一種茶樹(shù)新害蟲(chóng)
——貢山喙薊馬Mycterothrips gongshanensis 的鑒定

李 帥，孟澤洪*，呂召云，修春麗，張金峰，楊 文，周玉鋒

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2. 山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002；

3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；4. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006

害蟲(chóng)為害是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一。近40年來(lái)，我國(guó)茶園害蟲(chóng)的發(fā)生經(jīng)歷了由鱗翅目食葉類害蟲(chóng)向小型刺吸式害蟲(chóng)演替和由發(fā)生代數(shù)少的種類向發(fā)生代數(shù)多的種類演替的過(guò)程，茶樹(shù)吸汁性害蟲(chóng)的防治將成為未來(lái)的研究重點(diǎn)[1]。薊馬是一類重要的茶樹(shù)吸汁性害蟲(chóng)，通常以成蟲(chóng)和若蟲(chóng)銼吸茶樹(shù)嫩梢嫩葉，導(dǎo)致被害葉片褐化、葉質(zhì)僵脆、萎縮卷曲甚至枯焦、脫落，一年可發(fā)生10余代，嚴(yán)重影響茶葉生產(chǎn)[2-3]。在我國(guó)，已報(bào)道的茶樹(shù)薊馬種類有20余種[4-7]，其中，以茶黃硬薊馬Scirtothrips dorsalis Hood和茶棍薊馬Dendrothrips minowai Priesner危害最為嚴(yán)重。茶黃硬薊馬是我國(guó)南方茶區(qū)重要害蟲(chóng)之一[8]，自上世紀(jì)八十年代起便嚴(yán)重影響廣東、廣西、湖南、江西等地的茶葉生產(chǎn)[9]；2006年，福建省華安縣茶黃薊馬曾大面積發(fā)生，受害茶園一般減產(chǎn)7.1% ～ 9.6%，嚴(yán)重的達(dá)18.7%[10]。茶棍薊馬在我國(guó)以貴州發(fā)生最為嚴(yán)重，時(shí)有茶場(chǎng)暴發(fā)成災(zāi)，產(chǎn)量損失在50%，甚至60%以上[11-12]，近年來(lái)更是發(fā)生了種群擴(kuò)張[13]，在浙江、江西、江蘇、湖北等省亦發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重為害[1]。此外，如褐三鬃薊馬Lefroyothrips 1efroyi[3]、花薊馬 Frankliniella intonsa[14]、華簡(jiǎn)管薊馬Haplothrips chinensis[15]等種類雖常見(jiàn)于各地茶園，但鮮有嚴(yán)重危害的報(bào)道。

自2014年以來(lái)，我們?cè)谫F州發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重影響夏秋茶生產(chǎn)的薊馬類害蟲(chóng)，在貴州有20余個(gè)縣市發(fā)生，并在多地茶園暴發(fā)成災(zāi)，造成葉片脫落，芽梢光禿。由于該薊馬的為害習(xí)性特殊：喜藏匿于芽葉間隙內(nèi)為害，受害葉片葉尖均勻褐化變硬等，其形態(tài)特征亦與國(guó)內(nèi)已報(bào)道的常見(jiàn)茶樹(shù)薊馬種類均不相同，曾將其初步鑒定為毛腹喙薊馬Mycterothrips setiventris Bagnall[16]。但在詳細(xì)的形態(tài)特征比對(duì)之后，本文將該薊馬準(zhǔn)確鑒定為與毛腹喙薊馬極為近似的同屬另外一種，即貢山喙薊馬M. gongshanensis Li, Li &Zhang。從發(fā)生程度和為害性上看貢山喙薊馬已成為貴州一種重要的茶樹(shù)吸汁性害蟲(chóng)；此外，在云南保山[4]和西雙版納等地該薊馬亦有被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明其有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。鑒于此，本文首次記錄該種薊馬全蟲(chóng)態(tài)形態(tài)特征，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲取了該薊馬線粒體COI基因的分子數(shù)據(jù)（DNA條形碼），為該害蟲(chóng)的準(zhǔn)確鑒定和遺傳多樣性研究提供參考，以便對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)防控。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)觀察與鑒定

1.1.1 活體標(biāo)本顯微觀察

活體標(biāo)本采自于貴州省惠水縣長(zhǎng)巖村云頂茶業(yè)基地（26°9’0”N，106°43’11”E），采集時(shí)，用剪刀剪取被貢山喙薊馬為害過(guò)的茶樹(shù)芽頭（一芽一葉）置于保鮮盒內(nèi)，帶回室內(nèi)飼養(yǎng)觀察。

