基于電子鼻技術(shù)的茶鮮葉農(nóng)殘快速診斷

肖文敏，唐小燕，任志紅，吳煥煥，張 虹，尚 濤，仇 園，孫海偉*，韓曉陽,3*

1. 泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學 園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018；

3. 作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018；4. 泰安市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 泰安 271000

茶樹[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] 原產(chǎn)于中國云貴高原及其鄰近的川、桂、湘等邊區(qū)的深山密林中[1-3]，茶具有提神保健、消炎解毒及預防新陳代謝疾病等諸多功效，與咖啡、可可并稱為世界三大植物性飲料。近年來，隨著國內(nèi)外消費者對茶葉品質(zhì)和安全的高度關(guān)注，茶葉農(nóng)藥殘留問題愈加凸顯，解決茶葉農(nóng)殘問題迫在眉睫[4]。

電子鼻（e-nose），又稱嗅覺模擬系統(tǒng)，是一種利用傳感器模擬生物嗅覺原理的新型仿生檢測手段。自1964年首次出現(xiàn)對嗅覺過程的電子模擬[5]到1982年首次提出電子鼻系統(tǒng)的概念[6]，經(jīng)過數(shù)十年的研究發(fā)展[7]，電子鼻技術(shù)與產(chǎn)品愈加成熟，逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品與環(huán)境等領(lǐng)域[8-15]。電子鼻技術(shù)較之氣相色譜法（Gas Chromatography, GC）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）等傳統(tǒng)檢測技術(shù)[16-19]，操作更加快捷、簡單，成本低且檢測及時性高，解決了之前農(nóng)殘檢測專業(yè)性過強和難以現(xiàn)場檢測等問題。目前，已有電子鼻技術(shù)應(yīng)用于果蔬類農(nóng)殘檢測的報道，其中針對有機磷類農(nóng)藥的研究較多[20-22]，但在茶葉農(nóng)殘檢測方面的應(yīng)用仍有不少空白。

農(nóng)藥往往因含有烴基類醚類物質(zhì)而產(chǎn)生一些揮發(fā)性氣味，不同農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，故而其揮發(fā)性/半揮發(fā)性物質(zhì)的氣味類型和強烈程度等不同。因此，從待檢材料揮發(fā)出的氣味入手，利用電子鼻進行農(nóng)藥殘留的定性及定量分析可靠性強。本試驗基于電子鼻技術(shù)，對茶鮮葉中菊酯類殺蟲劑農(nóng)藥和常見廣譜除草劑類農(nóng)藥的種類以及濃度進行檢測，對不同農(nóng)藥進行模式識別，并建立單一農(nóng)藥濃度預測模型，從而開啟一種茶鮮葉殺蟲劑類和除草劑類農(nóng)藥殘留快速診斷新方法, 以在源頭控制茶葉中的農(nóng)藥殘留問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶鮮葉來自山東省泰安市君思飲茶葉有限公司，為未噴灑農(nóng)藥的茶樹一芽二葉鮮樣，隨機取樣后立即進行噴藥處理及檢測。

試驗選用的菊酯類殺蟲劑農(nóng)藥包括：高效 氯 氟 氰 菊 酯（Lambda-cyhalothrin，Cyh；有效成分含量2.5%）、高效氯氰菊酯（Beta cypermethrin，Cyp；有效成分含量4.5%）、甲氰菊酯（Fenpropathrin，F(xiàn)en；有效成分含量20%）、聯(lián)苯菊酯（Bifenthrin，Bif；有效成分含量10%）。常見廣譜除草劑類農(nóng)藥包括：草銨膦（Glufosinate ammonium，Glu；有效成分含量20%）、草甘膦（Glyphosate，Gly；有效成分含量30%）。

1.2 試驗設(shè)計

因當前無茶鮮葉相關(guān)農(nóng)殘標準，故試驗參考《GB 2763—2019 食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中商品茶標準[27]，茶葉中高效氯氟氰菊酯最大殘留量為15 mg/kg、高效氯氰菊酯為20 mg/kg、甲氰菊酯為5 mg/kg、聯(lián)苯菊酯為5 mg/kg及草甘膦為1 mg/kg、草銨膦為0.5 mg/kg。

