褪黑素處理對草莓品質(zhì)與活性氧代謝的影響

黃鴻暉，顧里娟，李美琳，鄭永華，金 鵬*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）柔軟多汁、酸甜可口，且富含維生素、礦物質(zhì)、花青素等營養(yǎng)成分。由于果實采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝平衡被破壞，ROS會迅速累積，從而加劇細胞膜的膜脂過氧化作用，造成細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)損傷以及區(qū)域化分布體系被破壞，最終加速果實衰老。植物細胞內(nèi)已經(jīng)形成了系統(tǒng)的防御ROS、自由基毒害的機制[1]?，F(xiàn)如今也已經(jīng)出現(xiàn)了很多例如硫化氫（H2S）、外源NO、亞硝酰氫、2,4-表油菜素內(nèi)酯處理等提升草莓果實采后抗氧化能力、延緩果實品質(zhì)下降的保鮮措施，能夠延長草莓貨架期[2-5]。然而，H2S和NO等化學(xué)處理有可能會對人體有毒害作用，因此亟需尋求一種高效安全的保鮮措施。

近年來，褪黑素（melatonin，MT）作為一種綠色安全的保鮮物質(zhì)進入研究人員的視野。MT是一種內(nèi)源激素，可以在植物中或者動物的松果體中產(chǎn)生?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，許多水果和蔬菜中都產(chǎn)生內(nèi)源性褪黑激素，并且起著重要的作用。研究人員已經(jīng)在幾種水果中檢測到褪黑激素，包括香蕉[6]、草莓[7]、蘋果[8]等。已經(jīng)有文獻證明外源MT處理采后果蔬能夠維持果蔬的品質(zhì)并增加其抗氧化能力，從而延長貨架期。Gao Hui等[9]研究證實褪黑激素與植物的衰老有關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)MT處理能有效地減緩桃果實的衰老過程，主要體現(xiàn)為質(zhì)量損失減少，腐爛發(fā)生率和呼吸速率降低，并保持了硬度、總可溶性固形物和抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）含量，MT處理顯著提高了兩個品種桃果實中的過氧化物酶（peroxidase，POD）與過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的活性，降低了脂氧合酶的活性，超氧陰離子自由基（O2-·）和H2O2的水平以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，表明MT處理能維持果蔬采后的品質(zhì)并增加抗氧化能力。Ma Qiuxiang等[10]發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度500 mg/L MT處理可通過直接或間接調(diào)節(jié)細胞ROS含量來延遲木薯生理退化，且銅/鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、CAT1、谷胱甘肽過氧化物酶、CAT3和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的相對表達量受MT調(diào)控而顯著提高。但是，關(guān)于MT作為采后處理保鮮劑對草莓果實采后的保鮮效果研究很少，且缺少MT處理對采后草莓的ROS代謝的系統(tǒng)研究，因此，本研究探索了不同濃度MT處理對草莓貯藏過程中品質(zhì)和抗氧化能力的影響，并選用其最佳施用濃度處理草莓，探索其對草莓抗氧化能力的影響，為MT在草莓果實保鮮貯藏中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗中草莓品種選用‘紅顏’（Fragaria ananassaDuch.cv.Benihoppe），于江蘇省南京市鎖石生態(tài)園采摘， 并在采后2 h內(nèi)運回實驗室。采摘草莓的成熟度為七成熟，單果質(zhì)量約20 g，采摘時排除任何有明顯機械損傷或者病害的水果。

丙酮、乙酸、乙醇、H2O2、四氯化鈦 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈉、硫酸、聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通（Triton X-100） 北京索萊寶科技有限公司；MT、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、水楊酸、鹽酸羥胺、二硝基苯甲酸 上海麥格林生化科技有限公司；甲硫氨酸、核黃素、氮藍四唑 上海瑞永生物科技有限公司；硫酸亞鐵 薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；硫代巴比妥酸、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三氯乙酸 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Minolta CR-400色度計 日本柯尼卡美能達傳感技術(shù)有限公司；14081S手持阿貝折光儀 日本Atago公司；UV-1600型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；GL-20GH冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠； DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司： FA1104電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司； TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；DRWM型低溫人工氣候箱 寧波市江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草莓常溫保鮮實驗