成蟲(chóng)觀察：用自制吸蟲(chóng)器吸取成蟲(chóng)標(biāo)本于培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行觀察。由于貢山喙薊馬對(duì)光照有強(qiáng)烈的逃避反應(yīng)，觀察前先將活體標(biāo)本置于-20℃冰箱冷凍麻痹3 min，取出后立刻置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進(jìn)行觀察、記錄、拍照和測(cè)量。

卵的觀察：用尖頭鑷子輕輕將外層芽葉剝開(kāi)，并沿中脈將芽葉剪成兩半，找到卵粒準(zhǔn)確位置，用解剖刀從卵粒附近劃開(kāi)至葉片邊緣，用兩把尖頭鑷子沿劃痕輕輕將包裹卵粒的那部分葉肉組織撕開(kāi)，取出完整卵粒置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進(jìn)行觀察、記錄、拍照及測(cè)量。

若蟲(chóng)觀察：將采集回來(lái)的芽葉挑除全部成、若蟲(chóng)后進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察2次，待1齡若蟲(chóng)孵化后開(kāi)始單頭飼養(yǎng)并拍照記錄，每次蛻皮后（即2齡、3齡、4齡）均置于基恩士VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)下進(jìn)行觀察、記錄、拍照和測(cè)量。

1.1.2 玻片標(biāo)本顯微觀察

參照張宏瑞等[17]的方法，標(biāo)本制作前先進(jìn)行浸解（10%氫氧化鈉溶液浸泡24 h），之后用超純水沖洗多次以清除蟲(chóng)體內(nèi)容物，再置于30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%乙醇溶液中進(jìn)行逐級(jí)脫水，脫水后的薊馬轉(zhuǎn)移至丁香油中進(jìn)行軟化，用解剖針挑取軟化好的薊馬標(biāo)本放入滴有二甲苯的載玻片上于解剖鏡下進(jìn)行整姿，注意蓋片后若仍有氣泡，可在酒精燈或小太陽(yáng)取暖器上加熱趕出氣泡，以中性樹(shù)膠封片。玻片標(biāo)本置于Nikon DSRi2顯微成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照，記錄。

1.2 DNA條形碼研究

1.2.1 標(biāo)本采集

用于分子鑒定的所有標(biāo)本均為成蟲(chóng)，采集信息見(jiàn)表1。于茶園中，利用自制吸蟲(chóng)器吸取薊馬活體標(biāo)本，并轉(zhuǎn)移至盛有75%乙醇溶液的封凍管中帶回室內(nèi)，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 標(biāo)本采集信息Table1 Specimen collection information

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

1.5.2 各種植入性輸液泵和留置導(dǎo)管，為非鐵磁性或弱磁性，進(jìn)行MRI檢查通常是安全的。攜帶胰島素泵進(jìn)行MRI檢查，可破壞胰島素泵功能，故檢查前要移除胰島素泵。

參照張利娟等[18]基因組DNA的提取方法對(duì)單頭薊馬樣本提取DNA。對(duì)COI基因DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為通用引物[19-20]。引物序列：

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3'

HC02198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAATCA-3'

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTP 混 合液 4 μL，10 μmol/L 的 引 物 各 1.5 μL，5 U/μL的TaKaRa TaqDNA聚合酶0.3 μL，模板DNA 2 μL，加 dd H2O至50 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性0.5 min，50℃退火45 s，72℃延伸1 min；30輪循環(huán)； 72℃再延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

序列的拼接和相似度分析使用DNAMAN軟件進(jìn)行，結(jié)合測(cè)序峰值圖進(jìn)行正反鏈的拼接校對(duì)，將拼接好的序列在BOLD SYSTEM系統(tǒng)中進(jìn)行序列同源性搜索，以明確已測(cè)定序列是否為目標(biāo)序列片段。采用Mega7軟件[21]計(jì)算和分析遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲(chóng)體鑒定結(jié)果

鑒定主要參考《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志第55冊(cè)：纓翅目》[22]、Masumoto & Okajima[23]以及Li等[4]對(duì)喙薊馬屬M(fèi)ycterothrips的修訂與研究，通過(guò)形態(tài)特征觀察、模式標(biāo)本核對(duì)，本文鑒定該薊馬種類為貢山喙薊馬Mycterothrips gongshanensis（Li, Li & Zhang），其形態(tài)特征和種類鑒定結(jié)果記錄如下：

