栓菌錳過氧化物酶對合成染料的生物脫色研究

聶志強，席鏡慧，楊秀清

（山西大學 生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

0 引言

紡織印染、造紙、化妝品等行業(yè)對合成染料的使用需求連年遞增，其中約有10%～20%的染料隨廢水排放［1］。合成染料種類繁多，包括偶氮染料、噻嗪類染料、三苯甲烷染料、蒽醌染料、二苯乙烯染料等，其中偶氮染料產(chǎn)量最大，約占合成染料的70%［2］。這些染料多含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，較難降解，且具有致癌、致突變等毒性。在國家倡導“生態(tài)優(yōu)先、綠色發(fā)展”的政策導向下，染料廢水無害處理是環(huán)境保護首要解決的重點問題。

國內(nèi)外處理偶氮染料廢水的方法主要有生物法、物理法、化學法等，其中生物法比物理和化學方法更具優(yōu)勢。可降解染料的微生物有細菌和真菌，主要包括生物吸附、酶催化降解等方式。多數(shù)真菌的脫色機制一般為生物吸附，但是白腐真菌不同，它主要通過胞外分泌一些酶類來降解染料。這些酶包括錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、漆酶（laccase，Lac）、木素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）等，具有非特異性、無須底物誘導、效率高、反應條件溫和［3］等優(yōu)點。MnP 屬于氧化還原酶類，分子內(nèi)部包含一個血紅素輔基，對多種合成染料具有廣譜降解能力。近年來研究人員利用白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶對多種合成染料進行脫色取 得 了 一 系 列 成 果。例 如，Zhang 等［4］從Cerrena unicolorBBP6 中提取純化的MnP 對多種染料（剛果紅、甲基橙、溴酚藍、結(jié)晶紫等）具有明顯的脫色效果，其中對結(jié)晶紫的脫色率可達80.9%，并且在牛仔布漂白方面也有很好的表現(xiàn)。李慧星［5］研究發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的MnP 氧化脫色靛藍6 h 靛藍脫色率可達90.18%。一種海洋來源的擔子菌（Peniophorasp. CBMAI 1063）經(jīng)過7 d 處理后對紡織染料活性黑的脫色率達94%［6］。有研究利用一種新菌株L-25 分泌的MnP 可高效脫色12 種不同的偶氮和蒽醌類染料，脫色率在84.9%～99.6%之間［7］。平菇（Pleurotus ostreatus）分泌的MnP 在pH 4.0 的條件下，對多 種苯酚磺酞類染料進行脫色，結(jié)果表明染料結(jié)構(gòu)對脫色率有顯著影響［8］。

前期研究篩選到一株白腐菌栓菌Trametessp.SQ01，其分泌的MnP 對三苯甲烷類染料具有較強的脫色能力［9］。本文旨在通過單因素實驗和響應面設計進一步研究并優(yōu)化白腐菌SQ01 錳過氧化物酶對偶氮染料的脫色條件。在此基礎上對天青A 染色的棉織布進行漂白，進一步拓展MnP 在染料廢水生物脫色領域的應用。

1 材料

1.1 菌株及產(chǎn)酶條件

栓菌Trametessp. SQ01 由本實驗室篩選并保存，采用PDA 培養(yǎng)基［10］培養(yǎng)，菌株產(chǎn)酶體系及產(chǎn)酶培養(yǎng)基參照文獻［11］。

1.2 主要試劑和儀器

偶氮染料固藍RR、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅以及噻嗪染料天青A 購自生工生物工程股份有限公司，均為分析純。

Eppendorf 5424 臺 式 離 心 機、日 立UV-2010 紫外分光光度計、BS-2F 數(shù)碼振蕩培養(yǎng)箱、pH 計、恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 MnP的分離純化及酶活測定

經(jīng)2 次丙酮沉淀和DEAE-52 柱層析法純化［11］MnP。以每分鐘生成1 μmol Mn3+所需的酶量定義為一個酶活單位（U），酶活測定方法參照文獻進行［11］。

