熱處理對負載葉黃素的羅非魚分離蛋白乳液穩(wěn)定性和體外消化的影響

陳艾霖，洪鵬志, 2，宋春勇，馮瑞，李婷，周春霞,2*，林瓊妮

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東 湛江，524088)2(南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江，524088)

葉黃素又名“植物黃體素”，屬于含氧類胡蘿卜素，是廣泛存在于萬壽菊、玉米、蛋黃等中的天然色素[1]。葉黃素具有改善老齡性黃斑變性和心血管疾病、預防白內(nèi)障、降低患癌率等多種功效，備受食品和保健品行業(yè)青睞[2]。天然食物中含有大量葉黃素，但其高度疏水難以滲入水基食品中，生物利用率低，易受熱、光照、氧化降解[3]，導致生物活性喪失以及色澤改變，限制其在食品中的應用。

近年來，許多國家已經(jīng)致力于開發(fā)親脂性生物活性化合物的可食用輸送系統(tǒng)，乳液作為親脂性活性物質(zhì)輸送體系具有明顯的優(yōu)勢[4]。蛋白質(zhì)是一種可再生和具有表面活性的天然分子，能在油水界面上形成吸附層，延遲乳液相分離[5]。常用的蛋白質(zhì)乳化劑主要包括乳蛋白[6]和植物蛋白[7]。采用乳脂小球膜蛋白乳液負載β-胡蘿卜素，經(jīng)85 ℃處理90 min，乳液中β-胡蘿卜素降解量比β-胡蘿卜素直接熱處理的降解量減少60%[8]。將番茄紅素包埋在酪蛋白和豌豆蛋白復合乳液中可以提高番茄紅素的穩(wěn)定性[9]。與植物蛋白和乳蛋白相比，羅非魚分離蛋白(tilapia protein isolate，TPI)營養(yǎng)價值高，易消化，是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的主要來源[10]。酸堿法提取TPI具有提取率高的優(yōu)點，分離出的TPI含有肌球蛋白、肌動蛋白和小分子的水溶性肌漿蛋白[11]。但由于TPI的溶解性較差，對其乳化性能的研究較少。近年來，有研究表明魚類蛋白是一種潛在的乳化劑，可抵抗油滴絮凝且在乳液中起抑制脂質(zhì)氧化作用[12]。超聲波處理[13]和超高壓處理[14]能改善魚蛋白的理化特性和提高水包油乳液的穩(wěn)定性。因此，開發(fā)TPI乳液遞送系統(tǒng)來負載葉黃素，保護和有效遞送葉黃素，提高葉黃素的穩(wěn)定性和生物利用率勢在必行。

乳液的穩(wěn)定性很大程度上取決于形成的界面涂層的特性，例如厚度、電荷、疏水性和暴露的化學反應基團和環(huán)境條件(例如pH、離子強度、溫度)[15]。熱處理是食品加工過程中常見的加工手段，與蛋白質(zhì)的乳化性息息相關。MA等[16]研究表明熱處理能促進鱈魚蛋白的界面吸附，粒徑減小以及改善其乳化特性。ELIAS等[17]研究了熱加工(95 ℃處理30 min)對β乳球蛋白水包油乳液抑制油脂氧化效果最好。30 ℃和50 ℃熱處理能使大豆油脂體乳液表面蛋白分子部分疏水性基團暴露，提高油脂體表面蛋白在油-水界面的吸附，增加乳液的界面強度[18]。此外，有研究表明負載葉黃素的酪蛋白酸鈉乳液的熱穩(wěn)定性好，60～100 ℃熱處理對其物理化學穩(wěn)定性影響不大[19]。YE等[20]研究通過動態(tài)消化模型發(fā)現(xiàn)90 ℃加熱20 min處理的乳清分離蛋白乳液比未經(jīng)熱處理的乳液游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)釋放量大。熱處理影響乳液的絮凝和聚結，乳液的穩(wěn)定性又會對其消化性能有顯著的影響[21]。目前熱處理對負載葉黃素的羅非魚蛋白乳液穩(wěn)定性及體外消化的相關研究較少，還需進一步探究。