1.2.1 定性分析

將6種農(nóng)藥稀釋配制成國標下最大殘留量濃度，以等量蒸餾水為對照（CK），進行噴施并進行電子鼻檢測。

1.2.2 定量分析

每種農(nóng)藥設(shè)置5個濃度梯度（含國標下最大殘留量濃度）進行噴施，用電子鼻對茶葉中多種濃度農(nóng)藥殘留進行檢測鑒別。具體濃度梯度設(shè)置如下：高效氯氟氰菊酯為0 mg/kg、5 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，高效氯氰菊 酯 為 0 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，甲氰菊酯和聯(lián)苯菊酯均為0 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg；草銨膦為 0 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8.0 mg/kg，草甘膦為0 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8.0 mg/kg、16.0 mg/kg。

1.2.3 樣品處理

為了試驗進樣的方便性和準確性，試驗采用定量取樣方法，即每次稱取5 g茶葉樣品于三角瓶中（參考文獻[28]，綜合考慮容器壓強等因素，試驗容器體積選用50 mL），使用注射器模擬田間施藥進行農(nóng)藥定量（3 mL）噴施后立即用錫箔紙封口，利用PEN3型便攜式仿生電子鼻系統(tǒng)（PEN3，AirRenRe AnalyticR GmbH，Germany）進行氣體檢測分析，每處理5次重復。

1.2.4 藥劑實際濃度測定

使用經(jīng)典氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對配制的各農(nóng)藥噴藥濃度進行實測，獲得對應(yīng)的實際濃度，每處理3次重復。

1.2.5 田間檢驗

通過對4種菊酯類殺蟲劑進行常規(guī)田間噴藥試驗，5 d 后取樣并分別進行GC-MS檢測與電子鼻檢測（另取一份樣品105℃快速烘干固樣備用），計算電子鼻檢測準確度，每處理3次重復。

1.3 電子鼻傳感器篩選優(yōu)化

電子鼻檢測分析采用頂空吸氣法，參考文獻[28]的方法對參數(shù)設(shè)置進行修改：（1）頂空吸氣處理：頂空時間10 min，頂空溫度 25℃；（2）每次測量前后傳感器進行清洗和標準化：傳感器清洗時間100 s（更換藥劑種類時清洗120 s），自動調(diào)零時間10 s，樣品準備時間5 s，樣品測定間隔時間1 s，內(nèi)部流量 600 mL/min，進樣流量 600 mL/min，測量時間150 s。試驗將電子鼻檢測146 ～ 148 s處的信號作為傳感器信號分析的時間點。采用電子鼻自帶Winmuster軟件進行負荷加載分析（Loadings analysis，LA）與主成分分析（Principal component analysis，PCA），對傳感器進行篩選優(yōu)化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 定性分析

通過SPSS 22.0軟件對傳感器響應(yīng)值進行提取優(yōu)化和PCA（Principal component analysis）模式識別，根據(jù)各農(nóng)藥主成分分類圖考察區(qū)分效果，從各個總體的樣本點分布集中與否及不同總體的樣本點分布重疊與否等來分析。

1.4.2 定量分析

（1）濃度含量模式識別。通過SPSS 22.0軟件對優(yōu)化后的傳感器響應(yīng)值進行PCA分析，判斷每種農(nóng)藥不同濃度梯度區(qū)分度。（2）濃度預測模型的建立及檢驗。通過SPSS 22.0軟件利用偏最小二乘回歸算法（Partial least squares，PLS）建立菊酯類殺蟲劑及廣譜除草劑類各農(nóng)藥的濃度含量預測模型，并進行檢驗。通過對模型預測濃度值與實測濃度值進行線性擬合，根據(jù)相關(guān)系數(shù)與估計標準誤差（Standard error estimate，Se）等指標檢驗預測模型的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻傳感器優(yōu)化結(jié)果

PEN3型通用傳感器共10個，分別為W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S，不同傳感器所側(cè)重檢測的氣體成分不同（表1）[28]，因此電子鼻傳感器對“茶葉+農(nóng)藥氣味物質(zhì)”的響應(yīng)存在差異。結(jié)果顯示，傳感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W響應(yīng)值變化范圍分別為1.52 ～ 12.05、1.40 ～ 8.50、2.02～ 12.42、1.26 ～ 4.39和2.18 ～ 24.34，響應(yīng)值較高，對相關(guān)氣體物質(zhì)敏感度較大；而W1C、W3C、W6S、W5C、W3S傳感器響應(yīng)值均小于或約等于1.0，表明其對相關(guān)氣體物質(zhì)的響應(yīng)不敏感。

