芳香烴受體抑制劑SR1對小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的防護作用

周曉靚 李德冠 徐文清 王浩,2

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室 300192；2天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 300072

急性電離輻射能夠?qū)е录毙暂椛渚C合征，造血系統(tǒng)是輻射最敏感的器官系統(tǒng)，經(jīng)0.5 Gy以上劑量照射后，即可觀察到造血系統(tǒng)損傷的臨床表現(xiàn)[1]。電離輻射引起的造血系統(tǒng)損傷可表現(xiàn)為一過性或者長期的中性粒細胞減少癥、血小板減少癥和淋巴細胞減少癥，這主要歸因于輻射造成的造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）和祖細胞的殺傷呈劑量積累性以及某些淋巴細胞的凋亡[2]。外周血WBC的凋亡也是大多數(shù)免疫指標(biāo)受到抑制的關(guān)鍵機制，而輻射后免疫功能的遠期恢復(fù)也取決于早期胸腺祖細胞來源的骨髓衍生的HSC的恢復(fù)[3]。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）是一類配體激活轉(zhuǎn)錄因子，能夠被一系列芳香烴類內(nèi)源性或外源性配體激活。AHR在人體除骨骼肌之外的各個器官中均有表達，其主要功能為調(diào)節(jié)異生物質(zhì)的代謝酶活性。StemRegeini 1（SR1）作為高選擇性AHR抑制劑，有刺激造血細胞增殖和分化的能力[4]，包括體外促進HSC增殖以及體內(nèi)促進造血祖細胞增殖。在骨髓移植的臨床治療中，已經(jīng)有學(xué)者嘗試將SR1用于體外的HSC增殖的研究[5]。本研究通過采用4 Gy X射線全身照射小鼠模型，研究SR1對造血系統(tǒng)中外周血血象、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平以及免疫細胞百分比等指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Gammacell?40 Exactor137Cs γ射線照射源購自加拿大Best Theratronics公司，劑量率為0.99 Gy/min；Accuri C6流式細胞儀購自美國BD公司；MEK-7222K全自動血液分析儀購自日本光電工業(yè)株式會社。SR1（純度＞99%）購自美國MedChemExpress公司；兔還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其他抗體均購自美國BD公司；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠15只，6～8周齡，體重（20±2）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[無特定病原體級，實驗動物許可證編號為SCXK（京）2016-0006]。實驗小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體級動物房屏障環(huán)境，小鼠自由飲用無菌水和進食無特定病原體級鼠繁殖飼料，飼養(yǎng)溫度18～25℃，相對濕度40%～70%。

1.3 照射及給藥方法

采用隨機化區(qū)組設(shè)計將C57BL/6J小鼠分為3組：對照組、4 Gy單獨照射組（簡稱照射組）和4 Gy照射+SR1組（簡稱照射給藥組），每組5只。其中照射組和照射給藥組給予4 Gy全身γ射線照射，照射給藥組在照射前5 d至照射后5 d連續(xù)灌胃給予SR1（50 mg/kg），對照組給予等量生理鹽水。照射后第9天處死全部小鼠。

1.4 外周血血細胞計數(shù)

經(jīng)小鼠眼底取血獲取外周血約200 μL，使用事先加入乙二胺四乙酸三鉀溶液作抗凝處理的離心管收集，通過全自動血液分析儀分析并計數(shù)小鼠外周血血細胞。

1.5 骨髓有核細胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）計數(shù)和粒細胞-巨噬細胞集落形成單位（colony-forming units-granulocyte-macrophage，CFU-GM）的檢測

用冷PBS沖洗單側(cè)股骨，得到的細胞懸液用全自動血液分析儀進行BMNC計數(shù)；將小鼠單側(cè)股骨沖洗后得到的骨髓細胞懸液稀釋為1×106個/mL，取0.2 mL細胞懸液加入到2 mL M3534培養(yǎng)基中，混勻后加入到24孔板中，培養(yǎng)5 d后進行CFU-GM計數(shù)，以細胞數(shù)≥30個為陽性集落進行計數(shù)。

1.6 BMNC和HSC中ROS和NOX4水平的測定

改良文獻[6]中的方法并進行實驗，在小鼠骨髓細胞懸液中加入biotin-CD5、CD4、CD8、CD11b和Ter-119抗體的混合液，冷孵育30 min后洗滌，加入Percp-streptavidin、Sca-1和CD117-APC抗體，室溫避光染色30 min后加入2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染料，37℃水浴孵育后使用流式細胞儀檢測ROS的水平（用平均熒光強度表示）。

