高效陰離子交換色譜-脈沖積分安培法檢測(cè)海帶中的單糖、雙糖和糖醛酸

尹大芳，孫曉杰，郭瑩瑩，李 娜，田 雨，王聯(lián)珠,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

海洋資源豐富，海洋生物含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相對(duì)于陸生資源具有更高的營(yíng)養(yǎng)以及更高的開發(fā)價(jià)值[1]，海藻的加工以及高值化利用成為海洋資源綜合利用的重要領(lǐng)域[2]。海帶含有海帶多糖、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素等多種生物活性成分，具有利水消腫和御寒等功效。海帶多糖在降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]和神經(jīng)保護(hù)[6]等方面具有重要的生物學(xué)活性。但由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其生物活性機(jī)制研究仍然是一個(gè)難題。單糖組成和含量對(duì)生理活性有極大影響[7-8]，是多糖基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的研究環(huán)節(jié)[9]。單糖是一種多羥基醛酮化合物，極性強(qiáng)，無發(fā)色官能團(tuán)和熒光官能團(tuán)，結(jié)構(gòu)相似，存在同分異構(gòu)體，對(duì)分離條件的要求較高。

常用的單糖定性定量方法有高效液相色譜法[10-14]、氣相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳法[16-18]和高效陰離子交換色譜法[19-21]等。高效液相色譜聯(lián)合示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器無需衍生，操作簡(jiǎn)便，但選擇性和靈敏度差[10-12]。由于單糖沒有發(fā)色基團(tuán)、熒光基團(tuán)以及沒有揮發(fā)性，采用紫外、熒光檢測(cè)器以及氣相色譜檢測(cè)時(shí)，常需要進(jìn)行柱前柱后衍生化[14-15]。衍生化過程費(fèi)時(shí)繁瑣，常伴隨衍生過程不徹底或生成多種衍生物，阻礙了糖類檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[15,22-24]。毛細(xì)管電泳法靈敏度低和重復(fù)性差的特點(diǎn)極大限制其應(yīng)用[17-18,20]。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法是一種強(qiáng)有力的分析糖類化合物的檢測(cè)技術(shù)。以電化學(xué)檢測(cè)器作為檢測(cè)器，高選擇性的陰離子交換柱作為固定相，選擇最新優(yōu)化的四電位檢測(cè)波形，負(fù)電位清洗電極，正電位氧化并激活電極，可有效降低電極的損耗，延長(zhǎng)電極壽命以及增加實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性[25]；羥基的氧化電位較低（0.1 V），所以基體干擾少，方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性高[26]。NaOH溶液作為淋洗液，改變NaOH濃度，可影響溶液中分子形成氫鍵的能力，導(dǎo)致其與固定相結(jié)合能力的差異實(shí)現(xiàn)糖類分離。電化學(xué)檢測(cè)器與梯度淋洗液的相容性，結(jié)合陰離子交換固定相的高選擇性，可根據(jù)糖分子結(jié)構(gòu)間的細(xì)微差別，幾乎可達(dá)到所有類別的醛糖醇的分離，檢出限低至10-12～10-15mol[25]。該方法具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度高和重復(fù)性好的特點(diǎn)。HPAECPAD已應(yīng)用于各種常規(guī)監(jiān)測(cè)和研究領(lǐng)域，包括牛奶[27]、谷類[28]、中草藥[21]、玉米淀粉[29]以及細(xì)胞培養(yǎng)[9]等各種材料中單糖、雙糖、寡糖的檢測(cè)等，但水產(chǎn)品中糖類種類較為復(fù)雜，應(yīng)用較少。此外，針對(duì)水產(chǎn)品的中性糖和糖醛酸同時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用較少。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，聯(lián)合脈沖安培檢測(cè)器，以CarboPac PA10（250 mm×4 mm）作為糖分析柱，考察淋洗液濃度、色譜柱柱溫和淋洗液流速對(duì)各組分分離的影響。采用梯度洗脫對(duì)常見的11 種糖類化合物進(jìn)行分離定量，建立同時(shí)定性定量分析11 種糖類化合物的方法，利用該方法對(duì)海帶多糖水解后單糖組分進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品分別采購(gòu)自山東威海、遼寧大連、福建霞浦海域；11 種糖類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、葡萄糖（glucose，Glc）、氨基半乳糖（galactosamine，GalN）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、半乳糖（galactose，Gal）、甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)ruc）、核糖（ribose，Rib）、乳糖（lactose，Lac）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal UA）和葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc UA）（純度均不小于98%），50%氫氧化鈉（色譜純）、乙酸鈉（分析純） 美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm的超純水；無水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸均屬國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)、CarboPac PA10糖分析柱（250 mm×4 mm）、CarboPac PA10糖保護(hù)柱（50 mm×4 mm） 美國(guó)戴安公司；FDU-2110高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Heidolph公司；DFY-300型搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；ZRD-A7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智試分析儀器公司；Milli-Q超純水設(shè)備 美國(guó)Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和淋洗液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用超純水將各糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液均配制成1 mg/mL的母液。取適量母液配制成一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

