黃芩湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1表達(dá)的影響

左玲 劉宏偉 朱宇珍

摘要： 目的 觀察黃芩湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1表達(dá)的影響，探討黃芩湯治療UC的作用機(jī)理。方法 將80只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、黃芩湯組、柳氮磺吡啶組，除對(duì)照組外，采用高脂高糖辛辣飲食加2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)法構(gòu)建濕熱型UC大鼠模型，造模成功后，分別給予20 mL·kg-1體質(zhì)量的黃芩湯和8%濃度的柳氮磺砒啶混懸液灌胃治療，正常對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水，連續(xù)治療2周，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1 mRNA表達(dá)。免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65和ICAM-1 mRNA 及蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，黃芩湯組和柳氮磺砒啶組NF-κB p65和ICAM-1 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著下降（P<0.05）;黃芩湯組NF-κB p65和ICAM-1 mRNA表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于柳氮磺砒啶組，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 黃芩湯對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用可能是通過(guò)下調(diào)NF-κB p65、ICAM-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞： 黃芩湯;潰瘍性結(jié)腸炎;核因子κB;細(xì)胞間粘附分子-1

中圖分類(lèi)號(hào)：R516.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2021）08-0079-05

Effect of Scutellaria Baicalansis Decoction on the Expression of NF-κB p65 and ICAM-1in the Colon Tissue of Rats with Damp-Heat Ulcerative Colitis

ZUO Ling1， LIU Hong-wei2， ZHU Yu-zhen3

（1. The Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524003， China;? 2. The First Clinical School of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China;? 3. Key Laboratory of Guangdong Natural Medicine Research and Development， Zhanjiang 524023， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Scutellaria baicalansis Decoction on the expression of NF-κB p65 and ICAM-1 in the colon tissue of a rat model of damp-heat ulcerative colitis （UC）， and to explore the mechanism of Scutellaria Decoction in treating UC. Methods： 80 SD rats were randomly divided into normal control group， model group， Scutellaria Decoction group and sulfasalazine group. Except for the control group， a high-fat， high-sugar spicy diet plus 2， 4， 6 trinitro-benzene sulfonic acid （TNBS） were used to construct a damp-heat UC rat model. After the model was successfully established， the rats were given by intragastric administration of 20 mLokg-1 body weight Scutellaria Decoction and 8% concentration of sulfasalazine suspension. The normal control group and the model group were given the same amount of normal saline for 2 successive weeks and the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect the expression of NF-κB p65 and ICAM-1 mRNA in the colon tissue and the immunity class chemically detected the NF-κB p65 and ICAM-1 protein expression in the colon tissue. Results： Compared with that of the normal control group， the NF-κB p65 and ICAM-1 mRNA and protein expression quantity of the model group was significantly increased （P<0.05）; compared with that of the model group， the NF-κB p65and ICAM-1 mRNA and protein quantity expression of the Scutellaria Decoction group and the sulfasalazine group decreased significantly （P<0.05）， The NF-κB p65 and ICAM-1 mRNA expression quantity and protein positive expression rate of the Scutellaria Decoction group was significantly lower than that of the sulfasalazine group. The difference was statistically significant between the two groups （P<0.05）. Conclusion： The curative effect of Scutellaria Decoction on damp-heat ulcerative colitis may be achieved by down-regulating the expression of NF-κB p65 and ICAM-1.

【Key words】Scutellaria Decoction; Ulcerative Colitis; Nuclear Factor κ B; Intercellular Adhesion Molecule-1

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）作為炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）的一個(gè)亞型，主要特征是直腸、結(jié)腸的特發(fā)性慢性炎癥[1]，與結(jié)腸癌的發(fā)生有一定的關(guān)系，容易反復(fù)發(fā)作，臨床上難以根治[2]。筆者前期通過(guò)高脂高糖辛辣飲食加免疫復(fù)合法成功構(gòu)建出濕熱型UC模型，證實(shí)了黃芩湯能夠顯著改善濕熱型UC大鼠的癥候?qū)W、促進(jìn)結(jié)腸病變黏膜修復(fù)[3]。UC的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究表明NF-κB廣泛參與炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]，直接調(diào)控細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的轉(zhuǎn)錄，與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]，但是黃芩湯是否對(duì)NF-κB和ICAM-1發(fā)揮調(diào)控作用尚未完全闡明。本研究旨在探討黃芩湯對(duì)濕熱型UC大鼠NF-κB和ICAM-1表達(dá)的影響，闡明其治療濕熱型UC的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 黃芩湯：黃芩9 g，芍藥6 g，甘草6 g，大棗12枚，共約70 g，經(jīng)文火煎煮、過(guò)濾、蒸發(fā)等步驟制成;柳氮磺吡啶腸溶片（上海中西三維藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020450）生產(chǎn);2，4，6 三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司）;Trizol（Invitrogen公司）;NF-κB兔多克隆抗體，ICAM-1兔多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）;RT Master、Syber Green（Takara公司）;DAB顯示試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司）;CX40型光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥 從80只SD大鼠中隨機(jī)選取20只作為正常對(duì)照組，剩余60只分為模型組、黃芩湯組和柳氮磺砒啶組，每組20只。除對(duì)照組大鼠外，均采用高脂高糖飲食加TNBS誘導(dǎo)法構(gòu)建濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型[3，6]。黃芩湯組給予2 mL/100 g體質(zhì)量的黃芩湯灌胃治療，柳氮磺砒啶組給予20 mL·kg-1體重的柳氮磺砒啶混懸液（8%濃度），對(duì)照組和模型組均給予生理鹽水灌胃（20 mL·kg-1體重）。每天治療1次，連續(xù)2周。

