IL28B基因多態(tài)性對HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者抗病毒療效及停藥后復(fù)發(fā)的影響

李 莎，莫雨靈，呂建楠

我國現(xiàn)有慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者約為2000萬，其中30%～50%為HBeAg陰性，而HBeAg陰性患者更易進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。核苷（酸）類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]、聚乙二醇干擾素-α（pegylated interferon-α,Peg-IFN-α）及普通 IFN-α 單藥、聯(lián)合或序貫治療是當(dāng)前國內(nèi)指南推薦的首選抗HBV方案，然而療效存在較大的個體差異，因此，推測宿主遺傳背景下的免疫反應(yīng)可能影響HBV感染后的疾病轉(zhuǎn)歸及抗病毒療效[2]。IL-28B即IFN-λ3，在動物體內(nèi)以及細(xì)胞模型中均具有良好的抗HBV/HCV活性[3]，其基因多態(tài)性與HCV感染者的自發(fā)性病毒清除及IFN治療誘導(dǎo)的病毒清除密切相關(guān)[4]。但I(xiàn)L28B基因多態(tài)性對HBV感染者的IFN療效預(yù)測價值存在爭議[5-7]，尚需在不同地域以及不同種族人群間進(jìn)行深入研究。本研究以廣西漢族人群為研究對象，探討IL28B rs12979860不同基因型與HBeAg陰性CHB患者應(yīng)用富馬酸替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate,TDF）序貫或聯(lián)合普通IFN-α療效間的關(guān)系，從而為加深對慢性HBV感染免疫發(fā)病機制的理解以及指導(dǎo)臨床治療提供思路。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2016年1月—2019年12月在南寧市第四人民醫(yī)院和北海市人民醫(yī)院門診或住院的119例初次接受TDF治療有效并完成序貫或聯(lián)合普通IFN-α抗病毒治療的HBeAg陰性CHB患者作為研究對象。HBeAg陰性CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)。具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：血清HBsAg和HBV DNA陽性，HBeAg持續(xù)陰性，抗-HBe陽性或陰性，血清ALT反復(fù)或持續(xù)異常，或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無其他肝臟疾??；②年齡＞18周歲；③用藥依從性良好，能完成全程抗病毒治療及隨訪觀察。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 119例患者初始均給予TDF[葛蘭素史克（天津）有限公司，規(guī)格300 mg，批號19055076]300 mg，1次/d，口服，且均達(dá)到HBV DNA持續(xù)檢測不到水平。根據(jù)治療144周時HBsAg水平進(jìn)行個體化治療分組。對于HBsAg≤1000 IU/ml者序貫應(yīng)用普通IFN-α2b（北京凱因科技股份有限公司，規(guī)格1 ml∶500萬IU，批號20191278）500萬IU，隔日1次，皮下注射，連續(xù)用藥48周；對于HBsAg＞1000 IU/ml者則聯(lián)合應(yīng)用普通IFN-α2b 500萬IU，隔日1次，皮下注射，連續(xù)用藥48周。所有患者根據(jù)治療192周時HBsAg水平?jīng)Q定是否停藥，停藥者平均隨訪18（6～30）個月。停藥標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]推薦的停藥標(biāo)準(zhǔn)，即HBeAg陰性CHB患者采用NAs治療至少4年，HBV DNA陰轉(zhuǎn)，HBV DNA持續(xù)檢測不到超過3年，肝功能持續(xù)正常，HBsAg≤1000 IU/ml（HBsAg定量對HBeAg陰性CHB患者抗病毒治療效果和停藥后療效預(yù)測方面具有一定的臨床指導(dǎo)意義[9]）。

1.2.2 指標(biāo)檢測 采用PCR產(chǎn)物直接測序方法對患者IL28B rs12979860多態(tài)性進(jìn)行測序分型：所有患者均采集外周血2 ml，用EDTA管收集并于-70 ℃凍存?zhèn)溆?，采用離心柱法提取人基因組DNA，用PCR對基因進(jìn)行擴增并進(jìn)行產(chǎn)物純化回收；采用BigDye Terminator v1.1試劑盒，通過ABI 3730測序儀對測序引物進(jìn)行測序分型，利用3730 Fast System V1.3.1 SDS圖像分析軟件分析IL28B rs12979860多態(tài)性分型結(jié)果。采用肝臟瞬時彈性成像掃描儀（Fibroscan，法國Echosens公司）測量并記錄受試者不同時間點的肝臟硬度測定值（liver stiffness measurement,LSM）。采用EasyCuta全自動時間分辨熒光分析儀（珀金埃爾默儀器有限公司）對患者不同時間點的HBV血清學(xué)標(biāo)志物（抗-HBs、HBsAg、抗-HBe、HBeAg）進(jìn)行定量檢測。采用實時熒光定量PCR方法對患者不同時間點血清標(biāo)本中HBV DNA含量進(jìn)行檢測，檢測儀器采用ABI-7500實時熒光定量PCR擴增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.3 療效判定 抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、免疫學(xué)應(yīng)答及組織學(xué)應(yīng)答定義符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，計數(shù)資料用例（%）表示；計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基線特征及不同IL28B rs12979860基因型患者的差別 119例患者的基線特征見表1。IL28B rs12979860 CC基因型和非CC基因型患者各基線特征比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 患者基線特征及不同IL28B rs12979860基因型患者的差別Table 1 Baseline characteristics of patients and differences in patients with different IL28B rs12979860 genotypes