將采摘后的草莓整齊排列在實驗臺上，散去田間熱。將草莓隨機分為4 組，分別用蒸餾水（對照）和100、300、500 μmol/L MT浸泡處理5 min，處理后將水果輕放在實驗臺上，并在室溫下晾干。將再將果實分裝于透明塑料盒（20 cm×12 cm×8 cm）內(nèi)，每盒裝6 顆草莓，并在塑料盒外套上0.01 mm厚的聚乙烯保鮮袋。在（20±1）℃，相對濕度90%～95%的恒溫培養(yǎng)箱中避光貯藏6 d后取樣，檢查腐爛情況并測定腐爛指數(shù)、硬度、可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)、ASA含量。每組選用100 個果實，3 次重復(fù)。

1.3.2 低溫保鮮實驗

利用常溫保鮮實驗的結(jié)果篩選出最佳濃度進行低溫保鮮實驗，分為兩組。MT處理組：以常溫保鮮實驗獲得的最佳濃度MT浸泡草莓5 min。對照組：用蒸餾水浸泡草莓5 min。其余實驗操作與1.3.1節(jié)常溫保鮮實驗中相同，在（4±1）℃下貯藏12 d，每3 d取樣測定腐爛指數(shù)，然后用液氮速凍剩余果實，得到冷凍草莓樣品，在-80 ℃下保存?zhèn)溆?。每組各選用300 個果實，3 次重復(fù)。

1.3.3 腐爛指數(shù)的測定

參考Aghdam等[7]的方法，將草莓腐爛程度分為5 個等級：0級：無腐爛；1級：腐爛面積占果實表面的1%～20%；2級：腐爛面積占21%～40%；3級：腐爛面積占41%～60%；4級：腐爛面積占61%～80%。根據(jù)所取樣品腐爛程度的統(tǒng)計結(jié)果，統(tǒng)計每組20 個草莓腐爛情況，重復(fù)3 次，并按式（1）計算腐爛指數(shù)。

1.3.4 硬度與可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的測定

用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀測定草莓的硬度。測定參數(shù)設(shè)置：力量感應(yīng)元50 N、圓柱形探頭直徑5 mm、觸發(fā)力0.5 N、下壓距離5.0 mm、下壓速率2.0 mm/s、測試速率1.0 mm/s、回程速率3.0 mm/s。重復(fù)測定10 次，單位為N。

可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)用手持阿貝折光儀測定，重復(fù)測定10 次。

1.3.5 抗壞血酸含量的測定

ASA含量的測定參考文獻[11]。以ASA為標準物質(zhì)構(gòu)建標準曲線，單位為 mg/100 g。

1.3.6 丙二醛、H2O2含量與O2

-·生成速率的測定

MDA含量的測定參考文獻[12]。稱取1 g 由1.3.2節(jié)獲得的草莓凍樣，加入5 mL三氯乙酸提取液研磨勻漿，低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后得到上清液備用。取2 mL上清液液于玻璃試管，加入2 mL 質(zhì)量分數(shù)0.67%的硫代巴比妥酸溶液，保鮮膜封口，沸水浴20 min后冷卻并測定在450、532 nm和600 nm波長處的吸光度A450nm、A532nm、A600nm，按式（2）計算MDA含量，單位為μmol/g。

H2O2含量的測定參照文獻[13]的方法，單位為μmol/g。

O2-·生成速率的測定參照文獻[14]，單位 為nmol/（min·g）。

1.3.7 活性氧代謝相關(guān)酶活力的測定

SOD活力的測定參照文獻[15]的方法。以1 min內(nèi)反應(yīng)體系在560 nm波長處對氮藍四唑光化還原的抑制為50%時所需的酶量為1 個活力單位，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計，表示為U/mg。

POD活力的測定參照文獻[16]，CAT活力的測定參照文獻[17]，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參照文獻[18]，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計，表示為U/mg。

1.3.8 谷胱甘肽含量的測定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測定參考曹建康等[13]的方法。

1.3.9 自由基清除率的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測定參照文獻[19]并稍作修改。將1 g冷凍草莓樣品用5 mL 50%乙醇研磨勻漿，然后在低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后制得上清液備用。取50 μL上清液加入到2.45 μL 1.27×10－4μmol/L的DPPH-乙醇溶液中，混勻后，室溫下放置20 min，測定在517 nm波長處的吸光度A樣品，空白組以50%乙醇代替樣品，測得517 nm處吸光度A空白， 按式（3）計算DPPH自由基清除率。