1.3.2 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，腹腔麻醉處死大鼠，距離肛門(mén)約8 cm以上剪開(kāi)結(jié)腸，肉眼觀察病變最明顯部位，分別取50 g結(jié)腸組織立即放入液氮罐和福爾馬林中，將液氮罐中的組織放置于-80℃ 冰箱中保存，提取RNA用，福爾馬林處理的結(jié)腸組織用于免疫組化。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般情況 觀察大鼠背毛色澤、有無(wú)拱背、倦怠、活動(dòng)量、體重、進(jìn)食飲水、大便性狀及血便程度等一般情況。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將結(jié)腸組織研磨，采用Trizol法提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，按以下組分配成10 μL反應(yīng)體系：500 ng RNA，RT Mater 2 μL，DEPC水，振蕩混勻離心后置于PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存，將cDNA稀釋10倍用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用96孔板，每個(gè)孔按照以下組分配制10 μL反應(yīng)體系：SYBR Green 5 μL，正向引物（10 μM）2 μL，反向引物（10 μM）2 μL，DEPC水2 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：

NF-κB p65-F：5′-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′，

NF-κB p65-R：5′-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物170 bp;

ICAM-1-F：5′-TACTCTTTAACCGAGGCACCA-3′，

ICAM-1-R：5′-GTCGAGGCCTGAAAGCTAGAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物106 bp;

β-actin-F：5′-CAGTAGGTACCGCTTGACCA-3′，

β-actin-R：5′-CTGTTGCCGAGGCCGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物167 bp。

1.4.3 免疫組化 將組織切片置于60℃恒溫箱中烘烤2 h，室溫冷卻后依次浸泡到二甲苯Ⅰ脫蠟10 min，二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，然后分別按序置于無(wú)水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精中，各3 min。自來(lái)水沖洗后用1% H2O2浸泡10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS清洗后用Tris-EDTA抗原修復(fù)液微波修復(fù)，自然冷卻10 min，自來(lái)水流水冷卻15 min，置于PBS中清洗2次。Marker筆標(biāo)記后分別滴入NF-κB p65、ICAM-1兔多克隆抗體工作液，4℃過(guò)夜。用PBS清洗2次，滴加二抗HRP，37℃孵育30 min。PBS清洗，滴加DAB顯示劑，蘇木素染色 10 min，PBS及自來(lái)水沖洗后烘干封片。結(jié)果判讀：由三名不同的病理科醫(yī)生在顯微鏡下隨機(jī)選取三個(gè)視野拍照，計(jì)算陽(yáng)性率，然后取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 正常組大鼠背毛光澤滑潤(rùn)，反應(yīng)敏捷，喜動(dòng)，進(jìn)食飲水正常，大便呈散在顆粒狀，無(wú)血便，體重逐漸增加。其它三組在造模1周后出現(xiàn)食欲減退，精神不振，拱背，背毛疏松欠光澤，倦怠扎堆，造模2周后濕熱現(xiàn)象加重，反應(yīng)遲鈍、食欲明顯下降，體形消瘦，大便黏膩臭穢，尤其在灌服TNBS后排典型血便。造模過(guò)程中，模型組死亡2只，黃芩湯組死亡1只，柳氮磺砒啶組死亡3只。黃芩湯組經(jīng)藥物干預(yù)治療 1 周后，大鼠活動(dòng)量、進(jìn)食進(jìn)飲量逐漸增加，背毛光澤度增加。柳氮磺砒啶組在治療9 d后精神較前改善，背毛漸有光澤，仍有扎堆現(xiàn)象。2組大鼠在治療2周后背毛恢復(fù)色澤，大便由稀爛便恢復(fù)成散在顆粒狀，體重有所增加。在治療過(guò)程中空白組大鼠無(wú)異常死亡，模型組死亡3只，黃芩湯組死亡1只，柳氮磺砒啶組死亡2只。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1 mRNA表達(dá) 與正常組比較，模型組中NF-κB p65、ICAM-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，柳氮磺砒啶組與黃芩湯組NF-κB p65、ICAM-1 mRNA 表達(dá)均顯著降低（P<0.05）;與柳氮磺砒啶組相比，黃芩湯組NF-κB p65、ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表 1。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65和ICAM-1 蛋白表達(dá) 正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜中NF-κB p65呈弱陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì);模型組結(jié)腸組織胞質(zhì)和胞核中均可見(jiàn)大量NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)，以核著色為主;黃芩湯組、柳氮磺砒啶組NF-κB p65主要以胞質(zhì)著色為主，部分見(jiàn)胞核著色，但染色較淺淡。ICAM-1主要陽(yáng)性表達(dá)于間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞等，以胞膜或胞質(zhì)染色為主，呈棕黃色。模型組黏膜及黏膜下層血管明顯擴(kuò)張充血，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。黃芩湯組和柳氮磺砒啶組結(jié)腸黏膜中ICAM-1陽(yáng)性表量明顯減少。