2.2 染料脫色體系及脫色率

脫色體系包括酒石酸鈉緩沖液（pH 4.5 20 mmol/L），MnSO4（1 mmol/L），H2O2（0.1 mmol/L）和不同濃度的染料和MnP，以上均為終濃度。偶氮染料的脫色率通過紫外-可見分光光度計測量脫色前后最大吸收波長吸光度值來計算。

脫色率（?）計算公式為：

其中，A0為脫色反應前溶液的吸光值，At為脫色反應后溶液的吸光值。實驗設3 個平行樣品，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。

2.3 實驗設計

2.3.1 單因素實驗

為研究影響MnP 脫色偶氮染料的因素，分別以溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度及脫色時間進行單因素實驗，各因素水平見表1。

表1 單因素實驗水平表Table 1 Level table of single factor experiments

2.3.2 Box-Benhnken實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取溫度、pH、染料濃度和酶濃度4 個主要因素，每個因素選3 個水平，參照文獻［12-14］進行Box-Benhnken 組合實驗設計，響應面設計因素水平見表2。

表2 響應面設計因素水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

2.4 MnP對天青A染色棉織布的漂白應用

棉織布染色前需要先進行漂白以去除棉坯布表面的漿料和雜質(zhì)，然后洗凈、晾干、裁成方塊狀，使用1 g/L 的天青A 染料進行染色，并不斷攪拌以保持染色均勻［15］。將染色好的棉織布置于20 mL脫色體系中，脫色條件除時間外采用響應面優(yōu)化后的數(shù)值，對照除不添加酶外處理方式相同。每隔20 min 記錄最大吸收波長475 nm 的OD 值。已測得染料濃度（x，g/L）與OD475（y）之間呈線性關系，即y=3.963 2x+0.079 2。因此通過測定脫色體系中染料濃度的變化來反映漂白效果（?）。

定義計算公式為：?=（ct-c0）/1×100%。即溶液中染料濃度越高，對棉織布漂白效果越好。其中，c0為脫色反應前溶液的染料濃度，ct為脫色反應后溶液中的染料濃度。

實驗設3 個平行樣品，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

響應面分析使用軟件Design Expert 12.0，數(shù)據(jù)處理分析及制圖使用軟件Origin 2018。

3 實驗結(jié)果

3.1 MnP脫色偶氮染料的單因素實驗

溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度、脫色時間因素對偶氮染料生物脫色的影響見圖1。

溫度對偶氮染料的脫色情況如圖1A 所示。在30°C～50°C 范圍內(nèi)，脫色率隨著溫度的升高逐漸增 大。40 °C ～50 °C 脫 色 最 佳，固 藍RR 鹽、橙 黃G、剛果紅、氨基黑10B 脫色率分別為84.1%、46.6%、43.3%、41.5%。

pH 對偶氮染料的脫色情況如圖1B 所示。在pH 3～7 范圍內(nèi)，脫色率呈先上升后下降的趨勢。pH 4.5 時，脫色效果最佳，固藍RR 鹽、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率分別為82.2%、45.6%、41.5%、42.9%。

染料濃度對偶氮染料的脫色情況如圖1C 所示，當染料濃度較低為20 mg/L～100 mg/L 時，脫色率最佳。隨著染料濃度的繼續(xù)增加，脫色率開始降低。當染料濃度大于100 mg/L 時，脫色率呈現(xiàn)不可逆的下降。由此可以得出來源于Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料濃度為100 mg/L，且較低的染料濃度更加利于脫色的進行。

酶濃度對偶氮染料的脫色情況如圖1D 所示。在MnP 濃度100 U/L～400 U/L 范圍內(nèi)，脫色率隨著酶濃度的升高逐漸增加。當酶濃度達到400 U/L時，固藍RR 鹽、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率分別達到79.2%，42.6%，38.5%，40.9%。在400～600 U/L 范圍內(nèi)繼續(xù)增加酶濃度，脫色率增幅減小，因此認為400 U/L 為MnP 的最適脫色酶濃度。