2.2 治療192周時不同IL28B rs12979860基因型患者血清學(xué)應(yīng)答狀況 治療192周時HBsAg≤1000 IU/ml的患者比例為60.5%（72/119），其中4例發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。IL28B rs12979860 CC基因型患者中HBsAg≤1000 IU/ml者占65.7%（65/99），而非CC基因型患者中HBsAg≤1000 IU/ml者占35.0%（7/20），2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。治療192周時，IL28B rs12979860 CC基因型患者HBsAg下降水平為（1.0±0.4）lg IU/ml，而非CC基因型患者僅為（0.8±0.3）lg IU/ml，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.116，P=0.036），而且4例發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者均為CC基因型表達(dá)者。

表2 不同IL28B rs12979860基因型患者的血清學(xué)應(yīng)答狀況（例）Table 2 Serological response in patients with different IL28B rs12979860 genotypes(cases)

2.3 治療192周時不同IL28B rs12979860基因型患者肝臟組織學(xué)應(yīng)答情況 治療192周時IL28B rs12979860 CC基因型患者LSM的平均下降水平為（3.4±1.3）kPa，而非CC基因型患者僅為（2.6±1.4）kPa，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.788，P=0.015）。

2.4 IL28B rs12979860基因型與停藥隨訪6個月時復(fù)發(fā)的關(guān)系 治療至192周時，72例患者HBsAg≤1000 IU/ml，其中IL28B rs12979860 CC基因型患者65例，非CC基因型患者7例。停藥隨訪6個月時有16例復(fù)發(fā)，CC和非CC基因型患者所占的比例分別為16.9%（11/65）及71.4%（5/7），2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同IL28B rs12979860基因型患者停藥隨訪6個月復(fù)發(fā)情況（例）Table 3 Relapse of patients with different IL28B rs12979860 genotypes at 6-month follow-ups after drug withdrawal(cases)

2.5 IL28B rs12979860基因型與抗病毒治療期間的藥物不良反應(yīng)間的關(guān)系 119例患者在抗病毒治療期間的藥物不良反應(yīng)主要包括血乳酸升高、血磷降低、一過性骨髓抑制、甲狀腺功能異常、食欲減退、體質(zhì)量減輕及脫發(fā)等，對不同IL28B rs12979860基因型患者的上述藥物不良反應(yīng)發(fā)生率進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表4。

表4 不同IL28B rs12979860基因型患者抗病毒治療期間的不良反應(yīng)[例（%）]Table 4 Adverse reactions during antiviral therapy in patients with different IL28B rs12979860 genotypes[cases(%)]

3 討 論

本研究結(jié)果表明，HBeAg陰性CHB患者應(yīng)用TDF序貫或聯(lián)合IFN-α可以獲得較好的免疫學(xué)及組織學(xué)應(yīng)答，IL28B rs12979860 CC基因型可能是 HBeAg陰性CHB患者取得抗病毒療效及停藥6個月不復(fù)發(fā)的預(yù)測因素。對NAs經(jīng)治CHB患者序貫或聯(lián)合Peg-IFN-α可有效提升抗病毒療效，使部分患者獲得臨床治愈，并可以進(jìn)一步降低HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生率[1]。Tatsukawa等[10]研究表明，HBeAg陰性CHB患者應(yīng)用NAs長期治療期間，序貫以長效IFN治療，對降低HBsAg水平的效果可能優(yōu)于聯(lián)合長效IFN治療。本研究證實，TDF經(jīng)治CHB患者序貫或聯(lián)合IFN-α治療至192周時，其血清學(xué)應(yīng)答率為60.5%，有4例患者發(fā)生了HBsAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

