冷鮮雞肉中莓實假單胞菌NMC25的全基因組測序及分析

王光宇，邱偉芬，徐幸蓮，周光宏

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

肉品腐敗變質導致了全世界范圍大量的食品浪費，了解肉品中常見腐敗微生物并探明其致腐機制是有效控制肉品腐敗的前提[1]。假單胞菌（Pseudomonasspp.）能夠導致有氧儲藏條件下肉類的腐敗，主要表現在使肉品組織軟化、產黏和產生異味[2-4]。其中莓實假單胞菌（P. fragi）是肉品中最常見的假單胞菌，尤其是有氧儲藏條件下的冷鮮肉[1]。從屠宰場一直到市場的冷鏈環(huán)境中，該菌均能大量生長并且分泌多種胞外酶[5-7]。目前已有大量文獻報道莓實假單胞菌是有氧條件下冷鮮牛肉[8-9]、禽肉[10-11]和海產品[12]中的優(yōu)勢腐敗菌，且隨著時間的推移，莓實假單胞菌的優(yōu)勢地位更加明顯[13-14]。

在本團隊前期研究中，將從屠宰場與超市采集的黃羽肉雞樣品在冷藏條件下存放至腐敗，從腐敗樣品中分離到1 株莓實假單胞菌NMC25，與實驗組的其他腐敗菌相比，該分離株在體外具有較強的蛋白酶活性，進行原位培養(yǎng)時生長速度較快，肉的揮發(fā)性鹽基氮值和pH值變化最為顯著，并伴有異味和產黏[15]。該分離株對冷鮮肉表現出較強的致腐能力，有必要針對其致腐機制進行深入研究。

肉品的腐敗通常與腐敗菌的酶功能或代謝活動相關，而這些腐敗菌在代謝活動中的一系列表型變化又受到它們體內諸多功能基因的操控。因此，首先需要掌握腐敗菌基因組的組成和功能信息，進而明確這些基因在特定條件下的變化規(guī)律，才能深入了解這種腐敗菌的致腐機制。然而在本研究之前，莓實假單胞菌的全基因組完成圖序列僅公布了1 株極地環(huán)境下的分離株[16]，該環(huán)境分離株可能在基因組結構組成和代謝活性等方面與肉源性強致腐莓實假單胞菌分離株存在很大不同，不利于進一步深入研究莓實假單胞菌在肉品腐敗中的作用。

因此，本研究通過對冷鮮雞肉中分離到的強致腐莓實假單胞菌NMC25進行全基因組測序，獲得其基因組的組成和功能信息，同時與其他常見假單胞菌進行初步比較基因組分析，旨在深入了解莓實假單胞菌的基因功能與代謝特征，為明確其致腐機制、開發(fā)針對性保鮮技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株莓實假單胞菌NMC25分離自腐敗的冷鮮雞肉；細菌基因組DNA提取試劑盒DP302 天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

B1-150A生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設備（上海）有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；BCM-1600A超凈工作臺 蘇州安泰AIRTECH公司；J2-MI高速冷凍離心機 美國Beckmen公司；Nano Drop 2000蛋白核酸微量定量儀 美國Thermo Scienific公司；DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)條件

將凍存于-80 ℃的莓實假單胞菌NMC25菌株在TSA平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑單菌落接種于TSB中進行第2次活化。取二次活化的菌液再次接種到TSB中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數末期菌液備用。

1.3.2 細菌基因組提取

采用天根細菌基因組提取試劑盒，將培養(yǎng)至對數末期的菌液10 000×g離心1 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2 次，收集菌體沉淀。向其中加入200 μL緩沖液GA重懸菌體，再加入220 μL緩沖液GB振蕩15 s，70 ℃放置10 min后加入220 μL無水乙醇振蕩15 s。將所得溶液和絮狀沉淀加到吸附柱CB3中，13 400×g離心30 s棄去收集管中廢液，加入500 μL緩沖液GD，相同條件離心后使用600 μL漂洗液PW漂洗2 次，棄去廢液后將吸附柱置于室溫晾干殘余漂洗液。將吸附柱轉入干凈的離心管中，最后向吸附膜的中間部位懸空滴加200 μL Tris-EDTA洗脫緩沖液，室溫放置5 min后13 400×g離心2 min，將細菌基因組收集在離心管中。

