基于離子液體與超聲波輔助提取普洱茶茶多酚的工藝優(yōu)化

萬(wàn) 常，李啟慧，曾超珍，劉志祥

中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004

茶多酚是茶葉中形成茶葉色香味的關(guān)鍵成分[1]。同時(shí)也是一種新型天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血壓、降血脂、提高機(jī)體免疫力等藥理和保健功能[2]。

離子液體被用于液-液萃取，由于離子液體具有蒸汽壓很低、可以忽略的揮發(fā)性、不可燃性、熱穩(wěn)定性和選擇性溶解度等顯著特性，被認(rèn)為是環(huán)境友好型的溶劑[3]。超聲波技術(shù)具有快速、節(jié)能、溶劑用量少、產(chǎn)品純度高并獲得更高的收率等優(yōu)點(diǎn)[4]，超聲波輔助離子液體方法被廣泛應(yīng)用于活性成分的萃取分離方面，如茶葉綠原酸[5]、菊花異綠原酸C[6]、白花葛莖和辣木葉多糖[7-8]、石榴籽原花青素[9]、杜仲皮總木脂素[10]、黃柏總生物堿[11]、黑豆異黃酮[12]、柚子皮、艾葉、銀杏葉及葛根總黃酮[13-16]等。

普洱茶（Camellia sinensis var. assamica）具有抗癌、抗血栓、抗氧化、助消化、降脂減肥和降血糖等功效[17-19]。普洱茶富含茶氨酸、茶多酚、咖啡堿及沒(méi)食子酸等[20]，其中沒(méi)食子酸、咖啡堿和茶多酚對(duì)其品質(zhì)的影響很大[21]。迄今為止，還未見(jiàn)超聲波輔助離子液體提取普洱茶茶多酚的報(bào)道。

本試驗(yàn)采用綠色環(huán)保溶劑離子液體（1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽，[BMIM]Br）為溶劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取普洱茶中的茶多酚，探討其最佳提取工藝，以期為茶葉中茶多酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶（熟茶，市售），置于干燥箱中80℃烘干后，用高速組織搗碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，密封保存?zhèn)溆谩?-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（純度≥99%，默尼化工科技有限公司）。

1.2 設(shè)備與儀器

101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）；TG16KR型高速離心機(jī)（東旺儀器有限公司）；DS-1型高速組織搗碎機(jī)（上海左樂(lè)儀器有限公司）；HN-1000Y型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）；UV-752C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（廣東航信科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶多酚的提取

稱取0.5 g茶葉粉碎樣，加入一定比例的[BMIM]Br作為提取溶劑，超聲波提取一段時(shí)間后，4 000 r/min下離心10 min，收集濾液，離心，取上清液。在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定其吸光值，每組均重復(fù)3次。

1.3.2 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精準(zhǔn)稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)樣品5.0 mg，加入去離子水溶解，定容至50 mL（質(zhì)量濃度0.1 mg/mL），此為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入dd H2O（4 mL）和酒石酸亞鐵溶液（5 mL，5 mg/mL），混勻后再加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），定容至25 mL。測(cè)定其吸光度（540 nm），每個(gè)處理重復(fù)3次。以吸光度為縱坐標(biāo)與茶多酚濃度為橫坐標(biāo)得到線性回歸方程：y = 0.621x+0.0233，R2 = 0.9991。

1.3.3 茶多酚提取率的測(cè)定

參考陳峰等的方法[22]，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

式中：X—普洱茶提取液中茶多酚的濃度，mg/mL；A—在波長(zhǎng)為540 nm下測(cè)定吸光值；V—溶液定容體積，mL；n—溶液稀釋倍數(shù)；m—普洱茶茶粉的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

考察[BMIM]Br濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、超聲波功率（300、400、500、600、700 W）和料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）對(duì)茶多酚提取效果的影響；各因素水平固定值為：0.3 mol/L [BMIM]Br，提取時(shí)間為20 min，料液比1∶20，超聲波功率為500 W。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用Design-Expert v8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[23]。[BMIM]Br濃度為0.3 mol/L，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）和超聲功率（C）三因素作為自變量，每個(gè)因素三個(gè)水平，以普洱茶茶多酚提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素和水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Design-Expert v8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同[BMIM]Br溶液濃度對(duì)茶多酚提取率的影響