ABTS陽離子自由基清除率的測定參考文獻[20]并稍作修改。ABTS陽離子自由基工作液的配制：將10 mL 8 mmol/L的ABTS與176 μL 158 mmol/L的K2S2O8混合，暗處靜置12 h以上，得到ABTS陽離子自由基母液。取1 mL母液，稀釋60 倍左右使得400 nm波長處吸光度為0.7～0.9，得到ABTS陽離子自由基工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取1 g冷凍草莓樣品，加入5 mL 95%乙醇研磨勻漿，低溫離心后（12 000×g、4 ℃，20 min）取上清液備用。取3 mL ABTS陽離子自由基工作液與0.033 mL上清液混合均勻，在常溫下于暗處放置10 min，測定在734 nm波長處的吸光度A樣品，空白組以95%乙醇代替樣品，測定734 nm處的吸光度A空白，按式（4）計算ABTS陽離子自由基清除率。

羥自由基清除率測定參考文獻[21]并稍作修改。取1 g冷凍樣品，加5 mL 50%乙醇研磨至勻漿，低溫離心（12 000×g、4 ℃，20 min）后取上清液備用。反應(yīng)體系為1.5 mL 0.18 mol/L的水楊酸-乙醇溶液，2 mL 0.18 mol/L的硫酸亞鐵溶液，0.02 mL 0.1% H2O2溶液，上清液0.1 mL。在510 nm波長處測定吸光度A。對照組1以50%乙醇溶液代替上清液得吸光度A0，對照組2以純乙醇溶液代替硫酸亞鐵溶液得吸光度Ax，按式（5）計算羥自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個指標測定3 個平行樣，重復(fù)測定3 次。采用Origin 2018進行作圖，采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度MT處理對常溫貯藏草莓品質(zhì)的影響

如表1所示，不同濃度的MT均可以延緩草莓的腐爛，300 μmol/L MT處理的草莓在6 d后的腐爛指數(shù)為44.94%，顯著低于其他處理組（P＜0.05），比對照組低39.09%。

表1 不同濃度MT處理對常溫貯藏6 d的草莓品質(zhì)指標的影響Table 1 Effects of melatonin at different concentrations on the quality of strawberry stored at 20 ℃ for 6 days

硬度是判斷草莓品質(zhì)的具有代表性的指標之一，且在貯藏期間草莓的硬度會有所下降。如表1所示，不同濃度的MT處理均能延緩其下降，在貯藏6 d后，300 μmol/L MT處理組草莓硬度顯著高于其他組（P＜0.05），說明此濃度處理組的貯藏效果最佳。

可溶性固形物含量可以粗略地反映草莓中糖與其他營養(yǎng)物質(zhì)含量。在貯藏過程中，各濃度的MT處理的草莓中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)均顯著高于對照組 （P＜0.05），但各處理組間無明顯差異（P＞0.05）。

ASA既是營養(yǎng)物質(zhì)，又是抗氧化劑，草莓中ASA含量在貯藏期間一般呈先上升后下降的趨勢。由表1可知，不同濃度的MT處理草莓中ASA含量高于對照組，其中100、300 μmol/L MT處理組ASA含量顯著高于對照組（P＜0.05），且300 μmol/L MT處理組ASA含量最高（P＜0.05）。

因此，綜合上述結(jié)果可知，300 μmol/L為MT維持草莓品質(zhì)的最佳濃度，以此濃度處理草莓，進一步驗證MT處理對草莓在低溫貯藏中的保鮮效果。

2.2 MT對低溫貯藏草莓腐爛指數(shù)的影響

如圖1所示，低溫貯藏期間草莓腐爛指數(shù)不斷上升，到貯藏后期，草莓腐爛速度加快，貯藏12 d時MT處理組腐爛指數(shù)為14.66%，而對照組為37.87%，表明MT處理能顯著抑制草莓腐爛（P＜0.05），延長草莓的保質(zhì)期。

圖1 MT對草莓腐爛指數(shù)的影響Fig.1 Effect of melatonin treatment on decay index of strawberry fruit

2.3 MT對低溫貯藏草莓MDA含量、H2O2含量與O2-· 生成速率的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，MDA的積累會對果蔬細胞造成氧化損傷，因此其含量能反映細胞膜脂過氧化程度。如圖2A所示，草莓在貯藏的12 d內(nèi)， MDA含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，可能是低溫貯藏時的冷刺激導(dǎo)致，貯藏6 d后MT能顯著地延緩MDA含量的 上升（P＜0.05）。

圖2 MT對草莓MDA含量（A）、H2O2含量（B）和·生成 速率（C）的影響Fig.2 Effect of melatonin treatment on MDA content (A), H2O2 content (B) and · production (C) in strawberry fruit

