木聚糖酶產生菌的篩選

薛云霞 范繼紅 羅丞燕 杜國豐

（營口理工學院化學與環(huán)境工程學院，遼寧 營口 115014）

木聚糖酶是一類重要的木糖苷鍵水解酶，能特異降解植物中的木聚糖[1]。木聚糖雖然廣泛地存在于秸稈，玉米芯等農副產品中，但未能被充分利用，如在造紙工業(yè)中，富含木聚糖的廢料再利用度低，若直接排放會造成水體富營養(yǎng)化、污染環(huán)境問題[2-3]。本研究秉持“以廢治廢”的環(huán)保新理念，從堆積過玉米秸稈的土樣中篩選出能產生木聚糖酶的菌株，木聚糖酶菌株可將木聚糖進一步降解成木寡糖和木糖進行高值化利用，為工業(yè)生產中有用產品，其潛在的經濟效益和環(huán)保意義是重大的[4-6]。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

1.樣品

土壤樣品：采自遼寧營口東站附近的玉米秸稈堆積處、種植玉米的田地等處的土壤。

2.試劑

木聚糖（純度≥90%）：麥克林公司；D -木糖（純度≥99%）：天津福晨化學試劑廠；剛果紅（生物染料）：麥克林公司；3,5-二硝基水楊酸（純度≥98%）：上海國藥集團化學試劑公司。其他試劑均為市售分析純。

3.培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：木聚糖10g/L,蛋白胨5g/L,NaCl 5g/L。

初篩培養(yǎng)基：木聚糖5g/L,KNO30.2g/L,MgSO40.2g/L,NaCl 0.5g/L,K2HPO40.5g/L,瓊脂20g/L。

PDA 斜面培養(yǎng)基：稱取200g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000mL 煮沸，紗布過濾，濾液補足1000mL，再加20g 葡萄糖和20g 瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每管約5-10mL，121℃滅菌20min 取出試管擺斜面，冷卻后儲存?zhèn)溆谩?/p>

復篩培養(yǎng)基：木聚糖10g/L,(NH4)2SO41.5g/L,NaCl 5g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO40.2g/L。

（二）儀器與設備

FA2104N 電子天平：上海方瑞儀器有限公司；VIS-7220N 可見光分光光度計：上海方瑞儀器有限公司；DL-1 電子萬用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HH-6 數顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；K318 臺式高速冷凍離心機：德國Sigma 公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；PHS-3C pH 計：上海精密科學儀器有限公司；BJ-2CD 潔凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

（三）方法

1.產木聚糖酶菌株的初篩

取10g 土樣于裝有已滅菌的90mL 富集培養(yǎng)液的三角瓶中，35℃、120r/min 振蕩培養(yǎng)24h。取100μL 富集液于裝有900μL 無菌水的1.5mL EP 管中，進行梯度稀釋，分別取10-2，10-3，10-4稀釋菌液200μL，涂布初篩培養(yǎng)基平板，35℃靜置培養(yǎng)3-5 天，待平板上長出菌落后，用3mg/mL 的剛果紅染液染色10min 后倒出染液，注入1mol/L NaCl 沖洗，將平板靜置過夜，觀察菌落周圍有透明圈出現的單菌落，挑選到PDA 斜面培養(yǎng)基在35℃下靜置培養(yǎng)3天。將分離到的菌株再次點接到初篩培養(yǎng)基中，利用剛果紅染色，記錄透明圈直徑（H）和菌落直徑（C）的大小，計算 H/C 值。

2.產木聚糖酶菌株的復篩

將分離得到的產生透明圈大的菌株由斜面轉接到50mL 復篩培養(yǎng)基，35℃，150r/min 振蕩培養(yǎng)5-7 天，發(fā)酵液8000r/min 離心2min，取上清液，進行DNS 酶活力測定。

