,MSC預(yù)處理效果最好,Rp為0.957 2,SEP為2.802 5 mg/100 g,RPD達(dá)到3.093 7。圖6為TVB-N含量的實(shí)測(cè)值與MSC預(yù)處理的模型預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖。
表2 不同預(yù)處理方法的光譜建立的TVB-N含量模型結(jié)果Table 2 Calibration and prediction set parameters of models established with different spectral pretreatments for TVB-N prediction
圖6TVB-N含量的實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖Fig. 6 Scatter plot between measured values and model-predicted values of TVB-N content
2.3.2 TVC建模與分析
經(jīng)S-G平滑、SNV、MSC、1stDER、2ndDER等方法處理后的高光譜數(shù)據(jù)建立TVC的PLSR預(yù)測(cè)模型,結(jié)果如表3所示。建模結(jié)果顯示無預(yù)處理的原始光譜數(shù)據(jù)建立的模型預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)能達(dá)到0.904 5。S-G平滑處理的模型預(yù)測(cè)效果基本無變化,因?yàn)樵挤瓷涔庾V數(shù)據(jù)波動(dòng)不明顯。而通過SNV、MSC與1stDER預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)建模的預(yù)測(cè)能力明顯提高,其中1stDER處理的光譜所建模型的預(yù)測(cè)能力最好,Rp為0.965 0,SEP為0.340 7(lg(CFU/g)),RPD達(dá)到3.434 1。圖7為TVC的實(shí)測(cè)值與1stDER預(yù)處理的模型預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖。
表3 不同預(yù)處理方法的光譜建立的TVC模型結(jié)果Table 3 Calibration and prediction set parameters of models established with different spectral pretreatments for TVC prediction
圖7 TVC的實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖Fig. 7 Scatter plot between measured values and model-predicted values of TVC
通過上述討論并建立了TVB-N含量與TVC的PLSR預(yù)測(cè)模型。為檢驗(yàn)可見-近紅外高光譜裝置建模的可靠性與穩(wěn)定度,按1.1節(jié)方法制備樣本用于裝置的TVB-N含量與TVC模型的驗(yàn)證。每24 h從4 ℃的冰箱中隨機(jī)取2 個(gè)樣本在空氣中靜置30 min后獲取其高光譜數(shù)據(jù),然后測(cè)定TVB-N含量與TVC的參考值,實(shí)驗(yàn)共持續(xù)10 d共獲得20 個(gè)有效樣本,裝置的驗(yàn)證結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示TVB-N含量與TVC的外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.928 3和0.930 5,標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為3.556 2 mg/100 g和0.515 7(lg(CFU/g))。表明裝置建立的TVB-N含量與TVC模型具有較好的預(yù)測(cè)能力,能實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉新鮮度與腐敗程度的預(yù)測(cè)。
表4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Results of experimental verification
利用高光譜技術(shù)結(jié)合TVB-N與TVC指標(biāo)能建立穩(wěn)定且預(yù)測(cè)能力較好的豬肉品質(zhì)預(yù)測(cè)模型,根據(jù)豬肉TVB-N含量與TVC預(yù)測(cè)豬肉的新鮮度與腐敗程度。由本研究得到的豬肉在冷藏期間TVB-N含量及TVC隨時(shí)間變化規(guī)律可知,當(dāng)TVC超標(biāo)時(shí),TVB-N含量并未超標(biāo),但這時(shí)豬肉已經(jīng)被判定為“腐敗”,不能食用,然而根據(jù)新鮮度豬肉仍被判斷為“新鮮”,可食用。即TVC比TVB-N含量更早達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的肉品腐敗限定值。因此,豬肉在冷藏期間利用TVC作為豬肉品質(zhì)的優(yōu)先評(píng)價(jià)指標(biāo)更為合理,通過TVC可以更好地預(yù)測(cè)豬肉的貨架期。
本實(shí)驗(yàn)通過分析相同豬肉樣品在相同貯藏條件下TVB-N含量與TVC的變化規(guī)律,解明了豬肉新鮮度與腐敗程度的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上利用高光譜技術(shù)采集豬肉光譜數(shù)據(jù),建立不同方法預(yù)處理的豬肉PLSR預(yù)測(cè)模型。研究表明:
在4 ℃冷藏條件下,豬肉的TVC在第5.5天時(shí)超過國(guó)標(biāo)規(guī)定腐敗限值6(lg(CFU/g)),而此時(shí)的TVB-N含量還沒有達(dá)到國(guó)標(biāo)限定值15 mg/100 g,當(dāng)豬肉的TVB-N含量在第7.5天時(shí)達(dá)到15 mg/100 g,而TVC達(dá)到7.92(lg(CFU/g))。結(jié)果表明,TVC超標(biāo)時(shí),TVB-N含量還未超標(biāo),當(dāng)TVB-N含量超標(biāo)時(shí),TVC已遠(yuǎn)超國(guó)標(biāo)限定值。因此,利用TVC可以更好地評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)。
基于高光譜技術(shù)利用不同的預(yù)處理方法建立TVB-N含量與TVC的PLSR預(yù)測(cè)模型,結(jié)果表明采用MSC預(yù)處理方法建立的TVB-N含量預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)效果最好,Rp為0.957 2,SEP為2.802 5 mg/100 g,RPD為3.093 7;而采用1stDER預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)建立的TVC模型預(yù)測(cè)效果最好,Rp為0.968 2,SEP為0.332 7(lg(CFU/g)),RPD達(dá)到3.434 1。TVB-N含量與TVC的外部驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)分別為0.928 3與0.930 5,標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為3.556 2 mg/100 g和0.515 7(lg(CFU/g))。
因此,該研究能為高光譜技術(shù)在肉品品質(zhì)檢測(cè)中更好的應(yīng)用提供理論依據(jù)。