本文探討熱處理對負載葉黃素的TPI乳液的影響，有助于進一步開發(fā)蛋白質(zhì)和提高產(chǎn)品的商業(yè)價值。因此本研究構建負載葉黃素的TPI乳液，分析了熱處理(60、70、80、90 ℃，30 min)對乳液體系的穩(wěn)定性和體外消化的影響，旨在開發(fā)穩(wěn)定的乳液輸送系統(tǒng)，進一步拓寬葉黃素在食品領域的應用，滿足人們對葉黃素的需求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗材料

羅非魚，湛江東風市場；玉米油，益海嘉里有限公司；葉黃素(純度≥90%，HPLC級)、胃蛋白酶(15 000 U/mg)、豬膽鹽(膽酸含量≥60%)、胰脂肪酶(30 000 U/g)，上海源葉生物科技有限公司；尼羅紅，上海麥克林生化科技有限公司；尼羅藍，美國Sigma試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設備

Avanti J-26 sxp落地高速冷凍離心機，美國Beckman公司；VAP-450自動凱氏定氮儀，德國Gerhardf公司；MARSIII模塊化高級流變儀，美國Thermo儀器公司；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯儀器公司；NanoBrook Omni激光粒度及zeta電位儀，美國布魯克海文儀器公司；超高壓納米均質(zhì)機，加拿大ATS儀器公司；Cintra1010紫外分光光度計，澳大利亞GBC儀器公司；ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機，德國Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen公司；DF-101S恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TPI的提取

取鮮活羅非魚背部白肉絞碎，按照1∶9(g∶mL)比例與冰蒸餾水混合，用勻漿機攪拌3 min，用濃度為1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至11.0，磁力攪拌提取15 min后離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)。將離心后的上清液通過8層紗布過濾，過濾后的濾液用濃度為1 mol/L HCl調(diào)節(jié)過濾液pH值至5.5，再離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)。用冰蒸餾水分散離心所得的蛋白沉淀，pH值調(diào)至7.0，透析后冷凍干燥成蛋白粉末備用。參考GB 5009.5—2016測TPI的粗蛋白質(zhì)含量為(96.05±0.76)%。

1.2.2 乳液的制備

將TPI粉末分散到冰蒸餾水中配制質(zhì)量濃度為10 g/L 的TPI蛋白溶液，冰水浴下用磁力攪拌器攪拌2 h使之完全溶解，調(diào)整TPI溶液的pH為7.0。添加0.2%(質(zhì)量分數(shù))葉黃素于玉米油中，4 ℃避光攪拌使之完全溶解。將TPI蛋白溶液與葉黃素玉米油按質(zhì)量比9∶1混合，12 000 r/min高速剪切2 min獲得粗乳液。粗乳液于60 MPa，4 ℃高壓均質(zhì)5次獲得細乳液。新制備的乳液轉(zhuǎn)移到棕色離心管中，分別于60、70、80、90 ℃ 水浴加熱30 min，冷卻至室溫，對照組不加熱，所有樣品貯藏于4 ℃進行乳液穩(wěn)定性測定。

1.2.3 粒徑和電位的測定

將新鮮制備的乳液稀釋300倍避免多重散射，利用激光粒度及zeta電位儀測定不同溫度處理后乳液的粒徑和電位。葉黃素乳液于4 ℃貯藏28 d，每7 d取1次樣測定其平均粒徑。

1.2.4 黏度的測定

取2 mL葉黃素乳液于間隔為1 mm、探頭型號P35TiL、直徑60 mm的平行板上，溫度設定在25 ℃，測定0.1～100 s-1的剪切速率對乳液的黏度影響，記錄乳液的初始黏度。