表1 PEN3型電子鼻傳感器屬性Table 1 Sensor attributes of the PEN3 e-nose

同時，各傳感器對不同藥劑的區(qū)分貢獻率不同，通過負荷加載分析可判斷10個傳感器區(qū)分能力的大?。和ǔＷ鴺酥惦x原點（0，0）越遠的傳感器，響應(yīng)越強，區(qū)分貢獻率越大[28]。由圖1a ～ 圖1i可見，傳感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W對于菊酯類殺蟲劑農(nóng)藥、廣譜除草劑類農(nóng)藥組內(nèi)與組間區(qū)分貢獻率較大；由圖2a ～ 圖2b可見，選擇傳感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W列陣對6種農(nóng)藥進行PCA分析，在保證各藥劑間區(qū)分度和消除傳感器冗余的同時，2個主要成分的累積方差貢獻率總和與主成分1的累積方差貢獻率較10個傳感器列陣的均有所增加（2個主要成分的累積方差貢獻率總和超過95%，主成分1的累積方差貢獻率達90.74%），分析準確率相應(yīng)提高。因此，本試驗選擇傳感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W進行分析。

圖1 10個傳感器對不同種類農(nóng)藥的負荷加載分析(LA)Figure 1 Loadings analysis (LA) of 10 sensors for different kinds of pesticides

圖2 電子鼻不同傳感器列陣氣味數(shù)據(jù)主成分分析（PCA）Figure 2 Principal component analysis (PCA) of odor data from different sensor arrays in electronic nose

2.2 定性分析結(jié)果

從圖3可見，通過SPSS 22.0利用主成分分析法（PCA）對響應(yīng)特征值降維和分類，6種農(nóng)藥模式識別表現(xiàn)較強區(qū)分度；其中，除草劑類與殺蟲劑類組間區(qū)分度較好，除草劑類組內(nèi)區(qū)分度較高，殺蟲劑類組內(nèi)高效氯氰菊酯與高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯間的區(qū)分度略低。從第一主成分（90.7450%）區(qū)分度分析（表2），除草劑類與殺蟲劑類組間差異極顯著（p < 0.01），除草劑類組內(nèi)差異極顯著（p < 0.01），殺蟲劑類組內(nèi)高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯與甲氰菊酯間差異顯著性略低；從第二主成分（5.1014%）區(qū)分度分析，聯(lián)苯菊酯與草銨膦、草甘膦間差異顯著性略低，其他農(nóng)藥間差異顯著或極顯著。可見，利用電子鼻對茶葉（菊酯）殺蟲劑類與除草劑類農(nóng)藥的混合區(qū)分度較好。

表2 6種農(nóng)藥電子鼻氣味數(shù)據(jù)主成分分析（PCA）的區(qū)分度（146 ～ 148s）Table 2 Discrimination power of PCA of odor data of electronic nose on 6 pesticides at 146 ～ 148s

圖3 不同農(nóng)藥電子鼻146 ～ 148s時間點氣味數(shù)據(jù)的主成分分析Figure 3 Principal component analysis of odor data of electronic nose on different pesticides at 146 ～ 148s

2.3 定量分析結(jié)果

2.3.1 濃度含量模式識別結(jié)果

以5個最優(yōu)傳感器為分析傳感器對殺蟲劑與除草劑兩類6種農(nóng)藥不同濃度的響應(yīng)特征值進行主成分分析（圖4a ～ 圖4f），各農(nóng)藥的不同濃度數(shù)據(jù)可較為有效區(qū)分。（菊酯）殺蟲劑類農(nóng)藥各濃度梯度第一主成分與第二主成分分析值大致在-2 ～ 2范圍內(nèi)，且各濃度第一主成分分析值的線性關(guān)系較為明顯；其中，高效氯氟氰菊酯5個濃度線性關(guān)系最為顯著，高效氯氰菊酯10 mg/kg、20 mg/kg與40 mg/kg 3個濃度、甲氰菊酯2 mg/kg與5 mg/kg 2個濃度有一定重合，推測建立濃度模型預測時可能存在一定誤差。除草劑類農(nóng)藥各濃度梯度第一主成分與第二主成分分析值大致在-1 ～ 3、-2 ～ 2范圍內(nèi)，各濃度第一主成分分析值亦存在線性關(guān)系，但0 mg/kg（清水處理）的第一主成分分析值要明顯大于其他濃度值；其中，草甘膦除0 mg/kg以外的其他4個濃度第二主成分分析值線性關(guān)系也較為顯著。

圖4 單一農(nóng)藥不同濃度電子鼻氣味數(shù)據(jù)的主成分分析Figure 4 Principal component analysis of odor data of electronic nose on different concentrations of single pesticide

