可視化跨越式滾環(huán)擴增技術(shù)檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌

苑 寧，張?zhí)N哲，張海娟，于 澤，盧 鑫，張 偉,,3,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北 滄州 061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071000）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）能引起人類患病[1]。世界衛(wèi)生組織將單核細胞增生李斯特氏菌列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌的世界第四大食源性病原菌[2]。單核細胞增生李斯特氏菌是胞內(nèi)致病菌，易交叉污染[3]，感染后會出現(xiàn)嚴重的癥狀[4-6]。感染李斯特氏菌的嬰幼兒會患上腦膜炎、敗血癥等，被感染的孕婦則會出現(xiàn)流產(chǎn)或死胎的癥狀[7]。調(diào)查顯示，我國各地均存在程度不同的單核細胞增生李斯特氏菌污染食品的情況[8-13]。

傳統(tǒng)檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法過程繁瑣、檢驗時間長，對于一些菌含量較少的樣品不易檢出，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[14]。免疫學的檢測方法比較繁瑣，而且抗體的獲取需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作[15]。隨著分子生物學和基因組學的不斷發(fā)展，各種分子生物學檢測方法逐漸建立起來，主要是以變溫核酸擴增技術(shù)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[16]、實時PCR（real-time PCR）[17]為代表的定性和定量檢測方法，需要較昂貴的溫度循環(huán)控制設(shè)備PCR儀和特別昂貴的real-time PCR儀，限制了其在基層檢測機構(gòu)中的推廣和應用。此外，還存在因擴增效率不高導致的靈敏度較低等問題。為了解決這些問題，人們發(fā)明了無需昂貴的擴增儀器、擴增效率較高的核酸等溫擴增技術(shù)。Lizardi等[18]建立了滾環(huán)擴增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）檢測人類基因組DNA中的點突變，并得到了一定的應用[19-20]。近年來，RCA技術(shù)在食品病原菌的檢測中得到了一定發(fā)展[21]，但RCA要求模板為環(huán)狀DNA，若擴增線性DNA，需要鎖式探針和連接酶，操作步驟繁瑣、反應時間長、成本很高，因此限制了RCA技術(shù)的推廣。

本實驗發(fā)現(xiàn)BstDNA聚合酶擴增DNA的一種新特性，該酶在一對引物的作用下，通過添加堿基的方式跨越靶序列兩端的缺口，形成非閉合環(huán)狀DNA，并進行開環(huán)式的滾環(huán)擴增，完成對線性DNA的擴增，以此為基礎(chǔ)，與熒光染料相結(jié)合，采用可視化跨越式滾環(huán)等溫擴增（saltatory rolling circle amplification，SRCA）技術(shù)。SRCA擴增原理如圖1所示，預變性后雙鏈DNA變成單鏈DNA，由于單鏈DNA自身結(jié)構(gòu)形成非閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在60～65 ℃，正向引物（forward primer，F(xiàn)WP）結(jié)合到模板上互補的位置。然后，F(xiàn)WP在BstDNA聚合酶的作用下進行擴增（步驟（4））。當FWP沿模板的3’末端擴增到5’末端，在BstDNA聚合酶的作用下不依賴模板添加一個或多個堿基跨過缺口[22]，同時置換先前合成的DNA鏈（步驟（5）、（6））。隨著單鏈DNA延伸，反向引物（reverse primer，RVP）的多個結(jié)合位點暴露，RVP結(jié)合到目標單鏈DNA上在BstDNA聚合酶的作用下繼續(xù)擴增（步驟（7）、（8））。之前的擴增產(chǎn)物被不斷置換下來（步驟（9））。FWP與相應的互補區(qū)域結(jié)合并進行鏈的延伸，周而復始，最終形成由大量不同長度的線性雙鏈DNA組成的產(chǎn)物（步驟（10）、（11））。

圖1 SRCA反應原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the SRCA assay

SRCA只需要利用一對引物即可實現(xiàn)線狀DNA的擴增，不需要鎖式探針和連接酶，而是利用線狀模板的自身結(jié)構(gòu)與BstDNA聚合酶的特性進行反應。與RCA相比，SRCA操作大大簡化，成本降低約90%，耗時縮短3 h以上，突破了滾環(huán)擴增技術(shù)應用的瓶頸。

