南極磷蝦油對(duì)衰老模型小鼠抗氧化作用的研究

李輝，王廉馨，韓昀穌，林丹妮，曲麗娜

1(遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110036)2(大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院，遼寧 大連，116033)

研究表明，人體中95%的自由基是氧自由基，其來(lái)源主要分為輻射、藥物、酒精等外源性自由基和機(jī)體自身代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基兩方面，如自由基產(chǎn)生過(guò)多而不能及時(shí)清除，會(huì)通過(guò)氧化作用攻擊機(jī)體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、糖類及脂肪等大分子物質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致機(jī)體的組織損傷和退行性變化[1]。因此，防止自由基引起的氧化損傷，有效抑制過(guò)氧化的發(fā)生，一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

南極磷蝦分布在環(huán)南極海域，蘊(yùn)藏量巨大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其生物量約為6.5～10億t[2-3]，并具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中，以南極磷蝦為原料提取的南極磷蝦油(antarctic krill oil,AKO)，含有豐富的磷脂、蝦青素、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、類黃酮、維生素A、維生素E等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其磷脂含量高達(dá)40%，蝦青素含量在40～100 mg/kg[4-5]，其ω-3脂肪酸與磷脂結(jié)合，生物利用率較高[6-7]。研究表明，南極磷蝦油具有促進(jìn)大腦神經(jīng)發(fā)育、提高記憶力、降低血糖和血脂、改善心血管疾病和防止動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)骨骼關(guān)節(jié)等保健功效[5,8-10],然而對(duì)南極磷蝦油的抗氧化作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建小鼠衰老模型，考察南極磷蝦油對(duì)小鼠的抗氧化作用的影響，為開發(fā)南極磷蝦油類保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

南極磷蝦油由遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)癌癥研究學(xué)會(huì)(institute of cancer research，ICR)雄性小鼠，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。衰老模型小鼠：SPF級(jí)ICR雄性8～10月齡小鼠；動(dòng)物飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

受試小鼠在清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)觀察7 d，未見異常后眼內(nèi)眥取血測(cè)定血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。根據(jù)MDA含量將小鼠分層隨機(jī)分成4個(gè)組，每組10只，并適當(dāng)調(diào)整，使各組的平均體重接近均衡。根據(jù)樣品的人體推薦量5、10、30倍分別設(shè)置0.075 g/kg·BW低劑量實(shí)驗(yàn)組(L-AKO)、0.150 g/kg·BW中劑量實(shí)驗(yàn)組(M-AKO)和0.450 g/kg·BW高劑量實(shí)驗(yàn)組(H-AKO)，同時(shí)設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照組，每組10只小鼠。

1.4 試劑與儀器

MDA、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl，PCO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BSA124S-CW型賽多利斯精密天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；UV-2700型島津紫外分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；JW-3021HR型安徽嘉文高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；HH-4型常州萬(wàn)豐恒溫水浴鍋，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)“國(guó)食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)”文中頒布的《抗氧化評(píng)價(jià)方法》的要求，以MDA、GSH、SOD和PCO為考察指標(biāo)。

分別取南極磷蝦油1.50、3.00、9.00 g，用玉米胚芽油定容至200 mL，對(duì)照組給予等體積玉米胚芽油，分別給予受試動(dòng)物灌胃，灌胃體積為0.1 mL/10 g·BW，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。

30 d后，將老齡小鼠稱重，采尾尖血20 μL加入0.48 mL 蒸餾水制成體積分?jǐn)?shù)為4%的溶血液，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定過(guò)氧化脂質(zhì)(lipid peroxide，LPO)降解產(chǎn)物MDA含量、全血抗氧化物質(zhì)GSH含量；摘眼球采血離心，取血清按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD活力、PCO含量。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0和Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦油對(duì)實(shí)驗(yàn)前后小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠體重?zé)o明顯區(qū)別，實(shí)驗(yàn)中期和實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诟鲃┝繉?shí)驗(yàn)組小鼠的體重和增重，與陰性對(duì)照組相比，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、圖2)，且在實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠生活飲食等未有異常表現(xiàn)，表明南極磷蝦油對(duì)衰老模型小鼠體重?zé)o明顯影響(表1)。

a-0 d；b-15 d；c-30 d圖1 不同時(shí)間小鼠體重情況Fig.1 Body weight of mice at different times注：NS表示無(wú)顯著相互差異(P>0.05)(下同)

a-體重增長(zhǎng)量；b-體重圖2 小鼠體重增加情況Fig.2 Body weight gain of mice

表1 南極磷蝦油對(duì)各組老齡小鼠的體重影響Table 1 The effect on the weight of aged mice in each group

2.2 南極磷蝦油對(duì)老齡小鼠血清中LPO的影響

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠血清中LPO含量均衡，各組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诮Y(jié)果表明各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清的LPO含量均低于陰性對(duì)照組，其中，中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較，均有顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明受試物具有降低衰老模型小鼠的血清中LPO含量的作用(表2)。

a-0 d;b-30 d圖3 血清LPO含量測(cè)定Fig.3 Determination of serum LPO content注：*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異顯著(P<0.01)(下同)

表2 南極磷蝦油對(duì)各組老齡小鼠血清中LPO(以MDA計(jì))含量的影響Table 2 The content of LPO (calculated by MDA) in serum of aged mice in each group