脫色時間對MnP 的脫色效果的影響見圖1E。固藍RR 鹽在2 h～4 h 時脫色率明顯增加，4 h 時脫色率達到79.2%，4 h～24 h 脫色率增幅很小，可見4 h 為固藍RR 鹽的最適脫色時間。在2 h～24 h 范圍內(nèi)，隨著時間的延長，橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率有所增加但是增幅較小，表明這三種染料較難脫色且延長時間對提高脫色率作用不明顯。因此選擇2 h 作為這三種染料的最適脫色時間。

圖1 MnP 脫色偶氮染料單因素實驗Fig.1 Single factor experiments of decolorizing azo dyes by MnP

3.2 Box-Benhnken響應面法優(yōu)化

響應面Box-Benhnken 組合實驗設計的29 組實驗結(jié)果見表3，脫色率均在57.5%以上。對表3 實驗數(shù)據(jù)進行多項擬合，得到脫色率（ω）對溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度的二次多項回歸方程為：ω = 83.12－1.59A+0.40B－3.58C+5.56D－2.38AB+1.95AD+1.23BD－1.45CD－5.61A2－1.99B2－6.99C2－9.58D2對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4 與表5?；貧w方程模型的P值＜0.000 1，說明回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其因變量與全體自變量之間的線性關系是極顯著的，即這種實驗方法是可靠的。模型一次項A、C、D 差異極顯著，B 差異不顯著；交互項AB 差異極顯著，AD、CD 差異顯著，其他交互項差異不顯著；二次項差異均極顯著，說明所選因素與響應值之間不是簡單的線性關系。本實驗測得的信噪比為26.95，在合理范圍之內(nèi)。變異系數(shù)為1.84%，低于10%，說明實驗的可信度和模型精確度較高。模型的相關系數(shù)R2=0.965 8＞0.8，說明該模型能較好地描述實驗結(jié)果，可以解釋約96.58%的實驗中脫色率的變化。綜合以上分析，本次擬合質(zhì)量較高且模型的精確度高，可用于分析和預測MnP 脫色偶氮染料固藍RR 鹽的各因素水平的優(yōu)化。

表3 響應面優(yōu)化實驗結(jié)果Table 3 Results of response surface optimization experiment

表4 響應面實驗結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance of the response surface experi‐ment results

表5 二次回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of the quadratic model

為了解實驗因素對于脫色率的影響情況以及因素兩兩間對于脫色率的交互影響，本實驗選定4個主要因素，優(yōu)化可以得到每兩個因素交互的6 個響應曲面圖，選取其中有代表性的3 個，如圖2－圖4，當其中一個因素的值固定，另一個因素使響應值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，即每個因素都在它的實驗水平范圍內(nèi)有最佳值。圖2－圖4 呈現(xiàn)的曲面擬合度較高，有明顯的最高點，表明兩因素交互影響大，即酶濃度與溫度、酶濃度與pH、酶濃度與染料濃度之間的交互作用顯著。各因素對響應值影響程度的排序是：酶濃度＞染料濃度＞溫度＞pH。

圖2 酶濃度和溫度對脫色率的交互作用Fig.2 Interaction of enzyme concentration and temperature on decolorization rate

圖3 酶濃度和pH 對脫色率的交互作用Fig.3 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

圖4 酶濃度和染料濃度對脫色率的交互作用Fig.4 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

通過Design Expert 軟件在建立的回歸方程和二次曲面模型基礎上進行工藝優(yōu)化得到MnP 脫色染料的最佳條件：溫度49.26°C，pH 值為4.64，染料濃度為85.54 mg/L，酶濃度為431.32 U/L，脫色4 h 后脫色率達到84.68%。檢驗響應面法所得結(jié)果的可靠性，同時考慮到實際操作和實驗儀器的局限性，修正后的工藝條件為：溫度為49 °C，pH 值為4.6，染料濃度為85.5 mg/L，酶濃度為430 U/L。在此條件下進行了3 次重復驗證實驗，脫色率的平均值為84.5%，與理論值基本吻合，說明實驗設計和響應面法優(yōu)化得到的降解脫色工藝參數(shù)準確可靠。