1.3.3 細菌全基因組測序及基因功能注釋

提取好的細菌基因組使用NanoDrop 2000檢測純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測有無降解，使用Qubit熒光光度計檢測濃度與總量。DNA樣品檢測合格后采用三代測序PacBio RS II并對測序結果進行拼接組裝為1 條contig，0 個gap。基因組的完成圖測序在廣州基迪奧生物科技有限公司完成。測序完成后對測序產生的原始reads進行評估，再通過過濾去掉長度小于100的reads，去掉平均質量值小于0.80的reads得到高質量的reads，然后進行基因組的組裝和注釋。使用glimmer軟件對基因組進行基因預測，獲得基因組詳細的基因分布和結構信息，隨后整合多個數據庫, 如Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）[17]、Gene Ontology（GO）[18]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）[19]和Carbohydrate-Active Enzymes（CAZy）[20]等，通過序列比對進行預測基因的功能注釋。

1.3.4 基因組共線性分析和進化分析

選擇NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已公布的幾種不同的假單胞菌，基于序列信息與NMC25進行BLAST比對，參數E值設置為10-5，比對時查詢序列長度超過1 000 bp，序列一致性超過80%則認為核苷酸序列同源。選擇菌株包括銅綠假單胞菌PAO1（P. aeruginosaPAO1，NCBI登錄號NC_002516.2）、惡臭假單胞菌KT2440（P. putidaKT2440，NCBI登錄號NC_002947.4）、熒光假單胞菌F113（P. fluorescensF113，NCBI登錄號NC_016830.1）、莓實假單胞菌P121（來源于極地環(huán)境，NCBI登錄號NZ_CP013861.1）和莓實假單胞菌NRRLB-727（來源未知，NCBI登錄號NZ_LT629783.1）。使用SVG將結果圖形化展示，利用MEGA 6通過鄰接法構建進化樹。

最后將測得的NMC25基因組序列上傳至NCBI，獲得GenBank登錄號。

2 結果與分析

2.1 基因組特征分析

莓實假單胞菌NMC25基因組完成圖信息公布在GenBank中，登錄號為NZ_CP021132.1。 NMC25基因組組裝為4 個Scaffold，包含1 個染色體和3 個質粒，測得的總基因組大小為5.152 13 Mb，GC含量為59.21%。菌株基因組中包含4 725 個基因（染色體4 571 個，質粒154 個），編碼區(qū)基因4 494 個（染色體4 366 個，質粒128 個），結構RNA 97 個（rRNA 25 個，tRNA 72 個）。

2.2 基因組功能注釋

2.2.1 COG注釋分析

COG是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫，將測定的序列與數據庫進行比對預測這些蛋白可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計。由圖1可知，在基因組的直系蛋白聚類分析中，除R（一般功能預測）蛋白之外，數量最多的是E（氨基酸轉運與代謝）相關蛋白，數量超過了500 個；其次是T（信號轉導機制）、P（無機離子轉運與代謝）和K（轉錄相關蛋白），數量均超過了400 個；與氨基酸相比，碳水化合物和脂質轉運代謝相關蛋白數量較少，均不超過200 個。

圖1 莓實假單胞菌NMC25基因組的COG功能分類Fig. 1 COG function classification of P. fragi NMC25 genome

2.2.2 GO注釋分析

使用BLAST2 GO軟件得到NMC25 基因組的GO功能注釋結果，選取基因數量最多的10 個GO功能分類見表1。GO總共有3 個大類，分別描述基因參與的生物學過程、分子功能和細胞成分。在生物學過程分類中，參與代謝過程的基因數量最多，為1 921 個；在細胞成分分類中，與膜相關的基因數量最多，為679 個；在分子功能分類中則是催化活性基因數量最多，為1 899 個。整體來看，能夠參與細菌代謝過程和催化反應的基因數量最多。

