尹大芳,孫曉杰,郭瑩瑩,李 娜,田 雨,王聯(lián)珠,*
(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071)
海洋資源豐富,海洋生物含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),相對(duì)于陸生資源具有更高的營(yíng)養(yǎng)以及更高的開發(fā)價(jià)值[1],海藻的加工以及高值化利用成為海洋資源綜合利用的重要領(lǐng)域[2]。海帶含有海帶多糖、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素等多種生物活性成分,具有利水消腫和御寒等功效。海帶多糖在降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]和神經(jīng)保護(hù)[6]等方面具有重要的生物學(xué)活性。但由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其生物活性機(jī)制研究仍然是一個(gè)難題。單糖組成和含量對(duì)生理活性有極大影響[7-8],是多糖基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的研究環(huán)節(jié)[9]。單糖是一種多羥基醛酮化合物,極性強(qiáng),無發(fā)色官能團(tuán)和熒光官能團(tuán),結(jié)構(gòu)相似,存在同分異構(gòu)體,對(duì)分離條件的要求較高。
常用的單糖定性定量方法有高效液相色譜法[10-14]、氣相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳法[16-18]和高效陰離子交換色譜法[19-21]等。高效液相色譜聯(lián)合示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器無需衍生,操作簡(jiǎn)便,但選擇性和靈敏度差[10-12]。由于單糖沒有發(fā)色基團(tuán)、熒光基團(tuán)以及沒有揮發(fā)性,采用紫外、熒光檢測(cè)器以及氣相色譜檢測(cè)時(shí),常需要進(jìn)行柱前柱后衍生化[14-15]。衍生化過程費(fèi)時(shí)繁瑣,常伴隨衍生過程不徹底或生成多種衍生物,阻礙了糖類檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[15,22-24]。毛細(xì)管電泳法靈敏度低和重復(fù)性差的特點(diǎn)極大限制其應(yīng)用[17-18,20]。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD)法是一種強(qiáng)有力的分析糖類化合物的檢測(cè)技術(shù)。以電化學(xué)檢測(cè)器作為檢測(cè)器,高選擇性的陰離子交換柱作為固定相,選擇最新優(yōu)化的四電位檢測(cè)波形,負(fù)電位清洗電極,正電位氧化并激活電極,可有效降低電極的損耗,延長(zhǎng)電極壽命以及增加實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性[25];羥基的氧化電位較低(0.1 V),所以基體干擾少,方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性高[26]。NaOH溶液作為淋洗液,改變NaOH濃度,可影響溶液中分子形成氫鍵的能力,導(dǎo)致其與固定相結(jié)合能力的差異實(shí)現(xiàn)糖類分離。電化學(xué)檢測(cè)器與梯度淋洗液的相容性,結(jié)合陰離子交換固定相的高選擇性,可根據(jù)糖分子結(jié)構(gòu)間的細(xì)微差別,幾乎可達(dá)到所有類別的醛糖醇的分離,檢出限低至10-12~10-15mol[25]。該方法具有操作簡(jiǎn)單,靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度高和重復(fù)性好的特點(diǎn)。HPAECPAD已應(yīng)用于各種常規(guī)監(jiān)測(cè)和研究領(lǐng)域,包括牛奶[27]、谷類[28]、中草藥[21]、玉米淀粉[29]以及細(xì)胞培養(yǎng)[9]等各種材料中單糖、雙糖、寡糖的檢測(cè)等,但水產(chǎn)品中糖類種類較為復(fù)雜,應(yīng)用較少。此外,針對(duì)水產(chǎn)品的中性糖和糖醛酸同時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用較少。
因此,本實(shí)驗(yàn)采用Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng),聯(lián)合脈沖安培檢測(cè)器,以CarboPac PA10(250 mm×4 mm)作為糖分析柱,考察淋洗液濃度、色譜柱柱溫和淋洗液流速對(duì)各組分分離的影響。采用梯度洗脫對(duì)常見的11 種糖類化合物進(jìn)行分離定量,建立同時(shí)定性定量分析11 種糖類化合物的方法,利用該方法對(duì)海帶多糖水解后單糖組分進(jìn)行測(cè)定。
樣品分別采購(gòu)自山東威海、遼寧大連、福建霞浦海域;11 種糖類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):巖藻糖(fucose,F(xiàn)uc)、葡萄糖(glucose,Glc)、氨基半乳糖(galactosamine,GalN)、氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)、半乳糖(galactose,Gal)、甘露糖(mannose,Man)、果糖(fructose,F(xiàn)ruc)、核糖(ribose,Rib)、乳糖(lactose,Lac)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,Gal UA)和葡萄糖醛酸(glucuronic acid,Glc UA)(純度均不小于98%),50%氫氧化鈉(色譜純)、乙酸鈉(分析純) 美國(guó)Sigma公司;實(shí)驗(yàn)用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm的超純水;無水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸均屬國(guó)產(chǎn)分析純。
Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)、CarboPac PA10糖分析柱(250 mm×4 mm)、CarboPac PA10糖保護(hù)柱(50 mm×4 mm) 美國(guó)戴安公司;FDU-2110高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Heidolph公司;DFY-300型搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;ZRD-A7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智試分析儀器公司;Milli-Q超純水設(shè)備 美國(guó)Milipore公司。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和淋洗液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:用超純水將各糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液均配制成1 mg/mL的母液。取適量母液配制成一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
200 mmol/L NaOH淋洗液:取50% NaOH溶液10.4 mL,用超純水定容至1 L。
500 mmol/L NaAc淋洗液:稱取NaAc固體20.5 g,用超純水溶解并定容至500 mL;淋洗液配制完成后立即通氮?dú)鈸u勻備用。
1.3.2 樣品前處理
多糖提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[30]的方法。洗凈海帶表面泥沙等雜質(zhì),在50 ℃烘箱中烘干,打碎成海帶粉,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.0 g海帶粉加入10 倍的無水乙醇靜置12 h,取沉淀于50 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量;加入30 倍超純水,利用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)處理30 min,置于60 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min,離心取上清液,于60 ℃旋蒸至原體積的1/4,加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)80%,4 ℃過夜,離心,取沉淀復(fù)溶于水,利用Sevag法(正丁醇-氯仿,1∶5,V/V)除蛋白后,用2 mol/L三氟乙酸溶液于120 ℃恒溫干燥箱中水解2 h;水解完成后NaOH中和水解液,離心,去沉淀,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,用于進(jìn)樣分析。
1.3.3 色譜條件
采用CarboPac PA10(250 mm×4 mm)作為糖分析柱,CarboPac PA10(50 mm×4 mm)作為糖保護(hù)柱,脈沖安培檢測(cè)器,糖標(biāo)準(zhǔn)四電位(表1)作為檢測(cè)波形,水-NaOH-NaAc組成三元淋洗液,流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為25 μL。淋洗液系統(tǒng)最終優(yōu)化洗脫程序見表2。梯度洗脫程序可分為單雙糖的分離、糖醛酸的分離、基質(zhì)的消除、賦予色譜系統(tǒng)強(qiáng)pH值、色譜柱的平衡5 個(gè)階段。利用保留時(shí)間進(jìn)行定性,外標(biāo)法(峰面積)進(jìn)行定量計(jì)算。圖1為質(zhì)量濃度10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。
圖1 11 種糖類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 1 Chromatogram of mixed solution of 11 sugar standards
表1 糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形Table 1 Quadruple-potential waveform for carbohydrate detection
表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program
糖類具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),對(duì)于一些差向異構(gòu)體的單糖(如Glc與Gal、Man)pKa相近,易形成共洗脫,較難分離[31]。通過淋洗液的濃度改變淋洗液的pH值,從而改變糖類化合物的質(zhì)子解離程度,達(dá)到有效的分離。糖類在色譜柱上保留性質(zhì)與糖類的pKa值具有重要的相關(guān)性,表3為部分糖類化合物的pKa值。相同的堿性環(huán)境中,pKa值越大,其酸性越弱,糖類解離度越差,與固定相結(jié)合能力越弱,越容易洗脫;糖類在陰離子交換分離柱的洗脫順序依次為單糖、雙糖、糖醛酸。糖醛酸是糖的衍生產(chǎn)物,比相應(yīng)的單糖多了羧酸基團(tuán),酸性較強(qiáng),在陰離子交換柱上的保留性強(qiáng)。
表3 部分糖類化合物的pKa值(水中,25 ℃)Table 3 pKa value of some sugars (in water at 25 ℃)
針對(duì)11 種糖類化合物的洗脫條件優(yōu)化,本實(shí)驗(yàn)分為2 部分完成:第1部分為8 種單糖和1 種雙糖(Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib和Lac)的洗脫優(yōu)化,中性糖在色譜柱上的保留時(shí)間相對(duì)較短,其單糖結(jié)構(gòu)相似,具有同分異構(gòu)體,淋洗液濃度對(duì)其洗脫具有決定性作用;第2部分為糖醛酸(Glc UA和Gal UA)的洗脫優(yōu)化,糖醛酸的pKa值小,偏酸性,在色譜柱上的保留時(shí)間長(zhǎng),NaOH溶液作為洗脫劑時(shí),很難對(duì)糖醛酸分離洗脫;而NaAc與固定相的親和力強(qiáng),Ac-洗脫能力強(qiáng)于OH-,因此,使用NaAc對(duì)糖醛酸進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)。
