黃煜燃,汪 薇,趙文紅,楊 娟,劉巧瑜,白衛(wèi)東
(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東 廣州 510225)
馬鮫魚(Scomberomorus niphonius),類屬于鱸形目(Perciformes),鯖科(Scombridae),馬鮫屬(Scomberomorus),根據(jù)其種類可分為康氏馬鮫魚、藍點馬鮫魚、中華馬鮫魚、朝鮮馬鮫魚和斑點馬鮫魚等。一般分布于北太平洋西部,同時也廣泛存在于我國東海、黃海、渤海等海域,以黃海、渤海的產(chǎn)量最高,是我國重要的海洋經(jīng)濟魚類之一[1]。馬鮫魚的營養(yǎng)價值極高,含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、必需氨基酸、多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等,因而備受消費者青睞[2-3]。
馬鮫魚的食用方式除了鮮食以外,還可以加工為腌制產(chǎn)品。腌制是水產(chǎn)品加工保藏最常用的方法之一,主要分為濕腌、干腌以及混合腌[4]。在國內(nèi),馬鮫魚一般采用干腌制法,但由于傳統(tǒng)的高鹽干腌制食品不利于人體健康,因此,近年來多采用低鹽干腌制法。低鹽干腌制法主要是用一定比例的鈉鹽(3%~6%)進行腌制,隨后經(jīng)過1~5 d的風干干燥工藝制作而成。此外,在干腌過程中也會添加其他輔料,如蔗糖和白酒等,以促進風味的產(chǎn)生。在腌制和風干成熟過程中,原料肉中水分流失、水分活度降低,微生物活動和組織內(nèi)蛋白酶活性被抑制,從而可實現(xiàn)產(chǎn)品的長時間保存[5]。另外,蛋白質(zhì)在微生物、組織蛋白酶、鈣酶和肽酶等的作用下會降解為大量的小分子肽和游離氨基酸,使腌魚制品具有特殊的咸鮮味[6-8]。
由于目前鮮見對干腌馬鮫魚滋味的研究,而對于其他干腌魚如干腌鮐魚[9]、帶魚[10]、草魚[11]等滋味的研究結(jié)果顯示其鮮味多被認為主要由鮮味氨基酸、核苷酸和鮮味有機酸賦予。因此,本實驗以8 種不同加工工藝的干腌馬鮫魚為研究對象,采用高效液相色譜法對8 種干腌馬鮫魚常見的鮮味物質(zhì)進行測定,并結(jié)合滋味強度值(taste activity value,TAV)和味精當量(equivalent umami concentration,EUC),分析并比較其鮮味物質(zhì)的貢獻和差異,以期為干腌馬鮫魚產(chǎn)品的改良和開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
8 種干腌馬鮫魚購于不同產(chǎn)地廠家,分別編號為1~8號,其加工工藝條件如表1所示。樣品經(jīng)冷凍密封箱運回實驗室后,去皮去骨,絞碎,分裝,于-18 ℃冰箱貯藏待用。
表1 8 種干腌馬鮫魚加工工藝條件Table 1 Processing conditions for eight commercially available drycured Spanish mackerel
5’-腺苷酸(adenosine 5’-monophosphate,5’-AMP)、5’-肌苷酸(inosine 5’-monophosphate,5’-IMP)、5’-鳥苷酸(guamosine 5’-monophosphate,5’-GMP)、肌苷(inosine,HxR)、次黃嘌呤(hypoxanthine,Hx)、乳酸、琥珀酸 美國Sigma公司;氨基酸混標及衍生試劑 美國安捷倫科技有限公司;細胞色素C(12 384 Da)、抑酞酶(6 511 Da)、桿菌肽(1 423 Da)、氧化型谷胱甘肽(621 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均購于廣州化學試劑廠。
HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;自動化切向流過濾系統(tǒng) 瑞普利金(上海)生物科技有限公司公司;5810型高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司。
1.3.1 干腌馬鮫魚的感官評定