表1 莓實假單胞菌NMC25基因組的GO功能分類Table 1 GO terms of P. fragi NMC25 genome

2.2.3 KEGG注釋分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因產物在細胞中代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫，利用KEGG 可以進一步研究基因在生物學上的復雜行為。在NMC25基因組中共有1 474 個基因注釋到了KEGG通路中，從中選取數量最多的10 個通路展示，如表2所示。其中，富集到ABC轉運蛋白、雙組分系統(tǒng)、氨基酸合成和碳代謝通路的基因數量最多，分別為183、171、127 個和111 個。ABC轉運蛋白廣泛存在于微生物體內，在離子、單糖、氨基酸、磷脂、肽、多糖及蛋白質等營養(yǎng)攝取的過程中扮演了重要的角色[21]；而雙組分系統(tǒng)可以調控氨基酸代謝和介導假單胞菌對外界環(huán)境的應激響應[22]。此外，參與鞭毛組裝、細菌分泌系統(tǒng)和氧化磷酸化相關通路的基因數量也較多。

表2 莓實假單胞菌NMC25基因組的KEGG注釋Table 2 KEGG pathways of P. fragi NMC25 genome

2.2.4 CAZy注釋分析

CAZy數據庫包括能催化碳水化合物降解、修飾以及生物合成的碳水化合物相關酶系家族。注釋結果顯示，在NMC25基因組中包含大量糖基轉移酶和糖苷水解酶，分別為1 528 個和1 324 個（圖2）。糖基轉移酶能夠催化活化的糖連接到不同受體分子上，例如參與細菌胞外多糖的生物合成[23]；糖苷水解酶作為糖類代謝的關鍵組分，能夠催化各種糖基化合物中糖苷鍵的水解。除此之外，糖基轉移酶和糖苷酶還與受體分子的糖基化有關[24]。而糖基化在膜蛋白介導的細胞保護、穩(wěn)定及屏障等方面起到重要作用，有助于NMC25應對外界的環(huán)境應激。

圖2 莓實假單胞菌NMC25基因組的CAZy分類Fig. 2 CAZy classification of P. fragi NMC25 genome

2.3 共線性分析

一般來說，如果兩個物種之間的親緣關系很近，那么基因的序列和順序都會非常接近，這種現象稱為共線性現象[25]。共線性主要反映基因組間的結構性變異，反映出基因組之間的編碼順序和結構的同源性。從圖3可以看出，NMC25菌株與KT2440、F113和PAO1相比，基因組更小且存在共線性的序列比例均小于50%；對于另外兩株莓實假單胞菌，雖然在基因組內部存在顛換現象，3 株莓實假單胞菌的基因組更為相似，其中NMC25菌株與NRRL B-727菌株有共線性的序列達到了90%以上，但與P121菌株的共線性不足70%。

圖3 莓實假單胞菌NMC25與惡臭假單胞菌KT2440（a）、熒光假單胞菌F113（b）、銅綠假單胞菌PAO1（c）、莓實假單胞菌NRRL B-727（d）和莓實假單胞菌P121（e）基因組共線性分析Fig. 3 Synteny analysis of genomes between P. putida KT2440 (a),P. fluorescens F113 (b), P. aeruginosa PAO1 (c), P. fragi NRRL B-727 (d),P. fragi P121 (e) and P. fragi NMC25

2.4 進化分析

使用不同菌株之間的單拷貝同源基因繪制進化樹。從圖4可以看出，NMC25與NRRL B-727菌株的進化關系最近，其次是P121。而在其他3 種假單胞菌中，與F113的進化關系最近，與PAO1最遠。同時驗證各分支的可信度百分比，發(fā)現銅綠假單胞菌PAO1與其他5 株假單胞菌差異較大。對6 株假單胞菌的進化分析結果與共線性分析的結果一致。