本研究以hlyA基因為靶基因，通過大量實驗篩選出了一對適宜的引物，建立一種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的新型滾環(huán)擴增方法，即可視化SRCA，并對此方法進行評價，旨在為開發(fā)單核細胞增生李斯特氏菌SRCA檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，為食品中致病菌的快速檢測提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株如表1所示。

表1 本研究所用菌種Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 試劑

細菌DNA提取試劑盒、BstDNA聚合酶（Large fragment）、SYBR Green I熒光染料、DraI限制性核酸內(nèi)切酶 大連寶生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、Easypure?Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、基因克隆T3載體試劑盒、100 bp DNA Ladder、dNTPs 北京全式金生物技術(shù)有限公司；1%鹽酸吖啶黃溶液、1%萘啶酮酸鈉鹽溶液、單核細胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒、異丙醇、無水乙醇 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2720 Thermal cycler核酸擴增儀 美國Applied Biosystems公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；BILON-08無菌均質(zhì)器 西安比朗生物科技有限公司；BINDA 2020D凝膠成像儀 北京賓達英創(chuàng)有限公司；NanoDrop 2000分光光度計 美國Thermo Scientific公司；BSC-1500IIB2-X生物安全柜 鑫貝西Biobase公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

hlyA基因的序列具有高度保守性[23]，本研究選取hlyA基因為單核細胞增生李斯特氏菌的靶基因，根據(jù)GenBank公布的hlyA基因序列進行BLAST同源性分析，利用DNAMAMN和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由北京華大公司合成引物，具體引物序列如表2所示。

表2 單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因的引物Table 2 Primers used for amplification of hlyA gene in L. monocytogenes

1.3.2 細菌的培養(yǎng)與DNA提取

將保存的各菌株（表1）接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，挑取單菌落接種到營養(yǎng)肉湯中37 ℃過夜培養(yǎng)，備用。

培養(yǎng)菌液采用試劑盒法提取基因組DNA。通過Nanodrop 2000分光光度計測定基因組濃度。

1.3.3 SRCA和PCR體系

優(yōu)化建立最佳的SRCA擴增體系：5 μL dNTPs（4 種均為2.5 mmol/L），2.5 μL Mg2+（20 mmol/L），2 μL 10×ThermoPol buffer，1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL模板DNA（陰性對照不添加模板），1 μLBstDNA聚合酶（320 U/mL），無菌去離子水補足體系至20 μL。94 ℃預變性3 min，冰浴2 min；然后62 ℃反應60 min；最后80 ℃反應5 min，反應停止。

為評估SRCA方法的靈敏度和檢出限，本研究同時應用了PCR方法。其反應體系（25 μL）如下：2×EasyTaqPCR Super Mix 11.0 μL，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，剩余體積由無菌去離子水補足。反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s（變性-退火-延伸，25 個循環(huán)），72 ℃再延伸45 s終止。

1.3.4 SRCA產(chǎn)物可視化分析

向SRCA擴增產(chǎn)物中加入1 μL熒光染料SYBR Green I，直接肉眼觀察顏色變化，進行可視化分析。

1.3.5 SRCA擴增產(chǎn)物測序分析和酶切分析

選取典型的梯形條帶，自最小片段起依次切取4 個條帶進行膠回收，反應產(chǎn)物純化測序。為進一步驗證SRCA產(chǎn)物是否為目的條帶，本實驗采用DraI限制性內(nèi)切酶對產(chǎn)物進行酶切驗證，在37 ℃反應2.5 h。反應完成后進行凝膠電泳，以觀察酶切結(jié)果。

1.3.6 SRCA引物特異性分析

為驗證本研究中引物在SRCA反應中的特異性，共對52 株菌株進行分析，其中包括2 株單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株，10 株單核細胞增生李斯特氏菌株（實驗室分離菌株）及40 株非單核細胞增生李斯特氏菌菌株（表1），并通過熒光可視法進行結(jié)果分析。

1.3.7 SRCA靈敏度分析

為評估SRCA檢測純菌DNA的靈敏度，取上述過夜培養(yǎng)的純菌液1 mL提取模板DNA，并用無菌去離子水進行10 倍梯度稀釋，進行擴增后，通過熒光可視法進行分析，確定SRCA反應的靈敏度。同時以PCR檢測方法為對照，PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，確定PCR的靈敏度。