1.2.5 葉黃素含量的測定

參考李季楠等[22]的測定方法，以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為2～10 μg/mL的葉黃素溶液，于460 nm測定吸光度，繪制標準曲線(y=0.105 2x-0.000 7，R2=0.999 3)。取400 μL葉黃素乳液于5 mL離心管中，加入3 mL DMSO進行振蕩溶解，以無負載葉黃素的乳液作對照，于460 nm下測定吸光度值，代入標準曲線計算葉黃素的質(zhì)量濃度(μg/mL)。

1.2.6 乳析指數(shù)的測定

乳液的乳析指數(shù)是一個直觀反映乳液穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)乳化能力的參數(shù)。根據(jù)SURH等[23]的方法略有改動，測定葉黃素乳液的乳析指數(shù)。將乳液密封于50 mL玻璃瓶中(內(nèi)徑2.5 cm，高度6.0 cm)，于4 ℃下貯藏。測定乳液貯藏28 d的乳析指數(shù)和實物圖拍照。記錄乳液析出清液層的高度(Hs)和乳液總高度(Ht)，乳析指數(shù)(CI)計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.7 微觀結構的測定

參考LIU等[21]的方法進行測定。分別取30 μL不同熱處理的乳液于離心管中，同時加入10 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的尼羅紅染液(甲醇溶解)和10 μL質(zhì)量濃度為10 g/L的尼羅藍染液(蒸餾水溶解)，在暗處反應15 min后取10 μL混合液于載玻片上，蓋上蓋玻片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡在100×油鏡下觀察，拍照分辨率為1 024×1 024。尼羅藍染液對蛋白質(zhì)進行染色(在激發(fā)波長為633 nm和檢測波長為618～710 nm的激光下)觀察，尼羅紅染液對油相進行染色(在激發(fā)波長488 nm和檢測波長為580～620 nm下)觀察。

1.2.8 構建體外模擬消化體系

參考ARIADNA等[24]方法構建胃和腸2個階段的體外模擬消化，具體如下：

模擬胃消化階段：取15 mL乳液樣品與15 mL胃消化液(含2 mg/mL NaCl+7 mg/mL HCl+3.2 mg/mL胃蛋白酶)，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至2.0，于恒溫水浴磁力攪拌器(37 ℃、105 r/min)反應2 h。

模擬腸消化階段：將30 mL胃消化液樣品用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，加入3.5 mL豬膽鹽提取物(質(zhì)量濃度為54 mg/mL)和1.5 mL鹽溶液(含10 mmol/L CaCl2和150 mmol/L NaCl)，用1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，加入2.5 mL胰脂肪酶(用0.1 mol/L PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為75 mg/mL)，于恒溫水浴磁力攪拌器(37 ℃、105 r/min)反應2 h，每隔30 min用0.1 mol/L NaOH滴定至pH至7.0。

1.2.8.1 FFA釋放量的測定

腸消化過程中，每隔30 min測量滴定消耗的NaOH體積，葉黃素乳液體系FFA釋放量計算如公式(2)所示：

(2)

式中：VNaOH為產(chǎn)生FFA所消耗的NaOH體積,mL;CNaOH為NaOH溶液的濃度,mol/mL;M玉米油為玉米油的平均分子質(zhì)量,g/mol;w玉米油為最初乳液中油的質(zhì)量,g。

1.2.8.2 生物利用率的測定

將不同溫度處理后葉黃素乳液經(jīng)過模擬胃和腸階段體外消化后，消化液經(jīng)離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)后分3層：上層為胃消化后油形成的乳化層；中間層為消化后負載葉黃素可被吸收的膠束層；底層為未消化的蛋白質(zhì)、膽鹽等沉淀物質(zhì)。用注射器將膠束層取出并通過0.22 μm的濾膜過濾，測定膠束層的葉黃素含量，方法見1.2.5。葉黃素乳液經(jīng)消化后的生物利用率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：AL代表膠束中葉黃素的含量;A代表乳液中葉黃素的總含量。