貢山喙薊馬（Mycterothrips gongshanensisLi,Li & Zhang, 2017）。雌蟲(chóng)體長(zhǎng)1.1 ～ 1.3 mm。體棕褐色至黑褐色；前翅暗褐色，基部和端部色淡（圖2-G）。頭部眼后有橫紋，單眼前鬃略短于單眼側(cè)鬃，單眼間鬃位于后單眼前內(nèi)緣，長(zhǎng)度超過(guò)前單眼側(cè)鬃的2倍（圖1-D）；觸角8節(jié)，節(jié)I具有1對(duì)背頂鬃，節(jié)III和節(jié)IV具有叉狀感覺(jué)錐（圖1-A）；前胸背板寬大于長(zhǎng)，具有2對(duì)長(zhǎng)的后角鬃，后緣鬃2對(duì)且內(nèi)鬃I稍長(zhǎng)于內(nèi)鬃II（圖1-D）；中胸背板具橫紋，前緣感覺(jué)孔存在（圖1-E）；后胸背板前中部具橫紋，兩側(cè)具縱紋，中對(duì)鬃位于前緣上，無(wú)感覺(jué)孔（圖1-E）；中、后胸內(nèi)叉骨均具有明顯的刺（圖1-I）；前翅前脈鬃具有長(zhǎng)的間斷，端鬃2根，后脈鬃完整，翅瓣鬃5+1根；腹部背板節(jié)II ～ VIII兩側(cè)具橫紋，橫紋上有大量微毛，節(jié)VIII具有完整的后緣梳，腹部腹板無(wú)附屬鬃，節(jié)II具有2對(duì)后緣鬃，節(jié)III ～ VII具有3對(duì)后緣鬃，節(jié)VII后緣鬃位于后緣之前（圖1-F、圖1-G、圖1-K）。

雄蟲(chóng)體長(zhǎng)0.9 ～ 1.1 mm。體色較雌蟲(chóng)淡（圖2-H）；觸角第6節(jié)幾乎與雌蟲(chóng)等長(zhǎng)（圖1-A、圖1-B）；腹部背板節(jié)VIII具有完整的后緣梳，節(jié)IX具有1對(duì)感覺(jué)孔和2對(duì)深色的刺狀鬃（圖1-H）；腹板節(jié)II無(wú)附屬鬃，節(jié)III ～ VIII有8根附屬鬃（圖1-L）。

圖1 貢山喙薊馬玻片標(biāo)本形態(tài)圖Figure 1 Morphological characteristics of slide specimen of M. gongshanensis

觀察標(biāo)本：8♀♀2♂♂，貴州貴陽(yáng)黔中茶園，2014. X. 28，呂召云采；14♀♀4♂♂，貴州貴陽(yáng)黔中茶園，2015. III. 15，呂召云、孟澤洪采；32♀♀8♂♂，貴州惠水長(zhǎng)巖，2018. VII.30，孟澤洪、楊春、周玉鋒采；1♀1♂，貴州惠水長(zhǎng)巖，2019. IV. 22，李帥采；6♀♀1♂，貴州水城龍場(chǎng)鎮(zhèn)，2019. IX. 4，李帥采；8♀♀2♂♂，貴州水城順場(chǎng)鄉(xiāng)，2019. IX. 4，李帥采；12♀♀3♂♂，貴州六枝，2019. IX. 6，李帥采；18♀♀2♂♂，貴州興義天沁茶葉基地，2019. IX. 15，李帥采。

2.2 各蟲(chóng)態(tài)特征

卵（圖2-A、圖2-B）：乳白色，半透明，腎形，長(zhǎng) 201 ～ 282 μm，寬 99 ～ 118 μm，近孵化時(shí)出現(xiàn)2個(gè)紅色眼點(diǎn)。

1齡若蟲(chóng)（圖2-C）：初孵時(shí)乳白色，后轉(zhuǎn)為淡黃綠色，長(zhǎng)354 ～ 607 μm，寬119 ～ 140 μm，頭部長(zhǎng)37 ～ 65 μm，觸角向前平伸，無(wú)翅芽。

2齡若蟲(chóng)（圖2-D）：黃綠色，長(zhǎng)708 ～1016 μm， 寬 171 ～ 199 μm， 頭 部 長(zhǎng) 65 ～ 92 μm，觸角向前平伸，無(wú)翅芽。

3齡若蟲(chóng)（偽蛹）（圖2-E）：頭胸部黃白色，腹部黃色，足和觸角白色透明，體長(zhǎng)731 ～911 μm，寬 165 ～ 265 μm，頭部長(zhǎng) 62 ～ 92 μm，翅芽開(kāi)始顯露，筒狀，無(wú)毛，后翅長(zhǎng)于前翅，觸角直立或向后貼于頭部背面。

4齡若蟲(chóng)（蛹）（圖2-F）：最初通體黃白色，足、觸角、翅白色透明，體長(zhǎng)787 ～ 1120 μm，寬 224 ～ 287 μm，頭部長(zhǎng) 79 ～ 102 μm，翅芽逐漸伸長(zhǎng)并顯露毛序，前翅和后翅幾近等長(zhǎng)，觸角向后貼于頭部背面，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程，翅與觸角顏色先變暗，逐漸全體變棕褐色。