純菌液經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計測定質(zhì)量濃度為8.9×107fg/μL。

1.3.8 SRCA人工污染涼拌菜中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限分析

稱取經(jīng)驗證未受到單核細胞增生李斯特氏菌污染的涼菜25 g，加入單核細胞增生李斯特氏菌LB1增菌液中均質(zhì)，取過夜培養(yǎng)的單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株（CMCC 54001）的純菌液1 mL，加入含有9 mL均質(zhì)液的試管中，吹吸混勻，然后進行10 倍梯度的連續(xù)稀釋。每個稀釋度菌懸液均取1 mL，提取基因組DNA，SRCA方法擴增，通過熒光可視化法確定SRCA方法的檢出限。

以PCR方法為對照，通過凝膠電泳法確定PCR方法的檢出限。

與此同時，另取1 mL上述純菌液，用0.85%的生理鹽水進行10 倍梯度的連續(xù)稀釋，每個稀釋度各取1 mL加入李斯特氏菌顯色平板，36 ℃培養(yǎng)48 h，記錄單核細胞增生李斯特氏菌陽性菌落數(shù)。根據(jù)平板計數(shù)法獲得人工污染的涼拌菜中單核細胞增生李斯特氏菌濃度范圍2.8×108～2.8×10-1CFU/mL。

1.3.9 SRCA方法的實際應用與評估

為檢驗SRCA方法對實際樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出情況，在當?shù)馗鞔蟪屑笆袌鲭S機購買70 份易被單核細胞增生李斯特氏菌污染的樣品，包括成品果蔬22 種、生食果蔬23 種、豆制品6 種、熟肉制品13 種、其他類型6 種，利用GB 4789.30—2016《食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[24]、PCR及SRCA 3 種方法對以上樣品進行檢測。

以GB 4789.30—2016檢測結(jié)果為基準，采用敏感性、特異性及符合率3 個指標對SRCA方法進行評價。計算公式[25-28]如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光可視化法觀察SRCA擴增產(chǎn)物

SRCA反應結(jié)束后，向反應管中加入1 μL的熒光染料SYBR Green I，結(jié)果如圖2所示。添加了單核細胞增生李斯特氏菌的陽性反應管1顏色由橙色變?yōu)榫G色，而陰性對照2仍為橙色。

圖2 SRCA熒光可視化結(jié)果Fig. 2 Visual results of the SRCA products

2.2 SRCA擴增產(chǎn)物測序和酶切結(jié)果分析

如圖3A所示，SRCA擴增產(chǎn)物經(jīng)過DraI限制性內(nèi)切酶切消化后，其酶切片段為109 bp左右，與理論計算值一致。為了進一步驗證SRCA產(chǎn)物，對圖3A中的擴增產(chǎn)物電泳條帶（1～4）進行測序分析。測序結(jié)果如圖3B所示，發(fā)現(xiàn)SRCA的反應產(chǎn)物含有多個重復的特異性靶序列，且隨著靶序列拷貝數(shù)目增加，產(chǎn)物片段長度隨之增加。利用兩條具有特異性的引物，通過SRCA反應可以特異性的擴增目的片段，因此，可以驗證本研究中建立的SRCA方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌原理的正確性。

圖3 單核細胞增生李斯特氏菌SRCA反應的酶切和測序結(jié)果分析Fig. 3 Enzymatic digestion and sequencing analysis of the SRCA products of L. monocytogenes

2.3 SRCA方法的特異性

本研究針對52 株菌株進行特異性分析，檢測結(jié)果如圖4所示。其中，12 株單核細胞增生李斯特氏菌發(fā)生了SRCA反應，而其他40 株非單核細胞增生李斯特氏菌均未發(fā)生SRCA反應。說明該引物具有良好的特異性。SRCA檢測方法的特異性取決于引物的設(shè)計和篩選，需要從設(shè)計出的大量引物中通過大量實驗篩選出一對合適的引物，這也是本研究的難點。