200 mmol/L NaOH淋洗液：取50% NaOH溶液10.4 mL，用超純水定容至1 L。

500 mmol/L NaAc淋洗液：稱取NaAc固體20.5 g，用超純水溶解并定容至500 mL；淋洗液配制完成后立即通氮?dú)鈸u勻備用。

1.3.2 樣品前處理

多糖提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[30]的方法。洗凈海帶表面泥沙等雜質(zhì)，在50 ℃烘箱中烘干，打碎成海帶粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.0 g海帶粉加入10 倍的無水乙醇靜置12 h，取沉淀于50 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量；加入30 倍超純水，利用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)處理30 min，置于60 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min，離心取上清液，于60 ℃旋蒸至原體積的1/4，加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)80%，4 ℃過夜，離心，取沉淀復(fù)溶于水，利用Sevag法（正丁醇-氯仿，1∶5，V/V）除蛋白后，用2 mol/L三氟乙酸溶液于120 ℃恒溫干燥箱中水解2 h；水解完成后NaOH中和水解液，離心，去沉淀，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于進(jìn)樣分析。

1.3.3 色譜條件

采用CarboPac PA10（250 mm×4 mm）作為糖分析柱，CarboPac PA10（50 mm×4 mm）作為糖保護(hù)柱，脈沖安培檢測(cè)器，糖標(biāo)準(zhǔn)四電位（表1）作為檢測(cè)波形，水-NaOH-NaAc組成三元淋洗液，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為25 μL。淋洗液系統(tǒng)最終優(yōu)化洗脫程序見表2。梯度洗脫程序可分為單雙糖的分離、糖醛酸的分離、基質(zhì)的消除、賦予色譜系統(tǒng)強(qiáng)pH值、色譜柱的平衡5 個(gè)階段。利用保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法（峰面積）進(jìn)行定量計(jì)算。圖1為質(zhì)量濃度10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖1 11 種糖類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 1 Chromatogram of mixed solution of 11 sugar standards

表1 糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形Table 1 Quadruple-potential waveform for carbohydrate detection

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 淋洗液優(yōu)化

糖類具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)于一些差向異構(gòu)體的單糖（如Glc與Gal、Man）pKa相近，易形成共洗脫，較難分離[31]。通過淋洗液的濃度改變淋洗液的pH值，從而改變糖類化合物的質(zhì)子解離程度，達(dá)到有效的分離。糖類在色譜柱上保留性質(zhì)與糖類的pKa值具有重要的相關(guān)性，表3為部分糖類化合物的pKa值。相同的堿性環(huán)境中，pKa值越大，其酸性越弱，糖類解離度越差，與固定相結(jié)合能力越弱，越容易洗脫；糖類在陰離子交換分離柱的洗脫順序依次為單糖、雙糖、糖醛酸。糖醛酸是糖的衍生產(chǎn)物，比相應(yīng)的單糖多了羧酸基團(tuán)，酸性較強(qiáng)，在陰離子交換柱上的保留性強(qiáng)。

表3 部分糖類化合物的pKa值（水中，25 ℃）Table 3 pKa value of some sugars (in water at 25 ℃)

針對(duì)11 種糖類化合物的洗脫條件優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)分為2 部分完成：第1部分為8 種單糖和1 種雙糖（Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib和Lac）的洗脫優(yōu)化，中性糖在色譜柱上的保留時(shí)間相對(duì)較短，其單糖結(jié)構(gòu)相似，具有同分異構(gòu)體，淋洗液濃度對(duì)其洗脫具有決定性作用；第2部分為糖醛酸（Glc UA和Gal UA）的洗脫優(yōu)化，糖醛酸的pKa值小，偏酸性，在色譜柱上的保留時(shí)間長(zhǎng)，NaOH溶液作為洗脫劑時(shí)，很難對(duì)糖醛酸分離洗脫；而NaAc與固定相的親和力強(qiáng)，Ac-洗脫能力強(qiáng)于OH-，因此，使用NaAc對(duì)糖醛酸進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)。

2.2 單糖和雙糖的等度洗脫實(shí)驗(yàn)