2.3.2 濃度預測模型的建立

選取響應(yīng)值較大的W5S、W1S、W1W、W2S和W2W傳感器響應(yīng)值，采用偏最小二乘法（PLS）對同種農(nóng)藥不同濃度梯度建立預測模型：

模型Ⅰ(Cyh): Y= -23.609+3.097R2-3.691R6+0.985R7+3.054R8+1.800R9

模型Ⅱ(Cyp): Y= 3.598+1.802R2+22.011R6-1.519R7-28.943R8+0.012R9

模型Ⅲ(Fen): Y= -4.594+8.775R2-4.106R6-3.982R7+3.461R8+0.689R9

模型IV(Bif): Y= -15.622+1.408R2-3.316R6-2.518R7+9.061R8+1.207R9

模型V(Glu): Y= 2.992-1.539R2+4.491R6+3.070R7-10.009R8+0.054R9

模型VI(Gly): Y= 7.480-6.060R2+10.287R6-0.925R7--6.278R8-1.326R9

公式中，Ri為 第i個傳感器在146 ～ 148 s時間點的信號響應(yīng)值（第i個傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后的電阻量G(Ω)與傳感器在經(jīng)過標準活性碳過濾氣體的電阻量G0 (Ω)的比值），R2=G/G0W5S、R6= G/G0W1S、R7= G/G0W1W、R8= G/G0W2S、R9= G/G0W2W。將傳感器響應(yīng)值帶入上式，得出的 Y值即為殺蟲劑/除草劑農(nóng)藥的預測濃度。從表3方差分析可見，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI 的P值均小于0.001，表明PLS回歸模型具有極顯著性。

表3 殺蟲劑類和除草劑類農(nóng)藥濃度預測模型的方差分析Table 3 Variance analysis of concentration prediction model of insecticides & herbicides

2.3.3 濃度預測模型檢驗結(jié)果

通過所建模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI進行濃度含量預測，對各農(nóng)藥的濃度預測值與GC-MS實測值進行線性擬合，檢驗模型準確性。從圖5a ～ 圖5f可見，各農(nóng)藥濃度預測值與實測值擬合程度較好，高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、草銨膦和草甘膦濃度預測值與實測值之間的相關(guān)系數(shù)為0.985、0.967、0.947、0.965、0.982和0.968，估計標準誤差為2.696、5.269、1.718、1.371、0.200和0.544；6種農(nóng)藥的濃度預測值與實測值間相關(guān)系數(shù)高，估計標準誤差較小，模型代表性較高，該模型能夠較為準確地對茶樹葉片中高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、草銨膦和草甘膦等農(nóng)藥的濃度含量進行預測。但是，高效氯氰菊酯10 mg/kg、20 mg/kg與40 mg/kg 3個濃度及甲氰菊酯2 mg/kg與5 mg/kg 2個濃度有部分預測值區(qū)分度較小，這與濃度含量模式識別誤差預測一致（圖4b ～ 圖4c），考慮與藥劑揮發(fā)性及電子鼻特性等有關(guān)；同時，草銨膦與草甘膦的濃度預測在0 ～ 0.2（0.5）mg/kg范圍內(nèi)精度較低，考慮所建濃度預測模型在較低濃度范圍內(nèi)的適用性有待進一步優(yōu)化。另外，不同農(nóng)藥因揮發(fā)性/半揮發(fā)性物質(zhì)存在差異，檢測精度的影響因子有待進一步探究。

圖5 茶葉殺蟲劑類和除草劑農(nóng)藥含量預測模型對預測濃度與實際濃度的擬合圖Figure 5 Fitting diagram of the prediction model of tea insecticide and herbicide content to prediction concentration and actual concentration.

2.4 田間檢驗結(jié)果

通過菊酯類殺蟲劑田間噴藥試驗，綜合GC-MS檢測與電子鼻檢測，計算高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯和聯(lián)苯菊酯4種藥劑茶樣農(nóng)殘量電子鼻檢測準確度分別為：91.011%、86.159%、85.206%和86.384%，且兩種方式檢測數(shù)據(jù)的線性擬合程度較好（表4）?？梢姡娮颖翘镩g檢驗準確度較高，可從鮮葉源頭檢測把控，具備實際生產(chǎn)操作性。

表4 GC-MS檢測和電子鼻檢測的茶樣農(nóng)殘含量與其線性擬合參數(shù)Table 4 Determination of pesticide residues in tea samples by GC-MS and e-nose & their linear fitting parameters