如圖1所示，[BMIM]Br溶液的濃度為0.2～ 0.4 mol/L時(shí)，普洱茶茶多酚的提取率隨其濃度的升高先上升后下降，濃度為0.3 mol/L時(shí)提取率最高；而當(dāng)濃度高于0.4 mol/L后提取率呈緩慢上升的趨勢(shì)，這可能是由于在超聲波狀態(tài)下，超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)及機(jī)械攪拌等作用極大地增加了有效成分的溶解和擴(kuò)散，其影響遠(yuǎn)大于增加離子液體濃度。因此，從原料經(jīng)濟(jì)效益角度出發(fā)，[BMIM]Br溶液濃度采用0.3 mol/L為宜。

圖1 離子濃度對(duì)普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 1 Effect of ion concentration on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響

如圖2所示，不同提取時(shí)間對(duì)普洱茶茶多酚的提取率影響較大，在提取時(shí)間為10 ～ 30 min時(shí)，普洱茶茶多酚提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為20 min時(shí)提取率最高。在提取時(shí)間20 ～ 30 min時(shí)普洱茶茶多酚的提取率有所下降，可能是由于提取過(guò)程中在過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用下導(dǎo)致浸提液溫度升高使得部分茶多酚被降解氧化，茶多酚含量減少；也可能是細(xì)胞內(nèi)外有效成分含量已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致普洱茶茶多酚提取率降低。因此，超聲提取時(shí)間選擇20 min左右為宜。

圖2 提取時(shí)間對(duì)普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.3 不同超聲波功率對(duì)茶多酚提取率的影響

如圖3所示，超聲波功率為300 ～ 600 W時(shí)茶多酚的提取率隨著超聲波功率的增加而升高，600 W時(shí)達(dá)到最大值；之后隨著超聲波功率的增大茶多酚的提取率呈下降趨勢(shì)，其原因可能是隨著超聲波功率增大，溶液的振動(dòng)頻率加快，有利于茶多酚的浸出，但功率過(guò)高振動(dòng)過(guò)快時(shí)會(huì)引起溶液溫度的升高而降解部分茶多酚，造成茶多酚損失。因此本試驗(yàn)超聲波功率選擇600 W。

圖3 超聲波功率對(duì)普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.4 不同料液比對(duì)茶多酚提取率的影響

從圖4可知，一開(kāi)始增加提取溶劑的用量，茶多酚的提取率升高，并在茶葉與溶劑比為1∶30時(shí)提取率達(dá)到最大；此后，隨著增加提取溶劑，提取率緩慢降低。可能是開(kāi)始溶劑用量較少，超聲波作用于茶葉較困難，茶多酚溶出速度慢，浸出率較低；后隨著提取溶劑用量的增加，茶多酚的提取率先上升后下降，呈現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是離子液體溶液達(dá)到一定用量后茶多酚基本萃取完全，再加大提取溶劑的用量時(shí)樣品中殘留的茶多酚也很難被萃取，且隨提取溶劑使用量增大，使得液體的粘度增大，擴(kuò)散能力變差，溶液滲到樣品基質(zhì)內(nèi)部的難度加大，從而導(dǎo)致提取率下降。本試驗(yàn)研究料液比選擇1:30。

圖4 料液比對(duì)普洱茶茶多酚提取率的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

在單因素分析試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇[BMIM]Br溶液濃度為0.3 mol/L，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、超聲功率（C）三因素作為自變量，每個(gè)因素三個(gè)水平，以普洱茶茶多酚提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

利用Design-Expert v8.0.6軟件對(duì)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸整理，結(jié)果如表3所示。各因素經(jīng)回歸擬合后，得到茶多酚提取率的二次多項(xiàng)式回歸模型：

茶多酚提取率（%）=-32.44312 + 0.33275×A+ 1.96550×B + 0.053250×C-7×10-4×A×B +7.25×10-5×A×C-2.15×10-4×B×C-5.85×10-3A2-0.0448×B2-4.325×C2。