將骨髓細胞染色后固定破膜過夜，加入兔NOX4多克隆抗體和羊抗兔二抗，使用流式細胞儀檢測NOX4的水平（用平均熒光強度表示）。

1.7 外周血中免疫細胞百分比的檢測

在經(jīng)抗凝處理的小鼠外周血中加入biotin-CD3e和CD45R/B220抗體混合液，冷孵育30 min后洗滌，使用流式細胞儀檢測免疫細胞的百分比。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用xˉ±s表示，組間兩兩比較采用Studentt檢驗（方差齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SR1對照射后小鼠外周血血象的影響

4 Gy γ射線全身照射后第9天小鼠的外周血血細胞計數(shù)結(jié)果（圖1）顯示：與對照組相比，照射組小鼠的WBC和血小板數(shù)量明顯減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），雖然RBC數(shù)量減少和紅細胞壓積（HCT）水平下降，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.209、2.234，均P＞0.05）；與對照組相比，照射給藥組RBC數(shù)量明顯減少，紅細胞壓積（HCT）明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.301、4.144，均P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組的WBC明顯增加[（3.060±0.650）×109個/mL對（4.680±1.134）×109個/mL，P＜0.05]，而血小板數(shù)量未增加（t=0.464，P＞0.05）。

2.2 SR1對照射后小鼠BMNC及CFU-GM的影響

由圖1可見，與對照組相比，照射組小鼠BMNC數(shù)量減少，而照射給藥組比照射組的BMNC數(shù)量明顯增加[對照組：（32.333±6.788）×109個/mL，照射組：（28.375±6.811）×109個/mL；照射給藥組：（49.125±12.532）×109個/mL，均P＜0.05]；照射組小鼠骨髓中的CFU-GM（3.4±1.7）明顯降低，僅為對照組（27.0±8.3）的13%，照射給藥組小鼠的CFU-GM（13.6±6.7）恢復(fù)至對照組的50%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，SR1能夠明顯緩解全身照射引發(fā)的小鼠骨髓造血功能損傷。

圖1 SR1對4 Gy γ射線全身照射后小鼠外周血血象、BMNC和CFU-GM的影響 a表示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.144～8.671，均P＜0.05）；b表示與照射組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.770、3.231、3.323，均P＜0.05）。照射給藥組為4 Gy γ射線全身照射+50 mg/kg SR1。SR1為StemRegenin 1；BMNC為骨髓有核細胞；CFU-GM為粒細胞-巨噬細胞集落形成單位Figure 1 Effects of StemRegenin 1 on the peripheral blood hemogram, numbers of bone marrow nucleated cells and colony-forming unitsgranulocyte-macrophage of mice exposed to 4 Gy γ-ray whole-body radiation

2.3 SR1對照射后小鼠BMNC和HSC中ROS和NOX4水平的影響

由圖2可見，與對照組相比，照射組小鼠BMNC和HSC中ROS水平明顯升高，分別為對照組的1.3 倍和3.2倍，而照射給藥組能明顯降低照射引起的小鼠BMNC和HSC中ROS水平的升高，分別降低至照射組的63%和73%（t=3.962、2.530，均P＜0.05）；照射后小鼠BMNC和HSC中NOX4水平與ROS水平的變化規(guī)律一致，SR1能夠明顯降低照射引起的NOX4水平升高（t=2.310、2.848，均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，SR1可能通過降低NOX4 的水平，從而減少NOX4誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，發(fā)揮保護造血細胞的作用。

2.4 SR1 對照射后小鼠免疫細胞的影響

由圖2可見，與對照組相比，照射組小鼠CD3+T細胞百分比明顯降低，而照射給藥組小鼠的CD3+T細胞百分比較照射組明顯升高，接近照射前水平[ 對照組： （20.938±2.761）%，照射組： （8.512±3.716）%，照射給藥組：（16.140±1.969）%，t=6.002、4.056，均P＜0.05]；與對照組相比，照射組小鼠B220+B細胞百分比明顯降低，而照射給藥組小鼠的B220+B細胞百分比較照射組明顯升高[對照組：（1.884±0.920）%，照射組：（0.608±0.267）%，照射給藥組：（7.240±2.828）%，t=2.978、4.027，均P＜0.05]。

圖2 SR1對4 Gy γ射線全身照射后小鼠BMNC和HSC中ROS、NOX4 水平以及免疫細胞的影響 a表示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.978～9.305，均P＜0.05）；b表示與照射組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.310～4.056，均P＜0.05）。照射給藥組為4 Gy γ射線全身照射+50 mg/kg SR1。SR1為StemRegenin 1；BMNC為骨髓有核細胞；HSC為造血干細胞；ROS為活性氧；NOX4為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4Figure 2 Effects of StemRegenin 1 on the levels of reactive oxygen species and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 in the bone marrow nucleated cells and hematopoietic stem cells, and immunocytes of mice exposed to 4 Gy γ-ray whole-body radiation