H2O2的積累會使得細胞膜脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生損害，造成細胞衰老，但也能參與果實抗病性和抗逆性啟動的誘導(dǎo)過程。由圖2B可知，在整個貯藏期間，草莓中H2O2不斷積累。貯藏初期，MT處理組中的H2O2積累速度超過了對照組，但是貯藏12 d后，對照組中的H2O2含量顯著高于MT處理組（P＜0.05）。

2.4 MT對低溫貯藏草莓ROS代謝相關(guān)酶活力的影響

SOD普遍存在于植物體內(nèi)，能和CAT、POD、APX等酶共同組成植物的抗氧化系統(tǒng)來抵抗ROS造成的損傷。如圖3A所示，貯藏期間，草莓中SOD活力呈緩慢下降趨勢，且第6 天起，MT處理組草莓SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏12 d時，MT處理組的SOD活力比對照組高5.45%。POD作為ROS代謝中重要的酶存在于 果蔬之中。貯藏期間POD活力呈先上升后下降趨勢 （圖3B），MT處理促進草莓貯藏前期POD活力的上升，并延緩其貯藏后期活力的下降，貯藏期間MT處理組POD活力顯著高于對照組（P＜0.05），在貯藏12 d時，MT處理組的POD活力比對照組高28.75%。如圖3C所示，在草莓貯藏前3 d，CAT活力上升，隨后持續(xù)下降，貯藏6 d后，MT處理組CAT活力顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖3D所示，草莓APX活力在貯藏期間呈先上升后下降趨勢，貯藏期間MT處理組APX活力均顯著高于對照組（P＜0.05），兩組草莓均在貯藏6 d出現(xiàn)峰值，且MT處理組中APX活力峰值是對照組中的1.24 倍。

圖3 MT處理對草莓SOD（A）、POD（B）、CAT（C）、 APX（D）活力的影響Fig.3 Effect of melatonin treatment on SOD (A), POD (B), CAT (C) and APX (D) activities in strawberry fruit

2.5 MT對低溫貯藏草莓GSH含量和ASA含量的影響

GSH可以在植物代謝循環(huán)中作為還原劑，能在脫氫ASA還原酶的作用下將脫氫ASA還原成還原型ASA，而還原型ASA能直接清除H2O2。如圖4A所示，草莓GSH含量在貯藏期間先增高后降低，從第6天開始，MT處理組中GSH含量一直顯著高于對照組（P＜0.05），貯藏12 d時比對照組高14.42%，說明MT能延緩GSH含量的下降，維持草莓的抗氧化能力。由圖4B可知，草莓中ASA含量在貯藏期間先上升后下降，貯藏3 d后，MT處理表現(xiàn)出延緩草莓ASA含量下降的能力，且在9 d后其ASA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖4 MT處理對草莓GSH（A）和ASA（B）含量的影響Fig.4 Effect of melatonin treatment on GSH (A) and ASA (B) contents in strawberry fruit

2.6 MT對低溫貯藏草莓自由基清除率的影響

DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和羥自由基清除率均直觀地展現(xiàn)了果實抗氧化能力，自由基清除率越高表示草莓的抗氧化能力越強。圖5A中，草莓DPPH自由基清除率先上升迅速后趨于緩慢，從第6天開始，處理組的DPPH自由基清除率就顯著高于對照組（P＜0.05），在貯藏末期，MT處理組的DPPH自由基清除率為52.34%，是對照組的1.09 倍。由圖5B可知，兩組草莓ABTS陽離子自由基清除率逐漸增加，其中對照組由貯藏0 d時的54.87%逐步增長至12 d時的69.56%，而MT處理組在第12天時則為74.73%，且貯藏9、12 d時，MT處理組ABTS陽離子自由基清除率顯著高于對照組 （P＜0.05）。如圖5C所示，隨著草莓貯藏時間的延長，其羥自由基清除率呈現(xiàn)總體上升的趨勢，且MT處理組在貯藏6 d時開始顯著高于對照組（P＜0.05），至貯藏12 d時，MT處理組的羥自由基清除率是對照組的1.10 倍。由此說明，外源MT能顯著增加草莓的自由基清除能力，提升草莓抗氧化能力以維持細胞膜完整性。