由表3可知，F(xiàn) = 67.94，P < 0.0001，說(shuō)明該模型極顯著，具有意義；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.4984 > 0.05），表明該模型具有較高的擬合度，未知因素干擾小。模型的決定系數(shù)R2= 0.9887，校正決定系數(shù)，說(shuō)明回歸方程相關(guān)性高，試驗(yàn)誤差小，穩(wěn)定性和可靠性較好，可有效分析和預(yù)測(cè)浸提茶多酚工藝參數(shù)。此外，分析結(jié)果表明一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，一次項(xiàng)B表現(xiàn)為顯著。F數(shù)值越大，影響程度越大（FA= 2.97、FB=14.66、FC= 64.41）。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

2.2.2 Box-Behnken響應(yīng)面分析交互作用

為了更直觀深入地探討各個(gè)因素間的交互作用，采用Design-Expert v8.0.6軟件繪制空間曲線圖與等高線圖進(jìn)行直觀分析，結(jié)果如圖6 ～圖8所示。

從圖6 ～ 圖8可看出，在空間曲面圖中，曲面坡度越陡，表明因素間交互作用越強(qiáng)；在等高線圖中，封閉曲線越趨于橢圓表明因素間交互作用越強(qiáng)；同一橢圓形的曲線上茶多酚的提取率相同，中心點(diǎn)最高。由此可知，超聲波功率和提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的交互效應(yīng)較強(qiáng)，而提取時(shí)間和料液比對(duì)茶多酚提取率的交互效應(yīng)次之，超聲波功率和料液比對(duì)茶多酚提取率的交互效應(yīng)最弱。

圖6 提取時(shí)間和料液比交互作用Figure 6 Interaction between extraction time and solid-liquid ratio

圖7 超聲功率和料液比交互作用Figure 7 Interaction between ultrasonic power and solid-liquid ratio

圖8 超聲功率和提取時(shí)間交互作用Figure 8 Interaction between ultrasonic power and extraction time

從各因素影響程度分析，再結(jié)合各因素的F值，能反映出各參數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響大小，三個(gè)因素的影響為：C（超聲功率）> B（提取時(shí)間）> A（料液比）。

2.2.3 最佳提取工藝的確定與驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)回歸方程的求解，預(yù)測(cè)得到浸提茶多酚最佳提取工藝條件為：[BMIM]Br溶液濃度0.3 mol/L、料液比30 mL/g、提取時(shí)間20 min、超聲波功率590 W。在此條件下對(duì)普洱茶茶多酚進(jìn)行提取，重復(fù)3次，茶多酚的提取率平均值為8.40%，與預(yù)測(cè)值8.36%接近，表明該模型提取條件參數(shù)可靠，響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助法提取普洱茶茶多酚是可行的，該提取工藝具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 不同提取方法比較

結(jié)果如表4所示。離子液體相比于乙醇溶劑具有更好的溶解性，超聲波輔助提取茶多酚較傳統(tǒng)溶劑浸提法具有明顯優(yōu)勢(shì)，提取率大大提高。

表4 不同提取方法對(duì)茶多酚提取率的影響Table 4 Effects of different extraction methods on the extraction rate of tea polyphenols

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以普洱茶為材料，選用離子液體（[BMIM]Br）為提取溶劑，結(jié)合超聲波輔助方法對(duì)[BMIM]Br濃度、提取時(shí)間、超聲功率、料液比進(jìn)行單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化提取普洱茶茶多酚的最佳提取工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用響應(yīng)面法建立的回歸模型具有高度的顯著性，方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，各個(gè)因素對(duì)普洱茶茶多酚提取率的影響大小為：C（超聲功率）> B（提取時(shí)間）> A（料液比），普洱茶茶多酚的最佳提取工藝為：0.3 mol/L [BMIM]Br溶液、料液比1∶30、超聲時(shí)間20 min、功率590 W。在此提取條件下，茶多酚提取率為8.40%，與預(yù)測(cè)值8.36%接近；由此可以得出，超聲波輔助離子液體提取普洱茶中茶多酚具有較高的得率。離子液體可作為提取溶劑應(yīng)用于茶葉中茶多酚的提取，該工藝穩(wěn)定、可行，可為普洱茶茶多酚的提取與開(kāi)發(fā)利用提供參考。