感官評定小組由實驗室的11 名專業(yè)評價成員(5 名男性和6 名女性)組成。評定前,對他們進行5 種基本味感(即酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味)和濃厚味的感官適應(yīng)性培訓。濃厚味是指食品中如濃厚感、豐富度、持續(xù)性、協(xié)調(diào)性和飽滿圓潤等一種綜合性的味覺感受,參考Zhang Ninglong等[12]的方法,以谷胱甘肽的味感作為濃厚味培訓標準。感官評定在溫度為(25±2)℃的感官評定室進行,感官評分設(shè)定為1~10 分,其中1 分代表無味,5 分代表味感適中,10 分代表味感強烈。
1.3.2 乳酸和琥珀酸的測定
參照Chen Dewei等[13]的方法并略作修改,準確稱取10.00 g碎肉,加入40 mL去離子水,于高速分散器10 000 r/min勻質(zhì)1 min,重復3 次,8 200×g離心15 min,取上清液,過0.22 μm水系濾膜,待測。
色譜柱采用ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A為甲醇,流動相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.8);流動相A和B的比例為3∶97,等度洗脫,流速0.8 mL/min,進樣量10 μL,柱溫30 ℃;檢測波長214 nm。
1.3.3 核苷酸及其降解產(chǎn)物的測定
參照Ryder[14]的方法并略作修改。準確稱取10.00 g碎魚肉,加入已預(yù)冷的30 mL 5% HClO4溶液,用高速分散器勻質(zhì)3 次(10 000 r/min,3×1 min),4 ℃、8 200×g離心15 min,取上清液,沉淀物再用10 mL相同濃度的HClO4重復以上步驟,合并2 次上清液,用5 mol/L KOH溶液調(diào)pH值至6.5,然后過0.22 μm水系濾膜,待測。
色譜柱采用ZIC?-HILIC(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A為5 mmol/L磷酸二氫鉀(pH 5.3),流動相B為乙腈溶液;洗脫程序為20%流動相A和80%流動相B等度洗脫,流速為1 mL/min,進樣量10 μL,柱溫30 ℃,波長254 nm。
1.3.4 游離氨基酸的測定
準確稱取5.00 g樣品,添加15 mL 5 g/100 mL三氯乙酸,均質(zhì),定容到25 mL,超聲30 min,放置1 h后,取濾液1 mL于1.5 mL離心管中,12 800×g離心10 min,用0.22 μm水系濾膜過濾。采用Agilent自動在線衍生的方法,用高效液相色譜儀分析。
1.3.5 肽分子質(zhì)量分布的測定
參照莫加利等[15]的方法略作修改。準確稱取10.00 g碎肉,加入去離子水,于高速分散器10 000 r/min勻質(zhì)1 min,重復3 次,在魚肉與水的比例1∶4(g/mL),溫度40 ℃條件下水浴提取120 min,8 200×g離心15 min,取上清液,過0.22 μm水系濾膜,待測。
色譜柱采用TSKGel-G2000-SWXL(7.8 mm×300 mm);流動相為乙腈-水-三氟乙酸(40∶60∶0.1,V/V),流速0.5 mL/min,進樣量20 μL,柱溫30 ℃,紫外檢測波長214 nm。相對分子質(zhì)量的對數(shù)值與洗脫時間擬合直線方程為y=-0.506 8x+15.757(R2=0.969 7),其中,y為標準肽分子質(zhì)量的對數(shù);x為保留時間。
1.3.6 呈味肽的提取與超濾分級
采用溫水法[16]提取呈味肽,取粉碎均勻的魚肉100.00 g,在魚肉與水的比例1∶4(g/mL)、溫度40 ℃、時間120 min條件下提取,2 000×g離心15 min,取上清液,即為其呈味肽提取液。
用自動化切向流過濾系統(tǒng),用中空纖維過濾膜柱,將呈味肽提取液按分子質(zhì)量的大小分級超濾濃縮,得到分子質(zhì)量區(qū)間為5~10、3~5、1~3 kDa和小于1 kDa四個組分。
1.3.7 TAV及EUC的計算
TAV[17]按式(1)計算:
式中:C為滋味物質(zhì)的含量/(mg/100 g);T為滋味物質(zhì)的味道閾值/(mg/100 g)。
若TAV>1,則可以認為該物質(zhì)對樣品的滋味有重要貢獻,若TAV<1,則可以認為該物質(zhì)對樣品貢獻不大。
EUC[18]按式(2)計算:
式中:EUC按每100 g樣品含谷氨酸鈉(monosodium glutamate,MSG)質(zhì)量計/(g/100 g);1 218為協(xié)同作用系數(shù);ai為鮮味氨基酸(Asp、Glu)的含量/(g/100 g);bi為鮮味氨基酸相對于MSG的相對鮮度系數(shù)(Asp為0.077,Glu為1);aj為呈味核苷酸(5’-AMP、5’-IMP、5’-GMP)的含量/(g/100 g);bj為呈味核苷酸相對于5’-IMP的相對鮮度系數(shù)(5’-AMP為0.8,5’-IMP為1,5’-GMP為2.3)。
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和相關(guān)性分析,采用Origin 8.6軟件作圖。
為了確認干腌馬鮫魚的基本味感特性,將8 種樣品在不添加任何調(diào)味品的條件下進行蒸煮,并對5 種基本味感和濃厚味進行感官評價。如圖1所示,咸、鮮味和濃厚味是8 種市售干腌馬鮫魚的主要滋味,而不同樣品間咸味、甜味、苦味和酸味的滋味強度存在顯著差異,且其差異性與工藝條件的差異密切相關(guān)。其中,風干時間為5 d的樣品苦味高于風干時間1 d的樣品;而風干時間1 d的樣品咸、鮮味和濃厚味感則高于風干時間5 d的樣品。這可能是風干時間較長,水分流失,鹽含量逐漸增加,細胞結(jié)構(gòu)被破壞,釋放了體內(nèi)的活性酶,使蛋白的水解程度更高,從而增加了產(chǎn)品的苦味肽含量[19]。此外,調(diào)味品的添加對其味道有顯著影響,如在加工過程中添加蔗糖的4號樣品甜味、鮮味和濃厚味感呈味得分均最高,而在加工過程中添加白酒的5號樣品則呈現(xiàn)出輕微的酸味。
圖1 8 種樣品的感官評定雷達圖Fig. 1 Sensory evaluation radar chart of eight samples
乳酸和琥珀酸除了分別是酸味和鮮味的載體外,還能夠協(xié)同其他物質(zhì)起到增強呈味的作用,是水產(chǎn)品重要的滋味物質(zhì)之一[20-21]。參考文獻[22]中報道的呈味特征和閾值,對乳酸和琥珀酸的含量進行檢測,結(jié)果如表2所示。干腌馬鮫魚樣品中并未檢出琥珀酸,而均檢出乳酸,且乳酸呈味TAV均大于1,說明對干腌馬鮫魚的酸味和增味效果有直接貢獻。此外,除5號樣品外,6~8號樣品的乳酸含量顯著高于1~4號樣品,說明長時間的風干工藝可能有助于乳酸的積累;4號樣品中的乳酸含量顯著低于其他樣品,而5號樣品中的乳酸含量則顯著低于同類型樣品,表示蔗糖和白酒的添加會抑制乳酸的產(chǎn)生。
表2 8 種樣品的乳酸和琥珀酸含量Table 2 Lactic acid and succinic acid contents of eight samples
魚類死亡后,肌肉中的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)在內(nèi)源性酶和細菌肌苷核苷酶的共同作用下,會降解為相關(guān)的化合物(圖2)。一般認為,5’-AMP和5’-IMP是魚類重要的鮮味成分,能夠顯著提高食品的鮮味[23]。此外,IMP的降解產(chǎn)物也是魚類風味的重要指標,當IMP降解為Hx時,會產(chǎn)生苦味,對魚肉的品質(zhì)有一定的影響[24]。
圖2 魚類死亡后體內(nèi)ATP降解途徑Fig. 2 Pathways of ATP degradation in fish after death
由表3可知,8 種干腌馬鮫魚樣品均未檢測到核苷酸,而不同程度上檢測到了HxR和Hx,說明干腌馬鮫魚中的核苷酸已降解為HxR和Hx,且Hx含量顯著高于HxR。這可能是因為ATP降解為IMP的過程十分迅速,一般在魚體死亡后的數(shù)小時內(nèi)達到最大值,隨后便會在磷酸水解酶和核苷酶的作用下逐漸脫去磷酸和核糖而降解生成Hx[25]。此外,溫度對IMP的降解也會產(chǎn)生一定的影響。Kuda等[26]研究發(fā)現(xiàn),魚類IMP含量隨著溫度的升高而逐漸下降。本研究中干腌馬鮫魚的干腌法工藝條件一般需要長時間腌制和風干,且已經(jīng)過一段時間的貯藏,這些條件均會導致干腌魚中的IMP降解為HxR和Hx。除此之外,5、7號和8號樣品的Hx含量顯著高于1~4號樣品,說明長時間的風干可能有助于魚肉中核苷酸的降解;這也是導致其苦味味感較為明顯的原因之一,與圖1結(jié)果吻合。
表3 8 種樣品的核苷酸及其降解產(chǎn)物含量Table 3 Contents of nucleotides and their degradation products in eight samples mg/100 g