2.2.1 淋洗液選擇

選取5、10、20、25、30 mmol/L NaOH溶液對(duì)9 種糖類化合物進(jìn)行等度洗脫，考察對(duì)色譜峰的分離度與峰形的影響，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)：淋洗液NaOH濃度低于5 mmol/L時(shí)，色譜峰展寬，分析時(shí)間較長(zhǎng)，洗脫時(shí)間超過60 min；淋洗液為10 mmol/L NaOH溶液時(shí)，F(xiàn)uc、Glc、GalN三種單糖之間的分離度較高，峰形較好，但對(duì)于較難洗脫的組分（Gal、Man、Fruc和Rib）間的分離度較差，且洗脫時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，超過40 min。當(dāng)淋洗液NaOH濃度為20 mmol/L時(shí)，各單糖之間分離較好。當(dāng)淋洗液NaOH濃度繼續(xù)增大時(shí)，分析時(shí)間逐漸縮短，色譜峰峰形變尖，分離度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 NaOH濃度對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 2 Influence of NaOH concentration on chromatographic separation of nine sugars

隨NaOH濃度的增大，各個(gè)色譜峰保留時(shí)間縮短，響應(yīng)值增高。這可能是由于NaOH濃度的變化可以改變?nèi)芤褐蠴H-濃度、溶液pH值以及糖類在溶液中的解離度。隨OH-濃度增加，糖類的解離度增大，導(dǎo)致在固定相上的保留時(shí)間延長(zhǎng)；但是，隨OH-濃度增加，淋洗液的洗脫能力增強(qiáng)，亦可使糖類在固定相上的保留時(shí)間縮短。其中，后者占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。在考慮分離度、色譜峰的峰形、分析時(shí)長(zhǎng)等因素的情況下，選擇20 mmol/L NaOH溶液作為流速與溫度優(yōu)化程序的固定條件。

2.2.2 流速選擇

以20 mmol/L NaOH溶液作為淋洗液，設(shè)定淋洗液的流速分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，考察流速對(duì)9 種組分的色譜峰分離度與峰形的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，流速低時(shí)分析時(shí)間長(zhǎng)，峰形變寬，柱效降低，對(duì)于易洗脫的單糖（Fuc、Glc、GalN、GlcN和Gal）分離度更高，峰形更好；流速的變化對(duì)于Man、Fruc、Rib和Lac等較難洗脫的糖類化合物則影響較?。涣魉俑邥r(shí)，柱壓升高，各糖類化合物分離度變差。考慮分離度、色譜柱壓力、色譜柱柱效及分析時(shí)長(zhǎng)等因素，選擇1.0 mL/min作為最終流速。

圖3 流速對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 3 Influence of mobile phase flow rate on chromatographic separation of nine sugars

2.2.3 溫度選擇

以20 mmol/L NaOH溶液作為淋洗液，流速為1.0 mL/min，改變色譜柱溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，觀察各組分間分離度和峰形的變化，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)柱溫在25 ℃及以下時(shí)，分離度相對(duì)較好。柱溫在30 ℃以上時(shí)，糖類化合物的分離度變差，且不能實(shí)現(xiàn)Glc和GalN的分離。

圖4 溫度對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 4 Influence of column temperature on chromatographic separation of nine sugars

結(jié)果顯示，隨溫度升高，色譜峰的保留時(shí)間呈減小趨勢(shì)。這是由于糖類在色譜柱的保留屬于放熱行為，不同糖類化合物間受影響的程度不同，一般規(guī)律為隨糖類化合物相對(duì)分子質(zhì)量的增大，保留時(shí)間的影響程度增大[32]。柱溫對(duì)HPAEC分離單糖具有重要的影響，很小的溫差變化（±5 ℃）便會(huì)引起單糖保留時(shí)間的偏移，影響方法的重復(fù)性?？紤]到分離度、峰形以及儀器耐受性等因素，選擇25 ℃作為色譜柱溫度。

2.3 單糖、雙糖和糖醛酸的梯度淋洗液系統(tǒng)的確定

Fuc、Glc、GalN和Gal四種糖類化合物的保留時(shí)間較短，低濃度的NaOH溶液可達(dá)到較好的分離效果。Man、Fruc、Rib和Lac在固定相中的保留性較強(qiáng)，需采用較高濃度的NaOH溶液進(jìn)行洗脫分離。但洗脫過程中不可遽然改變淋洗液濃度，否則基線漂移嚴(yán)重，影響后續(xù)定量。采用在0～35 min內(nèi)，10～52 mmol/L NaOH作為梯度洗脫實(shí)現(xiàn)對(duì)單糖和雙糖的洗脫。糖醛酸在色譜柱上保留性強(qiáng)，若單獨(dú)使用200 mmol/L NaOH進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 min。需加入強(qiáng)洗脫劑NaAc溶液（與色譜柱親和度更高）作為淋洗液，最終確定以200 mmol/L NaAc+80 mmol/L NaOH對(duì)糖醛酸進(jìn)行洗脫。在完成檢測(cè)過程后，采用與固定相親和力更強(qiáng)的NaAc對(duì)保留性更強(qiáng)的雜質(zhì)進(jìn)行清除，本實(shí)驗(yàn)采用500 mmol/L NaAc作為基質(zhì)消除洗脫液。淋洗液系統(tǒng)的最終優(yōu)化洗脫程序見表2，總運(yùn)行時(shí)間為90 min。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/L的11 種糖類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組分的保留時(shí)間、線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（RSN=3）、定量限（RSN=10）見表4。11 種糖類化合物在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系R2不小于0.998 6，方法的檢出限（RSN=3）在1.27～47.49 mg/kg之間。