3 討論

造血系統(tǒng)是維持外周血血細胞數(shù)量穩(wěn)定和免疫穩(wěn)態(tài)的重要器官，在結(jié)構(gòu)和功能上都與免疫系統(tǒng)息息相關(guān)[7]。其中，HSC是保持造血功能、胸腺免疫細胞發(fā)育功能，以及輻射引起骨髓抑制后實現(xiàn)多譜系重建的核心。造血功能主要在骨髓和胸腺的特殊部位（龕）實現(xiàn)，干細胞龕可為干細胞提供特殊的微環(huán)境，從而在調(diào)節(jié)成體干細胞的存活、更新和分化方面發(fā)揮重要作用。外周血血象是電離輻射損傷最靈敏的檢測指標(biāo)之一，根據(jù)國際放射防護委員會（ICRP）第118號出版物中的報道：經(jīng)2～10 Gy照射后，輻射引起的骨髓抑制可導(dǎo)致一過性的或長期的中性粒細胞減少癥、血小板減少癥和淋巴細胞減少癥[8]。本研究結(jié)果表明，小鼠4 Gy γ射線全身照射后第9天，WBC明顯減少，而SR1照射前給藥能夠明顯改善輻射造成的WBC減少。然而，SR1對于照射后血小板數(shù)量的減少未表現(xiàn)出保護作用，且與對照組相比，照射給藥組的RBC數(shù)量明顯減少，紅細胞壓積（HCT）明顯降低，該作用可能與AHR功能受到抑制后，導(dǎo)致成熟RBC分化減少有關(guān)。BMNC的數(shù)量和功能是評價骨髓造血功能的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果表明，4 Gy照射后，BMNC數(shù)量顯著減少，CFU-GM數(shù)量也明顯減少，而SR1能夠使BMNC的數(shù)量明顯增加，同時將CFU-GM恢復(fù)至照射前的50%，這進一步說明SR1對骨髓造血功能有保護作用。

ROS的形成是電離輻射造成細胞損傷的重要誘因，我們對BMNC和HSC中ROS水平的研究結(jié)果顯示，照射后第9天仍能夠觀察到BMNC和HSC中ROS水平升高，而SR1能夠下調(diào)ROS水平，在對NOX4水平的檢測中也觀察到了相同的趨勢。Wang等[9]報道，輻射能夠誘導(dǎo)NOX4的表達和細胞內(nèi)ROS水平的升高，從而激活核因子κB，促進炎癥反應(yīng)；抑制NOX4能夠明顯抑制輻射誘導(dǎo)的小鼠HSC中ROS水平，同時降低全身照射誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA氧化損傷和雙鏈斷裂，而且小鼠后代含不穩(wěn)定染色體畸變的細胞數(shù)量也會減少。Kim等[10]的研究結(jié)果表明，四氯二苯并-對-二惡英（TCDD）誘導(dǎo)的AHR活化能夠通過激活NOX4誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Eleftheriadis等[11]也進一步報道了AHR能夠通過調(diào)節(jié)乏氧誘導(dǎo)因子1α和核因子E2相關(guān)因子2等通路參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，我們推斷SR1對BMNC和HSC中ROS的調(diào)節(jié)可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)NOX4通路的直接或間接效應(yīng)實現(xiàn)的。

AHR是非常重要的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，是自體免疫調(diào)控的重要靶點，在T細胞的功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，4 Gy全身照射后，T細胞和B細胞的百分比均降低，而SR1能夠明顯使T細胞和B細胞百分比得到回升。有研究者也報道了SR1能夠在體外誘導(dǎo)造血系統(tǒng)的淋巴祖細胞及祖T細胞的產(chǎn)生，但是對于B細胞的調(diào)節(jié)作用還沒有達成共識[12-13]。因此，本研究中B細胞百分比升高是AHR調(diào)控的直接效應(yīng)還是輻射引起的全身炎癥反應(yīng)的間接效應(yīng)仍需要進一步的實驗證明。

綜上，本研究初步探討了AHR抑制劑SR1對全身照射引起的小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的保護作用，主要評估了外周血血象、BMNC數(shù)量和功能、免疫細胞百分比等指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，SR1對輻射引起的骨髓抑制有一定的緩解作用，部分作用與其體外刺激HSC增殖和分化的作用一致，其中進一步的分子機制仍有待探究。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明周曉靚負責(zé)實驗數(shù)據(jù)的分析、論文的撰寫；李德冠負責(zé)實驗的設(shè)計與實施；徐文清負責(zé)論文的審閱；王浩負責(zé)研究命題的提出、實驗的設(shè)計。