游離氨基酸是水產(chǎn)品及其加工制品的主要呈味物質(zhì)之一,其種類及含量會直接影響水產(chǎn)品的滋味特性,其中,谷氨酸和天冬氨酸被認為是水產(chǎn)品的主要鮮味物質(zhì)之一。如表4所示,樣品中谷氨酸的TAV大于1(除3、5、7號),而天冬氨酸的TAV均小于1,說明干腌馬鮫魚中的谷氨酸是影響其鮮味的主要氨基酸,但谷氨酸和天冬氨酸能與NaCl產(chǎn)生協(xié)同增效作用,從而提升鮮味味感[29]。同樣地,其他氨基酸如精氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸在低于其閾值時也能增加呈味復雜性,并提高谷氨酸的鮮味強度[30-31]。此外,除添加了蔗糖的4號樣品中總游離氨基酸和谷氨酸含量均高于其他樣品外,風干時間對總游離氨基酸的影響不顯著,表明蔗糖的添加對鮮味氨基酸的生成有促進作用。Zhang Jinjie等[11]通過對比草魚干腌制過程中加入香辛料花椒和蔗糖對游離氨基酸的影響,同樣發(fā)現(xiàn)了蔗糖的添加有利于鮮味氨基酸的生成。
由表4可知,8 種樣品的EUC介于0.02~0.46 g/100 g之間。結(jié)合味精的閾值(0.03 g/100 g)計算可得,4號樣品EUC的TAV遠大于1,具有明顯的鮮味特性,與圖1結(jié)果一致;其余樣品EUC的TAV均約等于1,說明鮮味味感較弱。此結(jié)果與感官評價結(jié)果不吻合,其可能的原因是干腌馬鮫魚樣品中還存在其他鮮味物質(zhì),如鮮味肽等。目前研究認為,分子質(zhì)量小于3 000 Da的寡肽具有一定的呈味效果,而小于1 000 Da的小分子肽具有顯著的鮮味特性和增鮮效果[32-33],是多數(shù)水產(chǎn)品的主要滋味貢獻者,如肌肽、鵝肌肽和鯨肌肽等[34-36]。由于目前鮮見對干腌魚制品中鮮味肽的研究,因此,為了進一步確定干腌馬鮫魚的主要鮮味貢獻者,本實驗對干腌魚樣品中的小分子肽組分進行感官評定和肽分子質(zhì)量分布測定。
表4 8 種樣品的游離氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents of eight samples
通過超濾對干腌馬鮫魚的不同肽段進行截留,并進行感官評價,結(jié)果如表5所示,隨著肽分子質(zhì)量的減小,所有樣品的鮮味和濃厚味逐漸突出,小于1 000 Da的肽段具有較高的鮮味和濃厚味得分,表明這部分肽段具有鮮味物質(zhì)如鮮味氨基酸或鮮味肽等。而分子質(zhì)量在1 000~3 000 Da部分肽段具有第2高的鮮味和濃厚味呈味得分,則暗示具有鮮味肽的存在。此外,可以看出5~8號樣鮮味得分高于1~4號樣,又結(jié)合肽分子質(zhì)量分布的結(jié)果(圖3)可知,5~8號中小于1 000 Da的肽段占比顯著高于1~4號樣,說明干腌馬鮫魚中的蛋白質(zhì)在干腌過程中存在降解情況,且長時間的風干可能有助于小分子肽的積累,促使鮮味肽的產(chǎn)生[37]。
圖3 8 種樣品的肽分子質(zhì)量分布Fig. 3 Peptide molecular mass distribution of eight samples
表5 超濾組分鮮味和濃厚味感官評分結(jié)果Table 5 Sensory scores for umami and kokumi taste of ultrafiltration components
不同加工工藝的干腌馬鮫魚鮮味物質(zhì)的含量和組成存在一定差異性,這會對干腌馬鮫魚的滋味特性產(chǎn)生不同程度的影響。經(jīng)過感官評價,8 種干腌馬鮫魚均呈現(xiàn)出明顯的咸、鮮味和濃厚味感。通過對干腌馬鮫魚中游離氨基酸、有機酸和核苷酸的檢測,以及呈味肽提取液的肽分子質(zhì)量分布及超濾組分感官分析可知,賦予干腌馬鮫魚鮮味的主要物質(zhì)是谷氨酸和小于1 000 Da的小分子鮮味肽。長時間的風干工藝,可能會增加產(chǎn)品的咸味和苦味味感,并能促使乳酸和Hx等產(chǎn)物的積累;腌制時添加的蔗糖和白酒等輔料能抑制乳酸的產(chǎn)生,且蔗糖能在一定程度上促進谷氨酸等鮮味氨基酸的形成??梢?,加工工藝及輔料可能會影響干腌馬鮫魚滋味的形成。本研究探討了賦予干腌馬鮫魚鮮味的主要貢獻物質(zhì),為進一步研究干腌馬鮫魚的滋味調(diào)控提供了一定的理論支撐。