先前研究證實，IL28B rs12979860基因多態(tài)性不僅與HCV感染者的疾病轉(zhuǎn)歸，而且與病毒載量密切相關(guān)[4]。IL28B基因編碼IFN-λ3，后者與IFN-α一樣，也是通過激活JAK-STAT信號并最終通過活化ISGs在抗HBV/HCV感染免疫中發(fā)揮重要的作用[4]。而且，在轉(zhuǎn)基因鼠肝細(xì)胞模型中，外源性IFN-λ2通過上調(diào)ISGs而發(fā)揮對HBV良好的抑制效應(yīng)[11]?；谏鲜鲅芯浚茰yIL28B基因多態(tài)性可能與慢性HBV感染者臨床轉(zhuǎn)歸及IFN-α抗病毒療效相關(guān)。但也有部分研究觀點與該推測相矛盾。一項針對亞洲人群的Meta分析表明，IL28B基因多態(tài)性與HBV感染者疾病進(jìn)程無相關(guān)性[12]。來自Jilg 等[13]的研究認(rèn)為，IL28B基因多態(tài)性與IFN治療CHB患者誘導(dǎo)的病毒清除間的關(guān)系較微弱，即使存在，可能也局限于某些亞組，如HBeAg狀態(tài)或某種HBV基因型患者。而來自Domagalski等[14]研究則證實，IL28B基因多態(tài)性對IFN治療兒童CHB效果具有良好的預(yù)測價值。

本研究以廣西漢族人群為研究對象，探討IL28B rs12979860多態(tài)性對HBeAg陰性CHB患者TDF序貫或聯(lián)合IFN-α抗病毒療效的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，序貫或聯(lián)合IFN-α 48周后攜帶IL28B rs12979860 CC基因型患者的HBsAg下降水平及肝臟纖維化改善情況均顯著優(yōu)于非CC基因型患者；而且在達(dá)到停藥標(biāo)準(zhǔn)的患者中，隨訪6個月時非CC基因型患者更容易復(fù)發(fā)。這與Wei等[7]的研究結(jié)果不同，該研究發(fā)現(xiàn)IL28B基因型與長效IFN治療HBeAg陰性和陽性的CHB患者的效果均不相關(guān)。然而，一項來自北歐和亞洲的多中心研究表明，IL28B基因多態(tài)性與IFN誘導(dǎo)的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換及HBsAg血清學(xué)清除密切相關(guān)[5]。Lampertico等[6]通過研究HBV基因D型HBeAg陰性CHB患者采用IFN治療的效果與IL28B rs12979860多態(tài)性間的關(guān)系證實，IL28B基因型不僅與IFN治療結(jié)束時病毒學(xué)應(yīng)答及持續(xù)病毒應(yīng)答率相關(guān)，而且與長期隨訪的HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[6]。IL28B基因多態(tài)性與IFN誘導(dǎo)的CHB患者的病毒學(xué)及血清學(xué)應(yīng)答關(guān)系尚不十分清楚，可能與優(yōu)勢等位基因純合子基因型者高表達(dá)Ⅲ型IFN導(dǎo)致基線病毒水平較低相關(guān)。這與Vergori等[15]的研究結(jié)論相一致，該研究發(fā)現(xiàn)IL28B rs12979860 CC基因型患者HBsAg定量及HBV DNA水平顯著低于非CC基因型患者。但目前關(guān)于IL28B基因多態(tài)性與IFN誘導(dǎo)的CHB患者的病毒學(xué)及血清學(xué)應(yīng)答相關(guān)研究結(jié)論存在差異，可能與在不同的研究隊列中納入的種族人群、樣本量大小、治療策略及療程以及隨訪時間不同有關(guān)，尚須進(jìn)一步研究探討。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用NAs及IFN治療期間的常見不良反應(yīng)在IL28B rs12979860 CC基因型和非CC基因型患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而Lotrich等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IL28B rs12979860 C等位基因與IFN相關(guān)的乏力、食欲下降及失眠等不良反應(yīng)密切相關(guān)。Miyamura等[17]研究則發(fā)現(xiàn)，IL28B rs8099917 G等位基因與Peg-IFNα-2a/利巴韋林治療期間發(fā)生一過性骨髓抑制相關(guān)。這可能與種族人群的差異或HBV與HCV所誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答不同所致，尚須深入研究。

總之，我國廣西漢族人群的IL28B rs12979860基因多態(tài)性不僅與HBeAg陰性CHB患者TDF序貫或聯(lián)合IFN-α治療的血清學(xué)應(yīng)答及組織學(xué)應(yīng)答密切相關(guān)，而且與停藥后6個月的是否復(fù)發(fā)相關(guān)。