茶葉中EGCG改善肥胖大鼠腸黏膜屏障損傷的作用研究

劉振云，左高隆,2，林 勇,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

肥胖是一種全球性的健康問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，全球有約2.5億人的生活受肥胖影響，其已被確定為全球第五大死亡危險(xiǎn)因素[1]。肥胖的發(fā)病原因十分復(fù)雜，主要包括飲食失衡、運(yùn)動(dòng)匱乏、遺傳和腸道屏障損傷等因素[1]。其中，高熱量食物的攝入容易改變腸道菌群組成，導(dǎo)致宿主從飲食中獲取更多能量從而增加體重[2]。此外，高脂食物的攝入還會(huì)增加腸道通透性并促進(jìn)內(nèi)毒素易位，引起機(jī)體慢性低度炎癥和氧化損傷[3]，“腸-脂肪”信號(hào)軸已成為防治肥胖的潛在靶點(diǎn)[4]。但是，當(dāng)前針對(duì)肥胖癥的安全高效藥物十分緊缺，尋求能防治肥胖的植物資源及有效成分已逐漸成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。茶是藥食兼用的植物資源，大量研究表明茶葉具有降脂減肥、調(diào)節(jié)腸道菌群、修復(fù)腸粘膜機(jī)械損傷、維持腸道穩(wěn)態(tài)等多種功效[5-6]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）作為綠茶的主要活性單體成分，為茶葉諸多藥理功能之首要成分[7]。先前的研究表明，EGCG能夠通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)脂肪代謝基因表達(dá)來(lái)降低體重和抑制脂肪蓄積[8-9]；此外，EGCG還可以通過(guò)改變高脂飲食小鼠腸道菌群組成達(dá)到降低體重的目的[10]。我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，EGCG對(duì)高脂飲食大鼠具有明顯的調(diào)脂保肝作用[11]。然而，EGCG對(duì)肥胖大鼠的腸道屏障損傷的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)降脂減肥的潛在機(jī)制也尚未完全闡明。基于此，本文從“腸-脂肪”信號(hào)軸角度，通過(guò)體重、臟器指數(shù)、脂肪和腸道病理情況、炎癥因子、內(nèi)毒素水平等指標(biāo)分析，探究EGCG對(duì)肥胖大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用并闡釋相關(guān)降脂減肥的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 EGCG樣品

購(gòu)自sigma公司，純度≥98%。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量為（100±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。高脂飼料的配制參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 輔助降血脂功能評(píng)價(jià)方法》（2012年修訂），配方為基礎(chǔ)飼料63.6%、蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑

總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、谷丙轉(zhuǎn) 氨 酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）及二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）和脂多糖（LPS）Elisa測(cè)定試劑盒購(gòu)于卡邁舒（上海）生物科技有限公司。

1.2.2 儀器

MIKRO 22R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）、Modulyod-230冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo公司）、Thermo Scientific Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）、AEU-210湘儀電子天平（長(zhǎng)沙湘儀天平儀器公司）、Allegra X-22R臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）、移液槍（美國(guó)Thermo公司）、壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）、病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建和給藥標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)已有研究[11]，建立動(dòng)物模型并確定給藥標(biāo)準(zhǔn)。取體質(zhì)量為（100±10）g的SPF級(jí)雄性SD大鼠，在溫度（25±2）℃和濕度40% ～60%的環(huán)境中，提供基礎(chǔ)飼料和飲用水供大鼠自由飲食。經(jīng)過(guò)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將大鼠隨機(jī)平均分為4組（n = 8）：正常組、肥胖組、EGCG低劑量組（75 mg/kg）和EGCG高劑量組（150 mg/kg）。每日上午9時(shí)對(duì)EGCG組大鼠灌胃不同劑量的EGCG溶液，均用蒸餾水配置2 mL，正常組和肥胖組大鼠灌胃相同體積的蒸餾水。其中正常組大鼠喂食基礎(chǔ)飼料，其余組大鼠喂食高脂飼料，共持續(xù)56 d。每7 d稱取一次大鼠體重。最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，將大鼠麻醉，主動(dòng)脈取血，解剖收集附睪脂肪組織、空腸和結(jié)腸，迅速稱重后于-80℃保存。

1.3.2 血清指標(biāo)的測(cè)定

主動(dòng)脈取血后，放入EP管中，在4℃靜置2 h后，于4℃下3500 r·min-1離心15 min，取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)血 清 TG、TC、HDL-c、LDL-c、ALT、AST、LPS、DAO和TNF-α含量。