與正常組比較，模型組NF-κB p65和ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加（P<0.05）;與模型組比較，黃芩湯組和柳氮磺砒啶組NF-κB p65和ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低（P<0.05），其中以黃芩湯組最為明顯。黃芩湯組NF-κB p65和ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于柳氮磺砒啶組，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表 2。

3 討論

UC是一種病因不清的慢性非特異性結(jié)直腸炎性疾病，臨床表現(xiàn)主要為腹痛、腹瀉及粘液膿血便，易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活重[7]。UC在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率較高，近年來(lái)，隨著國(guó)人生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的改變，加上精神、環(huán)境等因素的影響，發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)[8]。西醫(yī)主要以對(duì)癥治療為主，柳氮磺砒啶為常用藥物，UC療效與劑量有關(guān)，但隨著劑量的增加，不良作用明顯增多，主要有頭痛、惡心、嘔吐、貧血、骨髓抑制、肝功能異常、皮疹等[9-10]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC 屬“泄瀉”、“痢疾”、“腸癖”、“臟毒”等范疇，中醫(yī)藥對(duì)UC的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。黃芩湯出自《傷寒論》，由黃芩、芍藥、甘草（炙）、大棗（擘）組成，黃芩苦寒清熱，主腸澼下利，為主藥。芍藥、甘草、大棗治腹攣痛，緩急迫，諸藥協(xié)力可益氣和中止痛。臨床上黃芩湯對(duì)UC的療效滿(mǎn)意，在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃芩湯顯著改善濕熱型UC模型大鼠的癥候?qū)W及組織病理學(xué)改變，具有抗炎、止瀉、鎮(zhèn)痛等作用[3]，但其機(jī)制尚未完全闡明，因此，本研究著重探討了黃芩湯治療濕熱型UC的可能作用機(jī)制。

目前研究認(rèn)為UC的發(fā)生是遺傳、免疫、腸道細(xì)菌等多種因素共同作用的結(jié)果，各種炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17等加重了UC的炎癥反應(yīng)和組織損傷[2，3，11]。NF-κB能夠與不同基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κB位點(diǎn)特異性結(jié)合，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中p65促炎特性顯著，在UC的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。研究表明NF-κB p65在正常腸組織中無(wú)或者低表達(dá)，但在UC患者腸黏膜中的表達(dá)水平異常增高，在隱窩膿腫的隱窩上皮、潰瘍周?chē)纳掀ぁ⒛c道水腫區(qū)域表達(dá)最明顯，并且與內(nèi)鏡分級(jí)及疾病的活動(dòng)度密切相關(guān)[12]。ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成員，在靜息的血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，通過(guò)特異性結(jié)合其受體，增強(qiáng)白細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化[13]。研究表明經(jīng)維多利珠單抗治療后在維持期達(dá)到臨床緩解的UC患者血清s-ICAM-1水平迅速下降[14]。NF-κB活化后易位到核內(nèi)，直接調(diào)節(jié)ICAM-1的轉(zhuǎn)錄，提高炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)量，從而引起UC的結(jié)腸黏膜損傷。

在本研究中，不僅觀察了濕熱證型結(jié)合TNBS誘導(dǎo)的UC中NF-κB p65和ICAM-1的表達(dá)，同時(shí)也研究了黃芩湯是否對(duì)NF-κB p65和ICAM-1具有調(diào)節(jié)作用，我們分析了結(jié)腸病變組織中NF-κB p65、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，濕熱型UC大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65 mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，免疫組化顯示胞質(zhì)和胞核中均可見(jiàn)大量NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)，以核著色為主;胞膜和胞質(zhì)中亦可見(jiàn)ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)，而黃芩湯能夠顯著下調(diào)NF-κB p65、ICAM-1的表達(dá)，與模型組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NF-κB活化可能是UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，黃芩湯可能通過(guò)阻止NF-κB的活化，進(jìn)而下調(diào)ICAM-1的表達(dá)，從而改善UC大鼠的結(jié)腸黏膜損傷。

綜上所述，黃芩湯治療UC的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB的激活，導(dǎo)致下游基因ICAM-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受阻，ICAM-1表達(dá)下降，減少炎癥反應(yīng)，從而修復(fù)潰瘍，改善腸道功能，但黃芩湯通過(guò)何種機(jī)制抑制NF-κB活化有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-01-26）