3 討論

本試驗對電子鼻傳感器進行有效篩選優(yōu)化，確定了茶樹菊酯類殺蟲劑與廣譜除草劑類農(nóng)藥種類定性分析與濃度定量分析的最優(yōu)傳感器列陣，并對茶樹兩大類6種常見農(nóng)藥進行有效的PCA模式識別。研究建立了6種農(nóng)藥單一藥劑的濃度預測模型，預測模型檢驗準確度較高，并通過田間試驗證明具有實際生產(chǎn)操作性。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，電子鼻檢測環(huán)境并非單一環(huán)境，存在一定影響因素。一方面，茶樹鮮葉中的揮發(fā)性物質(zhì)種類多以及隨離體時間推移轉(zhuǎn)化快[29-31]等因素干擾著傳感器響應(yīng)；如鄭鵬程等研究發(fā)現(xiàn)在茶鮮葉攤放一定時間（6 ～ 12 h）中，其香精油總量與香氣組分數(shù)量均處于較高的水平[29]，茶葉香氣等非目標檢測物的干擾影響電子鼻對藥劑的識別；另一方面，現(xiàn)有電子鼻容易受到環(huán)境溫度、濕度和氣壓等因素的干擾，且環(huán)境變化對傳感器響應(yīng)的干擾通過簡單的濾波等方法無法抑制；梁志芳等研究提出了基于模式錯配的干擾消除方法（PMIE）和基于域校正-自適應(yīng)極限學習機模型（DC-AELM）等干擾抑制方法，但仍需在復雜環(huán)境中不斷驗證與完善[32]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)殘限量為15 mg/kg的高效氯氟氰菊酯的濃度預測值較為準確，但農(nóng)殘限量值較低的草銨膦（0.5 mg/kg）在0 ～ 0.2 mg/kg濃度范圍的含量預測精度較低，這是濃度梯度小于電子鼻預測誤差（絕對值）的體現(xiàn)，反映了電子鼻精度與檢測要求間的差距，電子鼻在低濃度下的精準檢測能力仍需進一步優(yōu)化；王昌龍等采用“特征比值法”對響應(yīng)曲線進行特征提取，有效消除了濃度的影響，由此可見特征提取方法等方面仍有較大研究空間[33]。此外，含磷除草劑類農(nóng)藥的揮發(fā)性與穩(wěn)定性易受環(huán)境影響[34]，也可能是誤差產(chǎn)生的原因之一?？梢姡绾翁岣卟煌巹┑碾娮颖菣z測精度值需進一步研究。

從茶鮮葉入手，可以監(jiān)督茶園尤其是有機茶園的用藥情況, 有效引導茶農(nóng)合理施藥, 從而實現(xiàn)茶葉農(nóng)藥源頭控制，把茶葉安全生產(chǎn)危害分析的關(guān)鍵控制點（HACCP）前移，同時減少農(nóng)藥不合理施用帶來的茶園土壤環(huán)境污染[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，在茶葉加工過程中存在著不同程度的農(nóng)藥消解現(xiàn)象，消解率大致在20% ～ 80%，農(nóng)藥的消解程度與其理化性質(zhì)（蒸氣壓、水溶性、光熱穩(wěn)定性等）密切相關(guān)[36-37]。研究表明紅茶加工對農(nóng)藥的消解作用顯著高于綠茶加工，不同加工工藝的消解貢獻率大小依次為：干燥＞萎凋、攤放＞殺青、揉捻、發(fā)酵[37-38]。姜咸彪等研究報道了不同農(nóng)藥種類和茶葉品種間的消解率存在較大差異[39]。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同施藥量或鮮葉農(nóng)殘量條件下的加工消解作用也不相同[40-41]。因此，在把控茶鮮葉原料的同時，如何優(yōu)化茶園防控管理，輔以科學的加工工藝提高農(nóng)藥消解率，對茶葉生產(chǎn)安全性也有著現(xiàn)實意義。

本試驗研究證明了基于電子鼻技術(shù)的茶葉不同農(nóng)藥殘留檢測的可操作性，并建立了各農(nóng)藥的濃度預測模型，達到了預期效果。同時，針對研究中發(fā)現(xiàn)的問題，下一步我們將從電子鼻傳感器優(yōu)化、檢測環(huán)境及非目標檢測物干擾消除、農(nóng)藥種類及濃度拓展等方面進行探究，以期提高電子鼻檢測精度，使基于電子鼻技術(shù)的茶葉農(nóng)殘快速診斷更加精準。