1.2.8.3 消化液粒徑和zeta電位的測定

將消化過程中的胃消化液和不同時間段的腸消化液稀釋100倍，利用激光粒度和zeta電位儀測定葉黃素乳液不同消化階段的粒徑和電位。

1.2.8.4 消化液微觀結構的觀察

分別取出消化過程中的胃消化液和不同時間段的腸消化液30 μL于離心管中，加入尼羅紅和尼羅藍染液，具體方法同1.2.7。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用Origin 9.0軟件作圖，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用SPSS Statistics 24.0軟件進行方差分析(ANOVA)，并且通過Duncan的多范圍檢驗各個平均值之間的顯著差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 熱處理對乳液粒徑的影響

乳液液滴大小影響乳液的絮凝和聚集。從動力學的角度分析，液滴越小，在聚集速度相同的情況下，乳液分層所需時間越長[25]。對負載葉黃素的TPI乳液進行熱處理，其乳液粒徑的變化如圖1。未負載葉黃素的TPI乳液的初始粒徑為(643.36±38.53) nm(結果未在圖中列出)，負載葉黃素后TPI乳液的初始粒徑增大，初始粒徑為(771.37±28.4) nm，在 4 ℃ 條件下貯存7 d，粒徑迅速增大(P<0.05)。經(jīng)熱處理后，乳液粒徑顯著減小(P<0.05)。在實驗范圍內(nèi)，隨著熱處理溫度升高，乳液粒徑呈先減小后逐漸增加的趨勢，70 ℃熱處理30 min后的葉黃素乳液的粒徑最小[(490.33±8.42) nm]；而熱處理溫度達到80 ℃后，乳液粒徑增大。熱處理使蛋白質(zhì)發(fā)生亞基的解離和分子的伸展，將原來被掩蓋的一些非極性基團暴露在界面，蛋白質(zhì)與油滴結合作用增強，乳液液滴減小[18]。熱處理能夠使大豆蛋白構象打開，有利于蛋白質(zhì)與磷脂結合，當溫度達到90 ℃時，可溶性蛋白含量降低，經(jīng)90 ℃熱處理改善負載葉黃素的TPI乳液穩(wěn)定性的效果不明顯[26]。此外，乳液顆粒的大小也與界面蛋白的表面電荷密度和靜電斥力相關，熱處理能使蛋白質(zhì)分子變性，結構展開，疏水基團暴露，表面電荷和靜電斥力增加，減少乳液液滴聚集[27]。隨著貯藏時間的增加，對照組的葉黃素乳液28 d粒徑增加至4 158.58 nm，而70 ℃加熱的葉黃素乳液粒徑變化最小，說明乳液穩(wěn)定性好。

圖1 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液粒徑的影響Fig.1 Effect of heat treatment on the particle size of lutein loaded TPI emulsion注：不同大寫字母表示同一熱處理的乳液在不同貯藏時間之間的差異顯著(P <0.05)；不同小寫字母表示在相同貯藏時間下不同熱處理乳液之間差異顯著(P <0.05)

2.2 熱處理對乳液電位和黏度的影響

zeta電位是表征蛋白質(zhì)表面電荷量，可作為衡量乳液體系潛在穩(wěn)定性的指標[28]。如表1所示，未負載葉黃素的TPI乳液表面電位值為(-18.55±1.26) mV，負載葉黃素后TPI乳液的表面電位值為(-17.13±2.24) mV。經(jīng)熱處理后，乳液帶負電荷不變，說明熱處理不會改變界面蛋白的電荷類型，而經(jīng)過熱處理后，負載葉黃素的TPI乳液電位的絕對值均顯著增加(P<0.05)。乳液界面蛋白電荷量的增加，說明液滴之間的靜電斥力增強從而防止液滴聚集[22]，形成更穩(wěn)定的乳液體系。這是因為溫度超過TPI的變性溫度(肌球蛋白的熱變性溫度在40～50 ℃，肌漿蛋白的熱變性溫度為55 ℃左右，肌動蛋白的熱變性溫度高達70～80 ℃[29])會導致蛋白質(zhì)分子的展開和嵌入在內(nèi)部的帶電基團和氨基酸殘基的暴露[30]，從而增加界面蛋白的表面電荷。有研究表明，氨基酸殘基的暴露增加了蛋白質(zhì)的表面活性，進而影響蛋白質(zhì)與磷脂之間的結合能力，而未加熱處理的蛋白質(zhì)結構緊密，疏水基團埋藏在分子內(nèi)部，與磷脂結合能力較差[31]。