2.2.1 淋洗液選擇
選取5、10、20、25、30 mmol/L NaOH溶液對(duì)9 種糖類化合物進(jìn)行等度洗脫,考察對(duì)色譜峰的分離度與峰形的影響,結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn):淋洗液NaOH濃度低于5 mmol/L時(shí),色譜峰展寬,分析時(shí)間較長(zhǎng),洗脫時(shí)間超過60 min;淋洗液為10 mmol/L NaOH溶液時(shí),F(xiàn)uc、Glc、GalN三種單糖之間的分離度較高,峰形較好,但對(duì)于較難洗脫的組分(Gal、Man、Fruc和Rib)間的分離度較差,且洗脫時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),超過40 min。當(dāng)淋洗液NaOH濃度為20 mmol/L時(shí),各單糖之間分離較好。當(dāng)淋洗液NaOH濃度繼續(xù)增大時(shí),分析時(shí)間逐漸縮短,色譜峰峰形變尖,分離度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
圖2 NaOH濃度對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 2 Influence of NaOH concentration on chromatographic separation of nine sugars
隨NaOH濃度的增大,各個(gè)色譜峰保留時(shí)間縮短,響應(yīng)值增高。這可能是由于NaOH濃度的變化可以改變?nèi)芤褐蠴H-濃度、溶液pH值以及糖類在溶液中的解離度。隨OH-濃度增加,糖類的解離度增大,導(dǎo)致在固定相上的保留時(shí)間延長(zhǎng);但是,隨OH-濃度增加,淋洗液的洗脫能力增強(qiáng),亦可使糖類在固定相上的保留時(shí)間縮短。其中,后者占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。在考慮分離度、色譜峰的峰形、分析時(shí)長(zhǎng)等因素的情況下,選擇20 mmol/L NaOH溶液作為流速與溫度優(yōu)化程序的固定條件。
2.2.2 流速選擇
以20 mmol/L NaOH溶液作為淋洗液,設(shè)定淋洗液的流速分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min,考察流速對(duì)9 種組分的色譜峰分離度與峰形的影響,結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明,流速低時(shí)分析時(shí)間長(zhǎng),峰形變寬,柱效降低,對(duì)于易洗脫的單糖(Fuc、Glc、GalN、GlcN和Gal)分離度更高,峰形更好;流速的變化對(duì)于Man、Fruc、Rib和Lac等較難洗脫的糖類化合物則影響較?。涣魉俑邥r(shí),柱壓升高,各糖類化合物分離度變差。考慮分離度、色譜柱壓力、色譜柱柱效及分析時(shí)長(zhǎng)等因素,選擇1.0 mL/min作為最終流速。
圖3 流速對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 3 Influence of mobile phase flow rate on chromatographic separation of nine sugars
2.2.3 溫度選擇
以20 mmol/L NaOH溶液作為淋洗液,流速為1.0 mL/min,改變色譜柱溫度分別為20、25、30、35、40 ℃,觀察各組分間分離度和峰形的變化,結(jié)果如圖4所示。當(dāng)柱溫在25 ℃及以下時(shí),分離度相對(duì)較好。柱溫在30 ℃以上時(shí),糖類化合物的分離度變差,且不能實(shí)現(xiàn)Glc和GalN的分離。
圖4 溫度對(duì)9 種糖類化合物分離效果的影響Fig. 4 Influence of column temperature on chromatographic separation of nine sugars
結(jié)果顯示,隨溫度升高,色譜峰的保留時(shí)間呈減小趨勢(shì)。這是由于糖類在色譜柱的保留屬于放熱行為,不同糖類化合物間受影響的程度不同,一般規(guī)律為隨糖類化合物相對(duì)分子質(zhì)量的增大,保留時(shí)間的影響程度增大[32]。柱溫對(duì)HPAEC分離單糖具有重要的影響,很小的溫差變化(±5 ℃)便會(huì)引起單糖保留時(shí)間的偏移,影響方法的重復(fù)性??紤]到分離度、峰形以及儀器耐受性等因素,選擇25 ℃作為色譜柱溫度。
Fuc、Glc、GalN和Gal四種糖類化合物的保留時(shí)間較短,低濃度的NaOH溶液可達(dá)到較好的分離效果。Man、Fruc、Rib和Lac在固定相中的保留性較強(qiáng),需采用較高濃度的NaOH溶液進(jìn)行洗脫分離。但洗脫過程中不可遽然改變淋洗液濃度,否則基線漂移嚴(yán)重,影響后續(xù)定量。采用在0~35 min內(nèi),10~52 mmol/L NaOH作為梯度洗脫實(shí)現(xiàn)對(duì)單糖和雙糖的洗脫。糖醛酸在色譜柱上保留性強(qiáng),若單獨(dú)使用200 mmol/L NaOH進(jìn)行洗脫,洗脫時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 min。需加入強(qiáng)洗脫劑NaAc溶液(與色譜柱親和度更高)作為淋洗液,最終確定以200 mmol/L NaAc+80 mmol/L NaOH對(duì)糖醛酸進(jìn)行洗脫。在完成檢測(cè)過程后,采用與固定相親和力更強(qiáng)的NaAc對(duì)保留性更強(qiáng)的雜質(zhì)進(jìn)行清除,本實(shí)驗(yàn)采用500 mmol/L NaAc作為基質(zhì)消除洗脫液。淋洗液系統(tǒng)的最終優(yōu)化洗脫程序見表2,總運(yùn)行時(shí)間為90 min。