圖4 SRCA特異性分析Fig. 4 Specificity of SRCA evaluated by fluorescence staining

2.4 單核細胞增生李斯特氏菌純培養(yǎng)的靈敏度

以1.3.7節(jié)中提取的基因組DNA作為模板進行SRCA反應，向得到的反應產(chǎn)物中添加1 μL熒光染料SYBR Green I。如圖5A所示，在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107～8.9×100fg/μL時，反應管中出現(xiàn)綠色，質(zhì)量濃度小于8.9×100fg/μL時仍然為橙色，因此，SRCA熒光可視法基因組靈敏度為8.9×100fg/μL。

用相同的模板進行PCR，得到的反應產(chǎn)物進行凝膠電泳。如圖5B所示，在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107～8.9×103fg/μL時，出現(xiàn)了陽性擴增條帶，因此，PCR方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌基因組的靈敏度為8.9×103fg/μL。

圖5 SRCA方法（A）和PCR方法（B）檢測的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of SRCA (A) and PCR (B)

由此可知，SRCA方法檢測的靈敏度是PCR方法檢測靈敏度的1 000 倍。

2.5 人工污染涼拌菜單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限

利用SRCA和PCR方法對單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株污染的涼拌菜進行檢測，結(jié)果如圖6所示。圖6A反映了SRCA方法的檢測結(jié)果，當人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108～2.8×100CFU/g時，反應管中出現(xiàn)綠色，當濃度為2.8×10-1CFU/g時反應管中的顏色依然為橙色。因此，SRCA熒光可視法檢出限為2.8×100CFU/g。

圖6 SRCA（A）和PCR（B）方法檢出限Fig. 6 Detection limits of SRCA (A) and PCR (B)

圖6B反映了PCR方法檢測的結(jié)果，當人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108～2.8×103CFU/g時，出現(xiàn)了陽性擴增條帶，菌濃度小于2.8×103CFU/g時未出現(xiàn)擴增條帶，因此，PCR方法檢測人工污染涼拌菜中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限為2.8×103CFU/g。

由此可知，SRCA方法的檢出限是傳統(tǒng)PCR方法檢出限的1/1 000。

2.6 實際樣品的檢測與SRCA方法的評估

利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三種方法對70 份食品進行檢測，結(jié)果見表3。SRCA和PCR方法均會出現(xiàn)假陽性，主要原因在于檢測過程中無法區(qū)別死菌和活菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能檢測出死菌和不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌株（viable but non-culturable，VBNC），而其DNA在SRCA和PCR方法中卻可擴增，即通過SRCA和PCR方法可以檢測到死菌及VBNC狀態(tài)的單核細胞增生李斯特氏菌。除此之外，由于SRCA方法檢測的靈敏度更高，因此出現(xiàn)的假陽性數(shù)量比PCR方法多。

表3 SRCA方法評價Table 3 Evaluation of the SRCA method

3 結(jié) 論

本研究篩選出了一對適宜的引物，成功建立了SRCA快速檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌的方法，并通過肉眼觀察熒光判斷結(jié)果，方便簡單。利用SRCA技術(shù)對12 株單核細胞增生李斯特氏菌和40 株非單核細胞增生李斯特氏菌進行特異性檢測，其中12 株單核細胞增生李斯特氏菌顯示為陽性，其他均顯示陰性結(jié)果，證明該方法具有較好的特異性。SRCA技術(shù)檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度為8.9×100fg/μL，是傳統(tǒng)PCR方法的1 000 倍，人工污染涼拌菜樣品中的單核細胞增生李斯特氏菌檢出限為2.8×100CFU/g，是傳統(tǒng)PCR方法的1/1 000，因此SRCA技術(shù)具有更高的靈敏度和更低的檢出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法對70 種實際樣品進行單核細胞增生李斯特氏菌的檢測，并以GB 4789.30—2016法為標準對SRCA方法進行評估，其敏感性為100%，特異性為97.01%，符合率為97.14%。

本研究建立的SRCA方法用于檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測切實可行，SRCA方法具有操作簡便、節(jié)省時間、成本低廉、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。說明SRCA方法非常適合在中小型企業(yè)和基層檢測機構(gòu)以及現(xiàn)場快速檢測中推廣應用。在后期的研究中，SRCA方法可與疊氮溴化丙錠[29]、疊氮溴化乙錠等結(jié)合，區(qū)分死活菌，進一步實現(xiàn)結(jié)果判斷的準確性。開發(fā)單核細胞增生李斯特氏菌SRCA檢測試劑盒，大力推廣該技術(shù)。