AIDS患者高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療后25-羥基維生素D水平與T細(xì)胞亞群含量及病毒載量的關(guān)系

李松鵬，景紅艷，尹光鳳，雷黎明，劉壽芳

AIDS是由HIV感染而引起的慢性傳染病，以機(jī)體免疫系統(tǒng)功能下降或抑制為特征，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞水平和活性降低，異常免疫激活，機(jī)體因喪失了對外界病原體的防御功能易發(fā)生機(jī)會性感染，嚴(yán)重者可誘發(fā)惡性腫瘤等病變[1]。高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）能顯著抑制HIV復(fù)制，進(jìn)而提高患者CD4+T細(xì)胞水平，在目前臨床指南推薦的規(guī)律治療方案中，被認(rèn)為是最有效的治療方法[2]。維生素D在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N類固醇激素，對人體的生長、代謝和免疫具有重要作用。人體內(nèi)維生素D的正常含量不低于20～38 nmol/L，可通過檢測血漿中25-羥基維生素D體現(xiàn)。有研究報道，1，25-羥基維生素D3（體內(nèi)維生素D的活性形式）可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而對HIV復(fù)制發(fā)揮抑制作用[3]。以往多集中于研究HAART對AIDS療效和CD4+T細(xì)胞的影響[4]，較少關(guān)注25-羥基維生素D與T細(xì)胞亞群及病毒載量的關(guān)系，因此本研究通過分析HAART后AIDS患者25-羥基維生素D水平、T細(xì)胞亞群及病毒載量的變化及相關(guān)性，進(jìn)而為評估AIDS的治療效果提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年6月—2019年12月昆明市第三人民醫(yī)院診治的128例AIDS患者作為研究對象。其中，男85例，女43例；年齡21～53歲，平均為40.28（28.11，46.19）歲；病程1～10年，平均為（4.73±1.56）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18歲；②符合《艾滋病診療指南（第三版）》[5]的診斷標(biāo)準(zhǔn)并確診為AIDS；③未接受過其他抗病毒治療方案；③臨床病歷資料完整；④患者及家屬均知情，簽署同意書并能積極主動配合本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并機(jī)會性感染及其他血液免疫疾??；②合并其他臟器功能障礙性疾?。虎酆喜盒阅[瘤；④對所用藥物有禁忌證；⑤治療過程中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；⑥有心理、精神疾?。虎呷焉锱?。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 治療方法 患者入院完善相關(guān)檢查后均接受規(guī)律HAART。具體方案如下：拉米夫定[葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030581，規(guī)格0.1 g]，300 mg/次，1次/d；齊多夫定（上?，F(xiàn)代制藥海門有限公司，國藥準(zhǔn)字H20163036，規(guī)格0.3 g），300 mg/次，2次/d；奈韋拉平（上海迪賽諾制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020580，規(guī)格0.2 g），200 mg/次，1次/d。研究發(fā)現(xiàn)該方案轉(zhuǎn)陰率較高（85.7%）[6-7]，因此采用該方案持續(xù)治療12個月，不定期對患者進(jìn)行隨訪，期間每隔6個月采集患者外周血進(jìn)行檢測。根據(jù)《艾滋病診療指南（第三版）》[5]對抗病毒療效進(jìn)行評定。病毒抑制率指標(biāo)：HAART后3～6個月HIV載量達(dá)到檢測不到水平。病毒學(xué)失敗標(biāo)準(zhǔn)：持續(xù)HAART 12個月后血漿HIV載量持續(xù)＞200拷貝/ml。免疫學(xué)應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)：HAART 12個月后CD4+T細(xì)胞計數(shù)較基線增長≥100個/μl。

1.3 25-羥基維生素D水平測定 分別于治療前和治療后1年，采集患者空腹靜脈血2 ml，采用BECKMAN AU5400全自動化學(xué)分析儀（美國貝克曼公司）及北京九強(qiáng)生物技術(shù)公司試劑，嚴(yán)格按照說明書，經(jīng)免疫比濁法測定25-羥基維生素D水平。