表1 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液電位和黏度的影響Table 1 Effect of heat treatment on potential and viscosity of lutein loaded TPI emulsion

界面的流變學特性，例如黏度和彈性，會影響乳液的穩(wěn)定性和功能特性，可用于提供有關界面層內(nèi)表面活性分子相互作用的有價值信息。熱處理后負載葉黃素的TPI乳液黏度顯著增強(P<0.05)。熱處理后，蛋白質(zhì)結構展開，更加緊密結合在一起，在葉黃素油滴表面形成緊密的包裹層，油水界面處蛋白質(zhì)的共吸附會增加黏度[32]。其次可能是葉黃素油滴與蛋白質(zhì)之間的結合作用強，在剪切力的作用下具有較高的黏度。分子間和分子內(nèi)相互作用增強，增強乳液抗流動性，阻止油滴上浮。乳液油水界面黏度與乳滴發(fā)生絮凝時間相關，熱處理后的乳液油水界面黏度越大，形成的乳液也越穩(wěn)定。

2.3 熱處理對乳液中葉黃素含量的影響

添加含0.2%(質(zhì)量分數(shù))的葉黃素的玉米油于TPI溶液中，油水體積比1∶9，高壓均質(zhì)制備負載葉黃素的TPI乳液，乳液中葉黃素的理論含量為200 μg/mL。經(jīng)檢測，未經(jīng)熱處理的負載葉黃素的TPI乳液中葉黃素含量為(193.99±1.64) μg/mL，接近添加的理論值，表明乳液制備過程中葉黃素損失較小。與對照組比較，負載葉黃素的TPI乳液經(jīng)60～80 ℃熱處理30 min，葉黃素含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。當熱處理溫度達到90 ℃，乳液體系中葉黃素的含量顯著降低(P<0.05)，降解量為15%，表明熱處理后蛋白質(zhì)結構展開后在界面上構象重排，界面強度增加[18]，具有一定的熱抵抗能力。TPI乳液體系能作為界面屏障阻礙葉黃素與外界環(huán)境直接接觸，避免葉黃素在高溫下發(fā)生降解。當溫度超過80 ℃，由于溫度過高，葉黃素會發(fā)生一定程度的降解[33]。這個結果與李季楠等[22]的結果一致，負載葉黃素酪蛋白乳液經(jīng)60 ℃與80 ℃加熱處理30 min葉黃素含量沒有顯著性變化，溫度達到100 ℃葉黃素降解8.35%。因此，TPI乳液體系對葉黃素具有保護作用，能增加葉黃素的熱穩(wěn)定性。

圖2 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液葉黃素含量的影響Fig.2 Effect of heat treatment on lutein content in lutein loaded TPI emulsion注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 熱處理對乳液乳析指數(shù)的影響

乳液在貯存過程中會因失穩(wěn)而出現(xiàn)分層現(xiàn)象。圖3和圖4分別是不同熱處理后負載葉黃素的TPI乳液4 ℃ 靜置28 d的乳析指數(shù)圖和直觀圖。未經(jīng)熱處理的負載葉黃素的TPI乳貯存第3天就出現(xiàn)乳液析出現(xiàn)象，第7天底部明顯析出水層，第28天乳液乳析指數(shù)達(56.67±1.36)%，乳液底部出現(xiàn)分層和上層色素析出，說明未經(jīng)熱處理的葉黃素乳液穩(wěn)定性差而出現(xiàn)相分離。重力分離是食品乳液中最常見的不穩(wěn)定形式之一。由于布朗運動，重力等因素的影響，乳液中的液滴處于連續(xù)運動狀態(tài)而發(fā)生相互碰撞的現(xiàn)象[15]。較大顆粒的液滴比較小的液滴移動更快，發(fā)生聚集的現(xiàn)象就越明顯，因此對照組的乳液粒徑大，乳液不穩(wěn)定，出現(xiàn)分層現(xiàn)象。60～90 ℃處理的葉黃素乳液貯存28 d仍保持穩(wěn)定，無分層的現(xiàn)象。一方面可能是乳液加熱后黏度增加，以致液滴的運動受到嚴重阻礙，即降低了碰撞頻率。另一方面可能是液滴表面帶同種電荷數(shù)量增加，液滴之間的靜電斥力增加，減少相互聚集。此結果再一次證明熱處理能夠改善負載葉黃素的TPI乳液的穩(wěn)定性，延長乳液的貯藏期。