圖2 貢山喙薊馬全蟲(chóng)態(tài)特征圖Figure 2 The whole insect stages morphology of M. gongshanensis

2.3 線粒體COI序列

貢山喙薊馬M. gongshanensis所測(cè)雙向序列經(jīng)拼接后去掉兩端引物序列得到15個(gè)樣本序列長(zhǎng)度均為655 bp，序列相似度高為99.84%，變異位點(diǎn)數(shù)3個(gè)。序列平均堿基組成情況為：T（39.2%）、C（18.2%）、A（30.0%）、G（12.6%），具較明顯AT偏向性。所獲序列在BOLD系統(tǒng)中進(jìn)行初步比對(duì)，與其序列同源性最高的為喙薊馬屬M(fèi)ycterothrips的種類（88.5%），證明所測(cè)片段為目標(biāo)序列。對(duì)實(shí)驗(yàn)獲取的DNA條形碼序列的遺傳距離分析（Kimura 2-parameter distances）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛腹喙薊馬6個(gè)地理種群的15個(gè)樣本種內(nèi)遺傳距離極小，為0.00% ～0.46%（表2）。

表2 基于Kimura 2P的貢山喙薊馬種內(nèi)遺傳距離Table 2 Intraspecific genetic distance of M. gongshanensis based on Kimura 2P

3 結(jié)論和討論

本文鑒定了一種廣泛發(fā)生于貴州茶園的重要薊馬害蟲(chóng)——貢山喙薊馬M. gongshanensis，該蟲(chóng)形態(tài)特征與另一種茶樹(shù)薊馬毛腹喙薊馬M.setiventris非常相似，但可從以下特征進(jìn)行區(qū)分：（1）貢山喙薊馬前翅僅基部和端部色淡，而毛腹喙薊馬前翅中部常具一淺色域；（2）貢山喙薊馬后胸背板中對(duì)鬃位于前緣上，毛腹喙薊馬后胸背板中對(duì)鬃靠近；（3）貢山喙薊馬雄蟲(chóng)陽(yáng)基腹突端域并不膨大且腹部背板節(jié)IX后緣具1對(duì)非常小的結(jié)節(jié)而非粗的SB1鬃[4]。生產(chǎn)實(shí)踐中人們往往無(wú)法通過(guò)玻片標(biāo)本特征對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行識(shí)別，本文提供了貢山喙薊馬的各蟲(chóng)態(tài)生態(tài)照片，方便對(duì)該蟲(chóng)進(jìn)行初步鑒定。

除形態(tài)鑒定外，線粒體COI序列片段亦可輔助鑒定薊馬種類[24-26]。本文提交了貢山喙薊馬M. gongshanensis的線粒體COI數(shù)據(jù)（MT367384～ MT367392，MW288286 ～ MW288291）， 為該薊馬的分子鑒定以及遺傳多樣性研究提供了原始的分子數(shù)據(jù)參考。一般來(lái)講，2%的遺傳距離被認(rèn)為是種間和種內(nèi)差異的一個(gè)界限[20]，本文中6個(gè)地區(qū)貢山喙薊馬M. gongshanensis的15個(gè)樣本種內(nèi)最大差異值（0.46%）遠(yuǎn)小于界限值，且經(jīng)核實(shí)，本文提交的貢山喙薊馬M.gongshanensis的DNA條形碼數(shù)據(jù)與其模式標(biāo)本完全吻合，說(shuō)明數(shù)據(jù)真實(shí)有效。由于目前世界上已公布的關(guān)于喙薊馬屬昆蟲(chóng)的分子遺傳信息極少，因此僅用線粒體COI序列不足以作為該蟲(chóng)的鑒別依據(jù)。

此外，貢山喙薊馬除形態(tài)特征與毛腹喙薊馬相近外，二者發(fā)生為害特點(diǎn)也有許多共同點(diǎn)：均喜為害茶樹(shù)未展開(kāi)或部分展開(kāi)的芽頭，受害幼嫩芽葉正面褐化甚至芽頭脫落，每年9 ～ 10月份為害最為嚴(yán)重等[4,27]。

在對(duì)貢山喙薊馬的首次分類記述中，該害蟲(chóng)就被認(rèn)為可能是茶園一個(gè)潛在的害蟲(chóng)[4]。通過(guò)近年來(lái)的調(diào)查，我們證實(shí)了其在貴州的廣泛分布并認(rèn)為該蟲(chóng)是貴州茶園一種重要吸汁性害蟲(chóng)。鑒于該害蟲(chóng)在貴州省的發(fā)生和為害現(xiàn)狀，亟待開(kāi)展其在我國(guó)其它茶區(qū)的分布與為害情況調(diào)查、生物學(xué)與生態(tài)學(xué)特性、防治技術(shù)等方面的深入研究。