抑制p38MAPK信號通路對尿源性膿毒血癥兔腎組織細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制

唐亞純，許武軍，陳 仙，吳孝斌，符 浩

膿毒癥是一種常見的由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致機(jī)體重大臟器功能障礙。在多種感染途徑中，尿路感染約占嚴(yán)重膿毒癥病例的9%，常見于與臨床醫(yī)療相關(guān)的尿路感染，包括因尿路干預(yù)和前列腺活檢導(dǎo)致的尿源性膿毒癥。研究發(fā)現(xiàn)，上尿路感染的患者發(fā)生患腎功能衰竭的風(fēng)險更高。腎組織細(xì)胞凋亡是尿源性膿毒癥的病理生理學(xué)的核心表現(xiàn)，因此抑制腎細(xì)胞凋亡對保護(hù)尿源性膿毒癥患者腎功能尤為重要。p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一種應(yīng)激激活蛋白激酶，對細(xì)胞存活和增殖具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。前期研究顯示，HS能夠通過抑制腎組織中p38 MAPK蛋白的磷酸化激活而減少尿源性膿毒血癥兔腎組織細(xì)胞凋亡，但p38 MAPK信號通路的抑制又是如何介導(dǎo)尿源性膿毒血癥兔腎組織細(xì)胞凋亡目前還未知。作為抑癌基因，p53可通過參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程等生物學(xué)過程發(fā)揮作用。有研究顯示，p38 MAPK能夠通過介導(dǎo)小鼠雙微體擴(kuò)增(murine double minute 2，MDM2)蛋白降解而促進(jìn)p53表達(dá)，而p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。因此，該研究通過觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對尿源性膿毒癥新西蘭兔腎功能以及腎組織凋亡情況的影響，探討p38 MAPK介導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只健康雄性新西蘭兔購自湖南太平生物科技有限公司，體質(zhì)量2.0～2.4 kg，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2015-0004。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及純凈水喂養(yǎng)，鐵籠邊放飼料槽及自由飲水管，濕度 50%～60%，室溫 20～25 ℃。

1.2 主要試劑與儀器

大腸埃希菌菌液購自美國ATCC(25922)，由南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科保存。p53激活劑Nutlin-3購自美國Selleckem公司；p38 MAPK抑制劑SB203580購于美國MedChemExpress公司；血清白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；PrimeScript RT試劑盒和TB Green? Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；鼠抗人MDM2抗體、鼠抗人p53抗體、鼠抗人PUMA抗體購自美國Santa Cruze Biotechnology公司；兔抗人Cleaved caspase-3抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人p-p38MAPK(Thr180/Tyr182) 抗體、兔抗人p38MAPK抗體和兔抗人GAPDH抗體購自英國Abcam公司；480熒光定量PCR儀購自美國羅氏公司；Gel Doc XR凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；全自動血細(xì)胞分析儀購自深圳庫貝爾生物科技股份有限公司；全自動生化分析儀購自德國西門子公司。

1.3 方法

1.3.1

尿源性膿毒血癥模型構(gòu)建與動物分組 采用30 mg/kg戊巴比妥靜脈注射麻醉新西蘭兔，取左肋緣最低點作切口(3 cm)，在后腹腔找到左腎及輸尿管，游離輸尿管上段，用1號絲線結(jié)扎輸尿管遠(yuǎn)端，按0.5 ml/kg在輸尿管近端注入10cfu/ml大腸埃希菌菌液，制備尿源性膿毒血癥兔模型，術(shù)后正常喂養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只新西蘭兔分成4組，每組15只。假手術(shù)組(sham)：按尿源性膿毒血癥模型構(gòu)建的步驟，游離輸尿管上段后，立刻縫合切口，術(shù)后正常喂養(yǎng)；尿源性膿毒血癥組(Model)：按尿源性膿毒血癥模型構(gòu)建步驟進(jìn)行處理；p38MAPK抑制劑SB203580處理組(SB203580)：在尿源性膿毒血癥組的基礎(chǔ)上，造模前30 min給予30 μg/kg SB203580溶液靜脈注射，1次/d，干預(yù)3 d；SB203580+p53激活劑Nutlin-3組(SB203580+Nutlin-3)：在注射SB203580溶液同時，給予128 mg/kg Nutlin-3溶液腹腔注射，1次/d，干預(yù)3 d。

1.3.2

大體觀察 分別記錄造模后24、48 和72 h 時各組新西蘭兔的肛溫、呼吸頻率、心率等情況變化。

1.3.3

血清指標(biāo)檢測 在造模后72 h取新西蘭兔的耳動脈血，利用全自動血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell，WBC)；全自動生化分析儀檢測腎功能指標(biāo)血肌酐、尿素氮的水平；利用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.3.4