2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/L的11 種糖類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組分的保留時(shí)間、線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(RSN=3)、定量限(RSN=10)見表4。11 種糖類化合物在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系R2不小于0.998 6,方法的檢出限(RSN=3)在1.27~47.49 mg/kg之間。
表4 線性數(shù)據(jù)和檢出限Table 4 Linearity and limits of detection and quantification
2.4.2 精密度結(jié)果
對(duì)日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行考察,分別從保留時(shí)間和峰面積2 個(gè)方面進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)化的色譜條件下,對(duì)質(zhì)量濃度10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣7 次計(jì)算日內(nèi)精密度,各單糖保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均小于0.259%,峰面積的RSD均小于1.69%。將10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 d進(jìn)樣3 次,連續(xù)進(jìn)樣4 d,計(jì)算日間精密度。各單糖保留時(shí)間的RSD均小于0.27%,峰面積的RSD均小于1.78%。結(jié)果見表5。
表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision experiments
2.4.3 加標(biāo)回收率結(jié)果
對(duì)海帶多糖的水解液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),對(duì)于樣品中含有的單糖,以樣品中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、200%進(jìn)行加標(biāo),對(duì)于樣品中不含的糖類,以1、2、4 mg/L進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),重復(fù)進(jìn)樣7 次,計(jì)算峰面積的RSD。由表6可知,樣品加標(biāo)回收率在89.35%~115.67%之間。
表6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7)Table 6 Results of spiked recovery experiments (n = 7)
采用1.3.2節(jié)方法對(duì)8 份海帶樣品進(jìn)行前處理,采用1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,其中山東威海海之寶海域的1號(hào)樣品及其樣品加標(biāo)色譜圖見圖5。每批樣品平行測(cè)定3 次,取平均值,得到海帶樣品的糖類組成和含量,結(jié)果見表7。
圖5 海帶樣品及其加標(biāo)色譜圖Fig. 5 Chromatograms of polysaccharides in real and spiked samples of Laminaria japonica
表7 實(shí)際樣品糖類化合物含量(n=3)Table 7 Contents of sugars in actual samples determined by the developed method (n = 3) mg/g
水產(chǎn)品中多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,單糖種類多樣,單糖間分離難度較大。色譜柱的選擇是影響單糖分離的重要因素,CarboPac PA1、CarboPac PA10以及CarboPac PA20陰離子交換柱常用來分離單糖、雙糖。CarboPac PA1分析糖類時(shí)具有明顯的溶解氧負(fù)峰,且CarboPac PA1的靈敏度較CarboPac PA10和CarboPac PA20低[25];CarboPac PA10和CarboPac PA20色譜柱的填料大致相似,不同的是CarboPac PA10色譜柱樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合是由雙功能乳膠構(gòu)成,而CarboPac PA20則是由季銨功能基乳膠構(gòu)成,CarboPac PA10容量相對(duì)更大[33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)中性糖和糖醛酸同時(shí)進(jìn)行分離,需采用較大容量的色譜柱。CarboPac PA10由乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合形成的基核,表面附聚具有疏水性的雙功能乳膠顆粒,容量為100 mol/柱,對(duì)溶解氧的保留性更強(qiáng),可有效避免氧負(fù)峰[34]。最終選取CarboPac PA10作為11 種糖類組分分析的陰離子色譜柱。
本研究建立梯度洗脫-HPAEC-PAD分析Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib、Lac、Glc UA和Gal UA 11 種糖類化合物的檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)中性糖、氨基糖和糖醛酸的同步分離,且11 種糖均達(dá)到基線分離,線性關(guān)系良好,精密度高。對(duì)海帶多糖水解液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),其加標(biāo)回收率在89.35%~115.67%之間。相對(duì)于其他檢測(cè)方法(如高效液相色譜法)可分析的單糖種類來看,HPAEC-PAD可檢測(cè)的種類更多,更全面,分離度更高。相對(duì)于氣相色譜等其他需衍生化的檢測(cè)方法看,操作更為簡(jiǎn)便、高效。結(jié)果表明,該方法具有操作簡(jiǎn)便易行,分離度、靈敏度、精密度高,重復(fù)性好等特點(diǎn)。