1.3.3 器官指數(shù)測(cè)定

將大鼠各器官用4℃生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱其濕重。器官指數(shù)=器官濕質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.4 大鼠組織病理學(xué)觀察

大鼠肝臟、脂肪和腸道病理切片制備：分別取每只大鼠肝臟、附睪脂肪、空腸和結(jié)腸組織的相同部位，在10%福爾馬林液下固定，固定后經(jīng)流水沖洗數(shù)小時(shí)。制備石蠟切片，H&E染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 大鼠空腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和上皮間淋巴細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

利用Caseviewer圖像分析軟件對(duì)大鼠的空腸絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)定。每組隨機(jī)選取4只大鼠的空腸H&E染色切片，每張切片選取2根形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的絨毛，計(jì)算絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度（Villus height/Crypt depth，V/C）的比值；統(tǒng)計(jì)絨毛上每100個(gè)空腸細(xì)胞間分布的上皮間淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。*P < 0.05表示存在顯著性差異，**P < 0.01表示存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)肥胖癥大鼠體重的影響

表1可看出，與正常組相比，肥胖組大鼠從第二周開(kāi)始體重明顯增加（P < 0.05或P <0.01）。與肥胖組相比，EGCG低、高劑量組大鼠從第三周開(kāi)始體重均明顯降低（P < 0.05或P< 0.01）。結(jié)果表明高脂飲食可以顯著增加大鼠體重，而給藥EGCG后可有效降低大鼠體重。

表1 EGCG對(duì)大鼠體重影響（n = 8）Table 1 Effect of EGCG on body weight of rats (n=8)

2.2 對(duì)肥胖癥大鼠血脂代謝的影響

由表2可知，與正常組相比，肥胖組大鼠的血清TG、TC和LDL均顯著增加，HDL顯著降低（P < 0.01）。給藥低劑量和高劑量EGCG后，肥胖大鼠的血清TG、TC和LDL水平均顯著降低，HDL水平顯著增加（P < 0.01），呈劑量依賴關(guān)系。表明高脂飲食會(huì)導(dǎo)致大鼠血脂代謝紊亂，而給藥EGCG可有效改善高脂誘導(dǎo)的血脂代謝紊亂現(xiàn)象。

表2 EGCG對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響（n = 8） （mmol/L）Table 2 Effect of EGCG on serum indexes of rats (n=8) （mmol/L）

2.3 對(duì)肥胖癥大鼠體脂率和脂肪細(xì)胞的影響

圖1A表明，與正常組相比，肥胖組大鼠的體脂率顯著增加（P < 0.01）；與肥胖組相比，給藥低、高劑量EGCG均能顯著降低肥胖大鼠的體脂率（P < 0.01），并呈劑量依賴關(guān)系。此外，附睪脂肪組織H&E染色結(jié)果表明（圖1B），正常組大鼠脂肪細(xì)胞排列規(guī)則，尺寸較小，無(wú)病理特征；肥胖組大鼠的脂肪細(xì)胞存在較嚴(yán)重的病變（炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象如黑色箭頭所示），且脂肪細(xì)胞腫大；給藥EGCG后均能顯著改善脂肪細(xì)胞病變現(xiàn)象并能夠減少脂肪細(xì)胞尺寸。這些結(jié)果表明，高脂飲食會(huì)增加大鼠體脂率和脂肪細(xì)胞大小，并引起脂肪組織病變，而給藥EGCG可有效降低肥胖大鼠體脂率和脂肪細(xì)胞大小，改善脂肪病變。

圖1 EGCG對(duì)肥胖大鼠脂肪蓄積及炎癥的影響（n = 8）Figure 1 Effects of EGCG on fat accumulation and inflammation in obese rats (n=8)

2.4 對(duì)肥胖癥大鼠腸道通透性及炎癥的影響

表3表明，與正常組大鼠相比，肥胖組大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空腸上皮間淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著增加（P< 0.01）；在給藥低、高劑量EGCG后，肥胖組大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空腸上皮間淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P< 0.01），且呈劑量依賴關(guān)系。這些表明，高脂飲食會(huì)破壞腸道通透性，增加炎癥狀況，而給藥EGCG可以減少腸道通透性，抑制炎癥。

表3 EGCG對(duì)大鼠腸道通透性及炎癥的影響（n = 8）Table 3 Effects of EGCG on intestinal permeability and inflammation of rats (n=8)