1.4 T細(xì)胞亞群含量測定 分別于治療前和治療后1年，采集患者空腹靜脈血3 ml置于TDTA-K2抗凝管中，從各抗凝管中分別取100 μl抗凝血至已編號的流式管中，分別加20 μl熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD3-PC5、CD4-PE以及CD8-FITC，震蕩混勻，避光作用20 min，各加2 ml紅細(xì)胞裂解液后震蕩混勻，并避光作用10 min，1000 r/min離心5 min后棄上清，加適量生理鹽水重懸細(xì)胞，再次離心后棄上清，各加0.5 ml生理鹽水將細(xì)胞重懸，用BECKMAN COULTER流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）檢測CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞，獲取的數(shù)據(jù)采用System U軟件分析。

1.5 病毒載量測定 分別于治療前和治療后1年，采集患者空腹靜脈血2 ml，采用COBAS AmpliPrep全自動PCR分析儀及HIV-1 Monitor1.5商品化試劑盒（瑞士羅氏公司）嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行測定，定量分析血漿中HIV RNA，以每毫升血漿含病毒拷貝數(shù)的形式表示結(jié)果，最低檢測限為50拷貝/ml。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。計量資料呈正態(tài)分布以±s表示，比較采用自身配對t檢驗；呈非正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療前后25-羥基維生素D、T細(xì)胞亞群含量及病毒載量變化 128例AIDS患者治療后25-羥基維生素D、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平及CD4/CD8比值均升高，CD8+T細(xì)胞、HIV RNA水平降低，與治療前相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 治療前后25-羥基維生素D、T細(xì)胞亞群含量及病毒載量變化Table 1 Changes of 25-hydroxyvitamin D,T cell subsets and viral load before and after treatment

2.2 治療后不同25-羥基維生素D水平患者的情況 根據(jù)治療后25-羥基維生素D水平，將患者分為25-羥基維生素D＜30 ng/ml組和≥30 ng/ml組。25-羥基維生素D≥30 ng/ml組的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平以及CD4/CD8比值明顯高于25-羥基維生素D＜30 ng/ml組，CD8+T細(xì)胞、HIV RNA水平明顯低于25-羥基維生素D＜30 ng/ml組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 治療后不同25-羥基維生素D水平患者的情況Table 2 Patients with different 25-hydroxyvitamin D levels after treatment

2.3 治療后不同CD4+T細(xì)胞水平患者的情況 根據(jù)治療后CD4+T細(xì)胞水平不同，將患者分為CD4+T細(xì)胞＜500個 /μl組和≥500個 /μl組。CD4+T細(xì)胞≥500個/μl組的25-羥基維生素D、CD3+T細(xì)胞水平以及CD4/CD8比值明顯高于CD4+T細(xì)胞＜500個/μl組，CD8+T細(xì)胞、HIV RNA水平明顯低于CD4+T細(xì)胞＜500個/μl組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 治療后不同CD4+ T細(xì)胞水平患者的情況Table 3 Patients with different CD4+ T cell levels after treatment

2.4 治療后不同HIV RNA水平患者的情況 根據(jù)治療后HIV RNA水平不同，將患者分為HIV RNA＜400拷貝/ml組和≥400拷貝/ml組。HIV RNA＜400拷貝/ml組的25-羥基維生素D、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平以及CD4/CD8比值明顯高于HIV RNA≥400拷貝/ml組，CD8+T細(xì)胞水平明顯低于HIV RNA≥400拷貝/ml組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 治療后不同HIV RNA水平患者的情況Table 4 Patients with different levels of HIV RNA after treatment

2.5 治療前后25-羥基維生素D、T細(xì)胞亞群及HIV RNA間的相關(guān)性 采用Spearman分析分別對治療前和治療后的25-羥基維生素D、T細(xì)胞亞群及HIV RNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，治療前，25-羥基維生素D水平與CD3+T細(xì)胞（r=0.219，P=0.001）、CD4+T細(xì)胞水平（r=0.570，P=0.003）及CD4/CD8比值（r=0.409，P=0.000）呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞（r=-0.387，P=0.005）和HIV RNA水平（r=-0.629，P=0.008）呈負(fù)相關(guān)。HIV RNA水 平 與 CD3+T細(xì) 胞（r=-0.548，P=0.000）、CD4+T細(xì)胞水平（r=-0.579，P=0.006）及CD4/CD8比值（r=-0.624，P=0.001）呈負(fù)相關(guān)， 與 CD8+T細(xì) 胞 水 平（r=0.671，P=0.002）呈正相關(guān)。治療后，25-羥基維生素D水平與CD3+T細(xì) 胞（r=0.547，P=0.008）、CD4+T細(xì)胞 水 平（r=0.821，P=0.000） 及 CD4/CD8比 值（r=0.630，P=0.005）呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞（r=-0.295，P=0.009）和HIV RNA水平（r=-0.460，P=0.001）呈負(fù)相關(guān)。HIV RNA水平與CD3+T細(xì)胞（r=-0.702，P=0.004）、CD4+T細(xì)胞水平（r=-0.681，P=0.006）及CD4/CD8比值（r=-0.729，P=0.007）呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞水平（r=0.392，P=0.008）呈正相關(guān)。