圖3 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液乳析指數(shù)的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the creaming index of lutein loaded TPI emulsion

圖4 負載葉黃素的TPI乳液貯存過程中的直觀圖Fig.4 Visual appearance of lutein loaded TPI emulsion during storage

2.5 熱處理對乳液微觀結構的影響

乳液的絮凝和聚集速率與油滴的分布情況和大小有關，可以通過激光共聚焦對其微觀結構進行觀察[34]。如圖5所示，液滴基本都是呈現(xiàn)球狀，且蛋白質(zhì)成功包裹在油滴外部。對照組乳液液滴聚結，顆粒較大且不規(guī)則。60～80 ℃熱處理后明顯看出液滴顆粒減小且分布均勻。90 ℃處理后葉黃素乳液顆粒比對照組小但部分液滴呈簇狀，形成較小絮凝顆粒。因此，未經(jīng)處理的葉黃素乳液易于聚結，60～80 ℃熱處理有利于液滴分散，而溫度過高的熱處理會增加乳液的絮凝程度。

圖5 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液微觀結構的影響Fig.5 Effect of heat treatment on microstructure of lutein loaded TPI emulsion

2.6 熱處理對乳液體外消化的影響

2.6.1 FFA釋放量和生物利用率的變化

FFA釋放量曲線可用于比較脂質(zhì)的消化速率和消化程度。由圖6可知，在腸消化60 min內(nèi)FFA迅速釋放(70%～80%)，60 min后釋放速度減慢，并在2 h后基本達到平穩(wěn)狀態(tài)。葉黃素乳液FFA釋放量大小分別為：70 ℃>60 ℃>對照組>80 ℃>90 ℃ 處理的乳液。60與70 ℃熱處理的乳液FFA釋放總量比對照組高，可能是因為蛋白質(zhì)的折疊結構對胃蛋白酶具有抵抗作用[35]，加熱的乳液蛋白變性，結構展開解折疊[29]，在胃階段變性的界面蛋白更容易被胃蛋白酶解離為肽，具有更高的水解性且易于在腸階段與膽鹽結合[20]。當溫度到達80 ℃，蛋白質(zhì)完全變性[36]，溫度過高乳液液滴部分絮凝，因此80 ℃和90 ℃ 熱處理的FFA釋放總量反而比對照組低。腸消化30 min，可見FFA的釋放速率分別為：70 ℃>60 ℃>90 ℃>80 ℃>對照組乳液。70 ℃熱處理后的葉黃素乳液經(jīng)過消化后FFA的釋放速率最快，對應的脂肪的消化率最高達(94.22±2.67)%。這可能與熱處理后乳液粒徑變小有關，圖1已表明，70 ℃處理的葉黃素乳液粒徑最小。先前的研究表明，隨著油滴尺寸的減小，單位時間內(nèi)FFA的釋放量會增加，這是因為與脂肪酶的接觸面積大，有利于脂肪的水解[37]。因此可以通過熱處理溫度的高低來控制羅非魚蛋白穩(wěn)定的乳液在腸道中的脂質(zhì)消化速率。由圖7可知，對照組乳液經(jīng)過腸胃消化后最終的生物利用率為(18.65±1.06)%，經(jīng)過60、70、80、90 ℃熱處理后的乳液生物利用率分別為(32.33±3.63)%、(35.69±2.06)%、(32.14±1.52)%、(21.13±0.32)%，說明熱處理能夠有效改善葉黃素的生物利用率。有研究表明，生物活性物質(zhì)的消化性能受各種因素的影響，如滴尺寸、界面的組成和結構以及連續(xù)相的黏度[38]。熱處理能夠改變界面蛋白質(zhì)的結構，進而影響脂肪酶與界面吸附層的相互作用，加快油脂的釋放速度[20]。