2.3 南極磷蝦油對(duì)老齡小鼠血清中SOD活力和GSH含量的影響

2.3.1 南極磷蝦油對(duì)小鼠血清中SOD活力的影響

SOD活力測(cè)定表明，30 d喂養(yǎng)后各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中SOD活力與陰性對(duì)照組相比均有提高，其中，中劑量組較陰性對(duì)照組SOD活力顯著增高(P<0.05)，高劑量組較陰性對(duì)照組SOD活力有極顯著增高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。結(jié)果表明受試物具有提高衰老模型小鼠的血清中SOD活力的作用(表3)。

表3 南極磷蝦油對(duì)各組老齡小鼠血清中SOD含量的影響Table 3 The content of SOD in serum of aged mice in each group

2.3.2 南極磷蝦油對(duì)小鼠血清中GSH含量的影響

GSH測(cè)定表明，各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中GSH含量與陰性對(duì)照組相比均有提高，其中，中劑量組較陰性對(duì)照組GSH含量顯著提高(P<0.05)，高劑量組較陰性對(duì)照組GSH含量有極顯著提高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。結(jié)果表明受試物具有提高衰老模型小鼠的血清中GSH含量的作用(表4)。

表4 南極磷蝦油對(duì)各組老齡小鼠血清中GSH含量的影響Table 4 The content of GSH in serum of aged mice in each group

2.4 南極磷蝦油對(duì)衰老模型小鼠血清中PCO含量的影響

PCO含量測(cè)定表明，各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中PCO含量與陰性對(duì)照組相比雖有所降低，但差別較小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)，表明受試物對(duì)老齡小鼠血清中PCO含量無(wú)明顯影響(表5)。

表5 南極磷蝦油對(duì)各組老齡小鼠血清中PCO含量Table 5 The content of PCO in serum of aged mice in each group

圖5 PCO含量測(cè)定Fig.5 PCO content determination

3 討論

自由基對(duì)脂類、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，是導(dǎo)致組織或細(xì)胞損傷等病理狀況的直接原因。在生物體內(nèi)，通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，生成LPO，其氧化終產(chǎn)物為MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，從而影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，加劇膜的損傷，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體損傷，人體衰老，因此MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過(guò)氧化損傷程度，是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)[11]。

a-SOD含量;b-GSH含量圖4 SOD活力測(cè)定與GSH含量測(cè)定Fig.4 SOD activity determination and GSH content determination

SOD和GSH是人體自身代謝過(guò)程中生成的抗氧化劑，SOD能專一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除由自由基氧化體內(nèi)的某些組分而造成的機(jī)體損害；GSH是一種非酶性抗氧化劑，對(duì)生物體氧化還原系統(tǒng)和巰基酶有活化作用，通過(guò)其巰基氧化-還原態(tài)的轉(zhuǎn)換，作為可逆的供氫體，主要在細(xì)胞內(nèi)的水相提供抗氧化保護(hù)，復(fù)活被活性氧損傷的巰基酶，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞，同時(shí)還可對(duì)抗自由基對(duì)重要臟器的損害。在成長(zhǎng)期，這些抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)合成旺盛，GSH和SOD等抗氧化劑含量很高，能抑制氧自由基產(chǎn)生，平衡人體的代謝，預(yù)防各種慢性病，而隨著細(xì)胞老化影響，其含量會(huì)大幅降低，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能衰退[12-14]。因此，SOD和GSH指標(biāo)是反映人體抗氧化功能的重要指標(biāo)。

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈中的自由氨基和亞氨基受到氧自由基攻擊生成NH3和相應(yīng)羰基衍生物的過(guò)程，PCO的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)記，通常在人體各類細(xì)胞中氧化的蛋白質(zhì)數(shù)量隨年齡呈指數(shù)上升[15]。因此PCO含量可作為反映機(jī)體蛋白質(zhì)氧化損傷的重要依據(jù)。

以自然資源篩選出抗氧化作用的天然成分作為抗氧物的補(bǔ)充是解決抗氧化問(wèn)題的有效途徑之一。南極磷蝦油是從南極磷蝦中提取的脂質(zhì)組分，是由磷脂、EPA、DHA、蝦青素、膽堿等成分組成的混合物。蝦青素具有不飽和酮基和羥基的共軛雙鍵鏈分子結(jié)構(gòu)，能提供吸引自由基的未配對(duì)電子，從而清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和增加抗氧化酶活性等[16-17]；磷脂可不同程度地提高肝臟、骨骼肌抗氧化酶的活性，對(duì)自由基的清除有促進(jìn)作用，磷脂酰膽堿可在機(jī)體內(nèi)維持SOD活性，保護(hù)脂類等分子免受氧自由基的損害[18-20]。

在本研究中，適量南極磷蝦油能顯著提高衰老模型小鼠血清SOD活力和GSH含量，顯著降低血液中LPO含量，但對(duì)PCO含量影響小。表明富含蝦青素和磷脂等大量生物活性物質(zhì)的南極磷蝦油具有明確的抗氧化的作用，這也為南極磷蝦及其深加工產(chǎn)品的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。南極磷蝦油抗氧化的作用機(jī)理機(jī)制還有待于深入研究。