圖4 不同假單胞菌的進化分析Fig. 4 Phylogenetic trees of different Pseudomonas species

3 討論與結論

假單胞菌屬內有多個種，廣泛存在于土壤、水及各種植物體中。其屬內菌種表現出了豐富的代謝多樣性和廣泛的定殖環(huán)境[26]。目前對冷鮮肉腐敗菌的研究已逐漸深入到基因水平，本團隊在前期利用宏基因組測序測定了托盤包裝下冷鮮雞肉的菌落組成多樣性，發(fā)現其中豐度最高的是莓實假單胞菌，其次是熒光假單胞菌[27]。然而假單胞菌屬中不同種、不同分離株之間的腐敗能力會存在較大差異。莓實假單胞菌的優(yōu)勢腐敗菌地位與其基因組結構組成密切相關，要對其致腐過程有深入了解需要全面明確其基因組信息。但由于目前已公布基因組完成圖的莓實假單胞菌僅有1 株，且菌株來源為極地環(huán)境，不一定能準確反映具有強致腐能力的肉源性莓實假單胞菌分離株的基因組特征，因此對分離到的肉源性強致腐菌株NMC25進行了全基因組完成圖測序。隨后為探究造成這些菌株腐敗能力差異的原因，選擇已公布序列的銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌代表菌株以及另外兩株莓實假單胞菌分離株進行了初步的比較基因組的分析。

由微生物引起的腐敗現象主要包括變色、異味和產黏，這些腐敗特征主要取決于微生物對肉中各種基質的利用情況。全基因組測序結果發(fā)現NMC25基因組中有大量氨基酸轉運代謝相關基因，表明該菌可能較多地參與氨基酸轉運代謝，因此肉類等高蛋白食品可作為其適宜的生長基質。研究表明，肉中的優(yōu)勢腐敗菌可產生揮發(fā)性化合物導致異味的出現[28]。在細菌代謝產生的揮發(fā)性化合物中，醇類[29]、醛類[30]和硫化物[31]等物質均與氨基酸代謝有關。在基因組的GO基因功能分類中發(fā)現有大量代謝和催化反應相關的基因，推測NMC25的代謝活性可能比較旺盛，在合適的基質上生長時會進行活躍生長和代謝。KEGG分析結果表明NMC25中的基因富集到了ABC轉運蛋白、雙組分系統(tǒng)、鞭毛組裝、細菌分泌系統(tǒng)和氧化磷酸化相關通路，這有助于NMC25在肉品這一富含蛋白質的環(huán)境中生長，接觸到介質表面時會快速黏附和擴散，同時在分子跨膜轉運、感受外界環(huán)境變化時做出應激響應、分泌代謝產物和產生能量等方面有較大優(yōu)勢。除此之外，NMC25基因組中包含大量糖基轉移酶和糖苷水解酶。有研究表明，當肉品中假單胞菌數量較少時，初級代謝的主要能量來源是葡萄糖[28]，此時NMC25可快速充分利用葡萄糖進行代謝和生物合成；隨著葡萄糖逐漸被利用，細菌數量迅速增加，開始產生各種胞外酶利用蛋白質等其他底物，產生氨、胺、硫化氫等物質導致肉的腐敗[3]。莓實假單胞菌NMC25基因組中包含的這些功能基因使其具備在冷鮮肉上快速代謝和擴散的能力，最終導致冷鮮肉腐敗。

在比較基因組分析中，莓實假單胞菌與其他3 種假單胞菌的共線性較低。一般來說，如果2 個物種之間的親緣關系很近，那么基因的序列和順序都會非常接近。結合進化分析結果，可以表明莓實假單胞菌與假單胞菌屬的其他3 種假單胞菌尤其是銅綠假單胞菌PAO1的基因組差別較大、進化關系較遠。此外，肉源性分離株NMC25與極地環(huán)境來源分離株P121基因組差別較大，說明生長環(huán)境不同，莓實假單胞菌的基因組組成結構確實存在差異，有必要對NMC25分離株的基因組進行測序。而NRRL B-727菌株基因組與NMC25共線性程度非常高，只是存在顛倒、易位等基因重組事件，因此推測這兩株菌在進化過程中起源可能是一致的，NRRL B-727可能也具有較強的致腐能力。

綜合上述結果，莓實假單胞菌NMC25分離株作為1 株具有較強致腐能力的菌株，其基因組中也包含大量可能導致食品尤其是肉品腐敗的功能基因與代謝通路。本研究從基因水平上證明了該分離株具有較強的致腐潛力，對后續(xù)研究深入挖掘莓實假單胞菌的代謝特征，明確其致腐機制具有重要的意義。