3.D-木糖標準曲線的繪制

配制1 g/L D-木糖標準溶液，取8 支25mL 刻度試管，分別加入D-木糖標準溶液0、0.2 mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，1.4mL，分別加入蒸餾水補至2.0mL，制成D-木糖含量為0、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5 g/L、0.6 g/L 和0.7g/L 的溶液，最后加入1.5 mL DNS 試劑搖勻，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水定容至25 mL 并于波長540nm 下測定吸光度值。以D-木糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制D-木糖標準曲線。標準曲線回歸方程為y=0.0869x-0.1025，相關系數 R2=0.9981。

4.DNS 酶活力測定

取適當稀釋的上清酶液0.2mL，加入1.8mL 5g/L 的木聚糖底物，于50℃水浴中反應30min 后加入1.5mL DNS 試劑，在沸水浴中加熱5min，冷卻后定容至25mL，于540nm 波長測定吸光度值。

酶活力單位定義：在上述測定條件下，1 mL 粗酶液每分鐘水解木聚糖底物產生1μmol 木糖所需的酶量（U/mL）。

5.菌株的革蘭氏染色觀察

取分離純化的目標菌株，通過涂片、固定、初染、媒染、復染，用顯微鏡油鏡觀察菌體形態(tài)。

二、結果與分析

（一）產木聚糖酶菌株的初篩

以木聚糖為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基經過5 天培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基表面有大量菌落出現，經剛果紅染色、NaCl 清洗，過夜培養(yǎng)，篩選出7 株產生透明圈的單菌落（圖1），分別標號XFL-1、XFL-2、XFL-3、XFL-4、XFL-5、XFL-6、XFL-7。對7 株菌的 H/C 值進行了測定、計算，結果見表1，由表1 可知，編號XFL-3 菌株的H/C 值最大，為3.41，編號XFL-2、XFL-5、XFL-6 的三株菌的H/C 值也達到2.0 以上，XFL-4 菌株的H/C 值最小，為1.23。為了進一步鑒定菌株的產酶能力，通過液體復篩進一步確定目標菌株。

圖1 初篩平板中的菌落，經剛果紅染色出現的透明圈

表1 初篩菌株的H/C 值

（二）產木聚糖酶菌株的復篩

進一步對初篩得到的7 株菌株進行搖瓶發(fā)酵，利用DNS 法測定木聚糖酶活力，發(fā)現有6 株菌具有產木聚糖酶的能力，其中XFL-3 菌株的木聚糖酶活力最高，達到 403.8 U/mL。 由表1 和表2 可知，有透明圈的菌株不一定具有產木聚糖酶能力，菌株XFL-4 未檢測出酶活，可能是由于木聚糖中不僅含有木聚糖成分，還含有少量的蔗糖、纖維素等雜質；菌株的產酶能力和菌落的HC 值也不成比例（表2），綜合考慮，確定菌株XFL-3 為后續(xù)研究的木聚糖酶產生菌。

表2 初篩菌株的產酶活力

（三）菌株的形態(tài)學觀察

對XFL-3 菌株的革蘭氏染色形態(tài)觀察，發(fā)現菌株呈紅色球狀，說明菌株XFL-3 是一株革蘭氏陰性球菌（圖2）。

圖2 菌株XFL-3 的革蘭氏染色菌體形態(tài)

三、結論與討論

利用木聚糖為唯一碳源，經過初篩觀察透明圈、測定H/C 值、DNS 法對菌株進行酶活力測定復篩。成功從營口東站附近的秸稈堆積處篩選出一株產木聚糖的菌株XFL-3，其在以木聚糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵5 天，酶活達到403.8U/mL（該處未進行產酶條件優(yōu)化）。

本研究篩選得到的產木聚糖酶的菌株，后續(xù)可對其產酶條件進行優(yōu)化，進一步提升其產酶能力，有望解決產酶菌株匱乏，菌株產酶能力低的問題，可用于治理造紙等環(huán)保領域的環(huán)境污染。