TUNEL染色觀察腎組織細(xì)胞凋亡水平 造模后72 h取腎組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，經(jīng)脫蠟至水，根據(jù)TUNEL染色試劑盒操作步驟進(jìn)行染色后，置于熒光顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5

qRT-PCR法檢測腎組織MDM2和p53 mRNA表達(dá)水平 造模后72 h取適量腎組織，使用TRIzol試劑提取總RNA。用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用TB Green? Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。目的基因相對表達(dá)量用2公式計算得出。PCR引物序列MDM2-F：5′-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3′，MDM2-R：5′-AGACGTTCAGTCCTGTCC ATAA-3′；p53-F：5′-ACAGAAACACCTTCCGACAC-3′，p53-R：5′-CCTGGGCATC CTTTAGCT-3′；GAPDH-F：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，GAPDH-R：5′-CGCTCCTG GAAGATGGTGAT-3′。

1.3.6

Western blot法檢測腎組織凋亡、p38MAPK信號通路和p53凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平 造模72 h后取適量腎組織，加入液氮后充分研磨，RIPA細(xì)胞裂解液溶解，置冰上30 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，取上清液。用BCA測定蛋白質(zhì)濃度，取30 μg總蛋白，于12%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Cleaved caspase-3(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、p38 MAPK(1 ∶1 000)、p-p38 MAPK(1 ∶4 000)、MDM2(1 ∶500)、p53(1 ∶200)、PUMA(1 ∶100)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育2 h，ECL試劑顯色，曝光成像，掃描圖像。用Quantity One V6.42軟件對每個條帶的灰度值進(jìn)行分析，以同一樣本中每個靶帶的灰度值與GAPDH條帶灰度值之比作為目標(biāo)蛋白的定量結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 抑制p38MAPK信號通路對兔大體觀察的影響

與sham組比較，Model組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組造模后24、48和72 h兔肛溫、呼吸頻率和心率上升(

P

<0.05)。見表1。

表1 各組兔肛溫、呼吸頻率和心率比較

2.2 抑制p38MAPK信號通路對兔血WBC和炎癥因子指標(biāo)變化的影響

與sham組比較，Model組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平上升(

P

<0.05)。見表2。

表2 各組兔血白細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞炎癥因子水平比較

2.3 抑制p38MAPK信號通路對兔腎功能的影響

與sham組比較，Model組兔肌酐和尿素氮水平均上升(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔肌酐和尿素氮水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔肌酐和尿素氮水平上升(

P

<0.05)。見表3。

表3 各組兔腎功能指標(biāo)血清比較

2.4 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織凋亡情況的影響

4組兔腎組織細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved caspase-3(

F

=531.70，

P

<0.01)、Bax(

F

=254.51，

P

<0.01)和Bcl-2(

F

=471.40，

P

<0.01)表達(dá)水平有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與sham組比較，Model組兔腎組織細(xì)胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織細(xì)胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平增加(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織細(xì)胞凋亡水平，Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0.05)。見圖1、2。

圖1 TUNEL染色觀察兔腎組織凋亡情況 ×2001：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組

2.5 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

4組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=245.10，

P

<0.01)，而p38MAPK蛋白表達(dá)水平無變化(

F

=0.20，

P

=0.89)。與sham組比較，Model組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平升高(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平無差異(

P

>0.05)。見圖3。

圖2 兔腎組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05；與SB203580組比較：&P<0.05

圖3 兔腎組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05

2.6 抑制p38MAPK信號通路對兔腎組織p53介導(dǎo)的凋亡途徑的影響

4組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=303.30，

P

<0.01；

F

=223.75，

P

<0.01)；p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=2 092.05，

P

<0.01；

F

=469.62，

P

<0.01)；PUMA蛋白表達(dá)水平有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=122.80，

P

<0.01)。與sham組比較，Model組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平，PUMA蛋白表達(dá)水平升高(

P

<0.05)；與Model組比較，SB203580組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，p53 mRNA及p53、PUMA蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0.05)；與SB203580組比較，SB203580+Nutlin-3組兔腎組織MDM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平無變化(

P

>0.05)，p53 mRNA及p53、PUMA蛋白表達(dá)水平升高(

P

<0.05)。見圖4。

圖4 兔腎組織p53介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)水平比較A：qRT-PCR檢測腎組織中p53和MDM2 mRNA表達(dá)水平；B：Western blot檢測腎組織中MDM2，PUMA和p53蛋白表達(dá)水平；1：sham組；2：Model組；3：SB203580組；4：SB203580+Nutlin-3組；與sham組比較：*P<0.05；與Model組比較：#P<0.05；與SB203580組比較：&P<0.05