3.3 MnP對天青A染色棉織布的漂白脫色應用

在MnP 生物脫色條件優(yōu)化的基礎上，研究了MnP 對噻嗪染料即天青A 染料染色棉織布的漂白脫色應用，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，在0～2 h 范圍內(nèi)，MnP 對染色棉織布的脫色率逐步升高，2 h 脫色率達到16%，2 h～15 h 內(nèi)脫色率增加不明顯。

圖5 錳過氧化物酶對天青A 染色棉織布的脫色Fig. 5 Decolorization of azure A dyed cotton fabric by manganese peroxidase

4 分析與討論

單因素實驗表明Tramatessp. SQ01 MnP 在40 °C～50 °C 范 圍 內(nèi) 表 現(xiàn) 出 較 高 的 脫 色 率。這 與Schizophyllumsp. F17 分離得到的MnP 最適脫色溫 度 為35 °C［16］存 在 一 定 差 別。表 明Tramatessp.SQ01 MnP 在脫色時相對能耐受較高的溫度。酶是一種活性蛋白質(zhì)，溫度對酶促反應有著較大的影響，適當?shù)姆秶鷥?nèi)提高反應溫度有利于酶促反應的進行。在pH 值為4.5 時，脫色效果最佳，這與該酶最適pH 為4.5 一致［9］。而與白囊耙齒菌MnP 最適宜pH 值 為6.3 存 在 一 定 的 差 異［17］。Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料濃度為100 mg/L，且較低的染料濃度更有利于脫色的。而與其來源于同一菌株的漆酶在染料濃度為100 mg/L 時脫色率最大［10］?？梢?，雖然這兩種酶來源相同，但是它們對于底物濃度的特異性仍存在一定的差異。MnP 的最適脫色酶濃度為400 U/L。據(jù)報道Trametessp.SQ01 漆酶脫色RBBR 最適濃度為1 000 U/L［10］，可見這兩種木質(zhì)素過氧化物酶脫色染料的最適酶濃度具有差異性。從Schizophyllumsp. F17 分離的MnP 對偶氮染料剛果紅、橙黃G 和橙黃IV 的初始降解率分別為7.74、1.61 和1.38 mg/min。處理1 h后，對橙黃IV（1 mM）進行的最高脫色率達到30%［16］。Trametessp. SQ01 MnP 脫 色 固 藍RR 鹽的最適脫色時間為4 h，橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的最適脫色時間為2 h?？梢姴煌瑏碓吹腗nP 均能在較短時間內(nèi)對偶氮染料明顯地脫色。

綜上所述，來源于不同菌株的MnP 在最適脫色條件方面不盡相同，來源于同一菌株Trametessp.SQ01 的MnP 與漆酶對于底物濃度的特異性也存在一定的差異。經(jīng)過單因素、響應面及棉織布脫色實驗，可以看出Trametessp. SQ01 MnP 對偶氮染料及噻嗪染料染色的棉織布均有明顯的脫色效果。Zhang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)Cerrena unicolorBBP6 產(chǎn)生的MnP 亦可脫色多種合成染料、降解多環(huán)芳烴并且對牛仔布也表現(xiàn)出較好的漂白效果?？梢姡琈nP 在染料廢水生物脫色領域具有強大的應用潛力，系統(tǒng)研究脫色條件對其脫色效果的影響，對該酶在工業(yè)脫色領域的應用具有一定的參考價值。

5 結(jié)論

本文研究了Trametessp. SQ01 MnP 對偶氮染料脫色的能力及其影響因素，通過單因素實以及Box-Benhnken 組合實驗得到最優(yōu)脫色條件，脫色4 h 脫色率為84.5%，對偶氮廢水的脫色工藝具有一定的參考價值。在最優(yōu)脫色條件下，采用MnP 對天青A 染色的棉織布進行漂白應用，經(jīng)過2 h 脫色率為16%。這表明Trametessp. SQ01 的MnP 在偶氮和噻嗪染料廢水生物脫色領域具有潛在的應用價值。