2.5 對(duì)肥胖癥大鼠腸道病理?yè)p傷的影響

腸道H&E染色切片結(jié)果（圖2和表4）表明，正常組大鼠空腸和結(jié)腸絨毛排列整齊、完整，無(wú)病理?yè)p傷現(xiàn)象；肥胖組大鼠空腸絨毛排列稀疏、斷裂，有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象且空腸V/C值較正常組顯著降低（P< 0.01），結(jié)腸有水腫現(xiàn)象（如黑色箭頭所示）；EGCG給藥組大鼠空腸絨毛排列緊密、整齊，無(wú)斷裂，空腸未產(chǎn)生炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象且空腸V/C值較肥胖組大鼠顯著增加（P< 0.01），結(jié)腸無(wú)水腫現(xiàn)象。這些表明，高脂飲食會(huì)增加破壞腸道穩(wěn)態(tài)，造成腸道絨毛損傷，誘發(fā)炎癥，增加腸道水腫，而給藥EGCG可以有效保護(hù)高脂飲食引起的腸道穩(wěn)態(tài)失衡，抑制炎癥。

表4 EGCG對(duì)大鼠空腸絨毛的影響（n = 8）Table 4 Effect of EGCG on Jejunum villus in rats (n=8)

圖2 EGCG對(duì)大鼠腸道病理?yè)p傷的影響（n = 8）Figure 2 Effect of EGCG on intestinal pathological injury in rats (n=8)

3 結(jié)論與討論

由能量攝入和能量消耗失衡而導(dǎo)致的肥胖日益成為全球范圍內(nèi)主要的健康問(wèn)題。然而，針對(duì)肥胖癥的改善措施除生活方式的調(diào)整外，僅有少許藥物如奧利司他等用于肥胖癥的治療[12]，但會(huì)引起腹瀉、頭痛和過(guò)敏等諸多不良副作用。因此，尋求和探明能防治肥胖的植物資源的天然活性成分以及相關(guān)作用機(jī)制逐漸成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。基于此，本實(shí)驗(yàn)從“腸-脂肪”信號(hào)軸及腸道屏障的角度探究茶葉中EGCG對(duì)肥胖癥大鼠腸道屏障損傷的保護(hù)作用以及降脂減肥的相關(guān)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃EGCG可以有效降低高脂引起的大鼠體重增加，并與我們先前的研究結(jié)果一致[11]；EGCG也可明顯降低體脂率并減少脂肪細(xì)胞大小。EGCG降低體重與其改善葡萄糖耐量及脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)[13]。最新的研究表明，EGCG的這一作用歸因于其通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin1自噬促進(jìn)脂肪組織脂質(zhì)分解發(fā)揮作用[14]。

LPS是由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的，在腸道屏障功能損傷后，其通過(guò)MYD88/TLR4通路進(jìn)入體循環(huán)并引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)內(nèi)毒素血癥[15]。DAO由小腸粘膜產(chǎn)生，在腸道屏障損傷后會(huì)大量進(jìn)入血液，已成為評(píng)價(jià)腸道屏障功能的常見(jiàn)指標(biāo)[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可有效降低血清中LPS、DAO和TNF-α含量，并減少空腸上皮間淋巴細(xì)胞數(shù)量來(lái)抑制腸道炎癥，與本實(shí)驗(yàn)中脂肪組織病理學(xué)切片中的炎癥現(xiàn)象減弱一致。這可能與EGCG抑制高脂飲食宿主腸道有害細(xì)菌生長(zhǎng)，減少LPS的產(chǎn)生從而抑制炎癥有關(guān)[17]。先前的研究表明，EGCG可抑制肝臟TLR4表達(dá)來(lái)減輕肝臟炎癥[18]，我們推測(cè)EGCG在腸道TLR4通路中可能也發(fā)揮類似的作用從而減少LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)。腸道絨毛被破壞后，內(nèi)毒素會(huì)更容易進(jìn)入細(xì)胞激活炎癥級(jí)聯(lián)信號(hào)造成機(jī)體損傷，且機(jī)體能量吸收會(huì)嚴(yán)重失衡[19]。我們發(fā)現(xiàn)給藥EGCG可以有效保護(hù)肥胖癥大鼠的腸道絨毛完整性，增加V/C值，減少腸道炎癥和水腫現(xiàn)象。

綜上，茶葉中EGCG可降低大鼠體重，減少脂肪蓄積及炎癥現(xiàn)象，從而有效改善大鼠肥胖癥狀；同時(shí)有效保護(hù)腸道屏障完整性及功能，減少LPS進(jìn)入體循環(huán)，降低血清炎癥因子水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了EGCG對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠腸道屏障的保護(hù)作用，調(diào)節(jié)“腸-脂肪”信號(hào)軸，這可能也是其改善肥胖大鼠脂肪聚集及相關(guān)炎癥的作用機(jī)制。