圖6 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液FFA釋放量的影響Fig.6 Effects of heat treatment on the release of free fatty acids in lutein loaded TPI emulsion

圖7 熱處理對負載葉黃素的TPI乳液生物利用率的影響Fig.7 Effect of heat treatment on bioavailability of lutein loaded TPI emulsion

2.6.2 模擬體外消化過程中粒徑和電位的變化

在整個模擬體外消化過程中，乳液粒徑呈先增大后減小趨勢。胃階段，不同溫度熱處理乳液之間的粒徑大小沒有顯著性差異(圖8)，負載葉黃素的TPI乳液在腸消化30～60 min的粒徑均明顯比胃階段的粒徑大。通過激光共聚焦顯微鏡圖像(圖9)觀察到乳液經(jīng)腸消化60 min液滴明顯發(fā)生聚結。胃消化到腸消化過程的轉(zhuǎn)變伴隨著pH的變化，對蛋白質(zhì)的影響很大，界面上蛋白質(zhì)被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，從而影響脂肪發(fā)生聚集。此外，靜電斥力和空間位阻的降低而在液滴聚集中起著至關重要的作用，如圖9所示，隨著消化的進行，乳液表面凈電荷不斷增加，靜電斥力和空間位阻增強，脂肪液滴的尺寸減小[8]。激光掃描共聚焦顯微圖像表明，油滴外層綠色的蛋白質(zhì)層含量隨著消化時間的進行逐漸減少，說明蛋白質(zhì)被酶水解，葉黃素和內(nèi)部油相被釋放出來。

圖8 負載葉黃素的TPI乳液在模擬胃腸消化過程粒徑的變化Fig.8 Changes in particle size of lutein loaded TPI emulaion during simulated gastrointestinal digestion注：不同大寫字母表示相同消化階段不同熱處理之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一熱處理不同消化階段之間差異顯著(P<0.05)(下同)

圖9 負載葉黃素的TPI乳液在模擬胃腸消化過程微觀結構的變化Fig.9 Microstructure changes of lutein loaded TPI emulaion during simulated gastrointestinal digestion

圖10 負載葉黃素的TPI乳液在模擬胃腸消化過程電位的變化Fig.10 Potential changes of lutein loaded TPI emulaion during simulated gastrointestinal digestion

3 結論

本研究探討熱處理(60、70、80、90 ℃，30 min)對負載葉黃素的羅非魚蛋白乳液穩(wěn)定性和體外消化的影響。結果表明熱處理能有效減小負載葉黃素的TPI乳液粒徑(P<0.05)，增大乳液的表面凈電荷和黏度(P<0.05)，延緩液滴的絮凝和聚結以及延長乳液貯藏時間。加熱溫度控制在80 ℃以內(nèi)不會對乳液負載的葉黃素造成破壞。其中，負載葉黃素的TPI乳液經(jīng)70 ℃加熱30 min效果最好，乳液粒徑最小為(490.33±8.42) nm，乳液經(jīng)腸胃消化后具有最高的生物利用率為(35.69±2.06)%。可以通過控制熱處理溫度來控制羅非魚蛋白穩(wěn)定的葉黃素乳液在腸道中的脂質(zhì)消化速率。總之，熱處理改善葉黃素乳液的穩(wěn)定性和體外消化的機理還要從結構層面進一步探究，通過熱處理改善TPI乳液體系穩(wěn)定性及為葉黃素在食品加工中的應用提供借鑒與指導。