3 討論

膿毒癥綜合征是機(jī)體對感染的復(fù)雜炎癥反應(yīng)，病死率高，是非心臟重癥監(jiān)護(hù)患者死亡的主要原因之一。但在日常臨床體檢中常常無法及時監(jiān)測到早期膿毒癥。尿源性膿毒癥是一種嚴(yán)重的、危及生命的泌尿系感染并發(fā)癥，死亡率非常高，因此，迅速發(fā)現(xiàn)尿源性膿毒癥并開始適當(dāng)?shù)闹委熓种匾?。?dāng)外界感染刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)如Toll樣受體等，會導(dǎo)致大量促炎性細(xì)胞因子(如IL-1和IL-6)分泌。在初始促炎階段之后，會出現(xiàn)一個反調(diào)節(jié)的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)。目前，尿源性膿毒癥所致的腎損傷機(jī)制尚不清楚，大多數(shù)普遍認(rèn)為，血流動力改變、炎癥介質(zhì)、免疫抑制和細(xì)胞凋亡與機(jī)體功能紊亂密切相關(guān)，其中炎癥介質(zhì)是核心因素。因此本研究從炎癥介質(zhì)和細(xì)胞凋亡探討尿源性膿毒癥所致腎損傷的可能機(jī)制理論上可行。本研究結(jié)果表明，尿源性膿毒癥新西蘭兔肛溫、呼吸頻率、心率、血WBC、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高，說明尿源性膿毒癥兔體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇。已有研究證實，尿源性膿毒癥后出現(xiàn)的腎損傷并發(fā)癥可能是通過炎癥因子誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡引起的。本研究結(jié)果表明，尿源性膿毒癥兔血肌酐、尿素氮含量、腎組織細(xì)胞凋亡水平增加，說明尿源性膿毒癥兔出現(xiàn)嚴(yán)重腎損傷。與之前的研究結(jié)果一致，提示尿源性膿毒癥新西蘭兔動物模型構(gòu)建成功。

MAPK包括三大類：p42/44細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)D激酶(ERK)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶。p38MAPK信號通路作為MAPK家族中的重要組成部分，在炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、凋亡和細(xì)胞周期等多種生理病理過程中具有重要作用。已有研究證明，山楂葉總黃酮通過下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎組織p38MAPK信號通路活性，改善氧化應(yīng)激對腎組織的損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK通路在膿毒癥新生大鼠腦組織中異常激活，誘導(dǎo)腦組織炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。采用p38MAPK信號通路抑制劑SB203580干預(yù)后，腦組織炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡情況均被逆轉(zhuǎn)。SB203580是p38MAPK的一種有效抑制劑，廣泛應(yīng)用于各種實驗動物模型。SB203580通過與p38MAPK上的ATP結(jié)合位點結(jié)合抑制p38MAPK活性，阻止下游靶點磷酸化，但不能改變p38MAPK的表達(dá)水平。本研究結(jié)果表明，SB203580能逆轉(zhuǎn)尿源性膿毒癥兔各檢測指標(biāo)，并且有效抑制腎組織磷酸化p38MAPK水平，但對p38MAPK本底蛋白表達(dá)水平無影響，驗證了p38MAPK抑制劑SB203580對p38MAPK磷酸化的抑制作用。

p53作為腫瘤抑制蛋白，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因參與細(xì)胞周期和凋亡過程。p53激活后，通過激活促凋亡基因(如Bax)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時，還能與抗凋亡線粒體蛋白(如Bcl-2)結(jié)合直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3相對表達(dá)量升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量降低。膿毒癥腎損傷通過caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈時間依賴性。研究證明，膿毒血癥組的腎組織凋亡細(xì)胞集中成團(tuán)，凋亡細(xì)胞布滿整個視野，凋亡指數(shù)高于假手術(shù)組。這些研究說明，膿毒癥誘導(dǎo)腎組織細(xì)胞凋亡。已有研究證實，調(diào)節(jié)p53蛋白降解的分子是MDM2。MDM2是p53的典型E3泛素連接酶，也是p53靶基因之一。p38MAPK誘導(dǎo)p53磷酸化導(dǎo)致其與MDM2脫節(jié)，從而避免泛素蛋白酶體降解，表明p38MAPK以翻譯后方式調(diào)節(jié)MDM2和p53表達(dá)。目前，沒有研究清楚闡明p38MAPK如何介導(dǎo)MDM2的降解。p38MAPK可能直接磷酸化MDM2，導(dǎo)致其通過蛋白酶體途徑降解。另外，p38MAPK可能與其他分子相互作用來調(diào)節(jié)MDM2的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2活性的抑制提高了p53的穩(wěn)定性，通過增強(qiáng)MDM2-E3連接酶活性促進(jìn)p53降解。本研究結(jié)果表明，SB203580能上調(diào)MDM2表達(dá)水平，抑制p53和PUMA表達(dá)水平，加入p53激活劑Nutlin-3干預(yù)后，能逆轉(zhuǎn)SB203580干預(yù)后尿源性膿毒癥兔的各項檢測指標(biāo)，但Nutlin-3只能上調(diào)腎組織PUMA 和p53的表達(dá)水平，無法調(diào)控MDM2和p-p38MAPK的表達(dá)水平，這是由于p53激活劑Nutlin-3的作用原理是與MDM2結(jié)合，進(jìn)而抑制MDM2對p53蛋白的降解，與p53蛋白是競爭關(guān)系，因此無法調(diào)控其結(jié)合蛋白MDM2的表達(dá)水平，也對上游p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平無影響。

綜上所述，在尿源性膿毒癥兔中，抑制p38MAPK信號通路能促進(jìn)MDM2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)p53蛋白降解，進(jìn)而抑制p53介導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡，緩解尿源性膿毒癥引起的腎損傷。