表4 線性數(shù)據(jù)和檢出限Table 4 Linearity and limits of detection and quantification

2.4.2 精密度結(jié)果

對(duì)日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行考察，分別從保留時(shí)間和峰面積2 個(gè)方面進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)質(zhì)量濃度10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣7 次計(jì)算日內(nèi)精密度，各單糖保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于0.259%，峰面積的RSD均小于1.69%。將10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 d進(jìn)樣3 次，連續(xù)進(jìn)樣4 d，計(jì)算日間精密度。各單糖保留時(shí)間的RSD均小于0.27%，峰面積的RSD均小于1.78%。結(jié)果見表5。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision experiments

2.4.3 加標(biāo)回收率結(jié)果

對(duì)海帶多糖的水解液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，對(duì)于樣品中含有的單糖，以樣品中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、200%進(jìn)行加標(biāo)，對(duì)于樣品中不含的糖類，以1、2、4 mg/L進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣7 次，計(jì)算峰面積的RSD。由表6可知，樣品加標(biāo)回收率在89.35%～115.67%之間。

表6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=7）Table 6 Results of spiked recovery experiments (n = 7)

2.5 樣品的測(cè)定

采用1.3.2節(jié)方法對(duì)8 份海帶樣品進(jìn)行前處理，采用1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，其中山東威海海之寶海域的1號(hào)樣品及其樣品加標(biāo)色譜圖見圖5。每批樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，得到海帶樣品的糖類組成和含量，結(jié)果見表7。

圖5 海帶樣品及其加標(biāo)色譜圖Fig. 5 Chromatograms of polysaccharides in real and spiked samples of Laminaria japonica

表7 實(shí)際樣品糖類化合物含量（n=3）Table 7 Contents of sugars in actual samples determined by the developed method (n = 3) mg/g

3 討論與結(jié)論

水產(chǎn)品中多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單糖種類多樣，單糖間分離難度較大。色譜柱的選擇是影響單糖分離的重要因素，CarboPac PA1、CarboPac PA10以及CarboPac PA20陰離子交換柱常用來分離單糖、雙糖。CarboPac PA1分析糖類時(shí)具有明顯的溶解氧負(fù)峰，且CarboPac PA1的靈敏度較CarboPac PA10和CarboPac PA20低[25]；CarboPac PA10和CarboPac PA20色譜柱的填料大致相似，不同的是CarboPac PA10色譜柱樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合是由雙功能乳膠構(gòu)成，而CarboPac PA20則是由季銨功能基乳膠構(gòu)成，CarboPac PA10容量相對(duì)更大[33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)中性糖和糖醛酸同時(shí)進(jìn)行分離，需采用較大容量的色譜柱。CarboPac PA10由乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合形成的基核，表面附聚具有疏水性的雙功能乳膠顆粒，容量為100 mol/柱，對(duì)溶解氧的保留性更強(qiáng)，可有效避免氧負(fù)峰[34]。最終選取CarboPac PA10作為11 種糖類組分分析的陰離子色譜柱。

本研究建立梯度洗脫-HPAEC-PAD分析Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib、Lac、Glc UA和Gal UA 11 種糖類化合物的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)中性糖、氨基糖和糖醛酸的同步分離，且11 種糖均達(dá)到基線分離，線性關(guān)系良好，精密度高。對(duì)海帶多糖水解液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，其加標(biāo)回收率在89.35%～115.67%之間。相對(duì)于其他檢測(cè)方法（如高效液相色譜法）可分析的單糖種類來看，HPAEC-PAD可檢測(cè)的種類更多，更全面，分離度更高。相對(duì)于氣相色譜等其他需衍生化的檢測(cè)方法看，操作更為簡(jiǎn)便、高效。結(jié)果表明，該方法具有操作簡(jiǎn)便易行，分離度、靈敏度、精密度高，重復(fù)性好等特點(diǎn)。