圖5 MT處理對草莓DPPH自由基清除率（A）、ABTS陽離子 自由基清除率（B）和羥自由基清除率（C）的影響Fig.5 Effect of melatonin treatment on scavenging capacity of strawberry fruit against DPPH radicals (A), ABTS cation radicals (B) and hydroxyl radicals (C)

3 討 論

由于草莓采后代謝活動尚未停止，衰老與外界脅迫均會促使細胞中過量的自由基引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化作用，引起果實品質(zhì)下降[22-23]。本研究中利用不同濃度的MT處理草莓，在20 ℃貯藏6 d后，300 μmol/L MT可以顯著降低草莓腐爛指數(shù)，延緩硬度和可溶性固形物質(zhì)量的下降并維持ASA含量。這與王晶等[24]的報道結(jié)果相似，即外源MT能夠提升柑橘果實的新鮮度和ASA含量，并提高可溶性固形物含量和果實風(fēng)味。此外，千春錄等[25]發(fā)現(xiàn)MT處理后的水蜜桃，其在貯藏過程中的硬度下降、質(zhì)量損失率上升以及冷害癥狀均被抑制，從而維持了感官品質(zhì)。

SOD、CAT、APX、POD 4 種酶均是植物酶促防御系統(tǒng)中主要的代謝酶[27]。本實驗探究了在所篩選濃度下，MT對草莓貯藏期間SOD、POD、CAT、APX活力產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)MT在貯藏后期對SOD活力的維持效果十分顯著，而對POD、CAT和APX的影響則主要體現(xiàn)在提升貯藏前期酶活力并延緩貯藏后期酶活力下降，這可能與H2O2含量因果實受到MT處理而出現(xiàn)迸發(fā)有關(guān)，即酶促防御系統(tǒng)在貯藏初期受到了誘導(dǎo)強化，而后相對較高的抗氧化酶活力導(dǎo)致貯藏后期中MT處理組相對較低的ROS含量。

ASA與GSH等抗氧化物質(zhì)在清除ROS的非酶促防御系統(tǒng)中十分重要。ASA與GSH不僅能直接將ROS還原，還可以通過與抗氧化酶類（例如GSH還原酶和脫氫ASA還原酶）共同發(fā)揮作用，參與對ROS的清除。本研究發(fā)現(xiàn)，貯藏過程中GSH與ASA含量的降低也會被MT延緩，這或許與MT也是一種強抗氧化劑有關(guān)，MT可以直接參與自由基清除的過程[28]，從而延緩GSH與ASA的氧化消耗，維持ASA-GSH循環(huán)的穩(wěn)定性與還原能力。自由基的清除速率能直觀地展示果蔬的抗氧化能力的變化，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MT對草莓DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率的提升效果十分顯著，隨著貯藏時間的延長，這種效果愈加明顯，這可能與MT對草莓中酶促與非酶促防御系統(tǒng)的促進作用有關(guān)，MT對二者的促進作用直接和間接地提高了草莓果實的抗氧化能力，使MT處理組果實清除各自由基的能力均有顯著提升。

綜上所述，MT增加草莓貯藏期間的抗氧化能力，主要體現(xiàn)在其對草莓酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)的能力提升上。這與朱玲玲等[29]發(fā)現(xiàn)用MT處理降低了青花菜中·和H2O2積累的結(jié)果相似，而且SOD、CAT和POD活力也同時增加，表明褪黑激素可以通過調(diào)節(jié)呼吸代謝和抗氧化活力來延遲西蘭花收獲后的衰老過程。另外，Hu Wei等[30]發(fā)現(xiàn)外源MT可通過降低H2O2含量來提高CAT和POD的活力，顯著延遲木薯塊根的生理性變質(zhì)，還通過激活ROS清除和ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作用。

4 結(jié) 論

本研究通過對MT處理草莓貯藏期間腐爛指數(shù)以及品質(zhì)指標的測定，確定MT對草莓的品質(zhì)具有維持作用，并篩選獲得了300 μmol/L的最佳濃度，然后用300 μmol/L的MT處理草莓并低溫貯藏。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT處理能降低草莓MDA與H2O2的積累，抑制O2-·生成速率的上升，維持ROS代謝相關(guān)酶（SOD、POD、CAT、APX）的活力并延緩GSH與ASA含量的下降，說明MT能增加草莓采后的抗氧化能力，減少氧化損傷，而ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率的提升則更直觀地展示了MT對草莓抗氧化能力的提升效果。綜上所述，MT處理能降低草莓貯藏期間的腐爛程度，延緩膜脂過氧化，延長保質(zhì)期。