3 討 論

CD4+T細(xì)胞是HIV感染的主要靶細(xì)胞。HIV通過識別CD4+T細(xì)胞表面的特異性蛋白分子而侵入細(xì)胞內(nèi)，并將自身基因整合到細(xì)胞DNA上，進(jìn)而隨著細(xì)胞增殖而復(fù)制繁殖，但CD4+T細(xì)胞會在HIV破壁而出時發(fā)生凋亡，進(jìn)而無法將抗原信息遞呈給CD8+T細(xì)胞，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞無法有效發(fā)揮毒性作用，最終導(dǎo)致多種固有免疫細(xì)胞及獲得性免疫細(xì)胞均受到損害[8]。近年來臨床上多推薦HAART方案用于AIDS的治療，即將3種或3種以上的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合使用，通過對HIV復(fù)制周期的多個環(huán)節(jié)進(jìn)行阻斷，以最大程度地抑制HIV復(fù)制，降低病毒載量，進(jìn)而使CD4+T細(xì)胞水平升高[9]。

目前，HIV載量和CD4+T細(xì)胞是評估AIDS病情、臨床用藥效果以及預(yù)后的重要檢測指標(biāo)[10]。胡水秀等[11]分析發(fā)現(xiàn)，HAART后第1年CD4+T細(xì)胞水平迅速升高，盡管之后升高幅度逐漸減小，但升高可持續(xù)至第5年，提示長期抗病毒治療能使AIDS患者的免疫功能持續(xù)恢復(fù)，應(yīng)加強(qiáng)患者HAART后首年的預(yù)后管理，以及早取得免疫學(xué)效應(yīng)的最大化。因此，本研究主要分析HAART后1年的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明HIV RNA、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平、CD4/CD8比值變化符合早期多項報道[12]。關(guān)于CD8+T細(xì)胞，有資料顯示HAART前后無明顯差異，也有資料表明治療后其水平下降[13]，本研究結(jié)果與后者一致，可能跟HAART方案的差異及樣本量不同有關(guān)[14-15]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，25-羥基維生素D既能調(diào)節(jié)鈣磷代謝，又參與了細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)以及機(jī)體免疫平衡[16]。多項研究證實，25-羥基維生素D與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病等某些自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)HAART后AIDS患者的25-羥基維生素D水平升高，表明25-羥基維生素D與AIDS關(guān)系密切。25-羥基維生素D中約95%的成分為25-羥基維生素D3，活化的維生素 D通過結(jié)合T細(xì)胞上的維生素D3受體，對抗原提呈細(xì)胞以及一系列細(xì)胞因子發(fā)揮作用，進(jìn)而對T細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[20]。歐陽福等[21]對乙型肝炎肝硬化患者的研究表明，25-羥基維生素D水平與CD3+T細(xì)胞水平呈正相關(guān)，提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能與維生素D有關(guān)，補(bǔ)充維生素 D可能對患者細(xì)胞免疫功能的提高、免疫狀態(tài)的恢復(fù)有利。鄒光美等[22]研究認(rèn)為，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者25-羥基維生素D水平與CD4+T細(xì)胞水平呈正相關(guān)。本研究對AIDS患者治療后的分析中，除了發(fā)現(xiàn)25-羥基維生素D水平與CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平呈正相關(guān)外，還發(fā)現(xiàn)AIDS患者治療后25-羥基維生素D水平與CD4/CD8比值呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞和HIV RNA水平呈負(fù)相關(guān)；HIV RNA水平與CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平及CD4/CD8比值呈負(fù)相關(guān)，而與CD8+T細(xì)胞水平呈正相關(guān)。CD8+T細(xì)胞、CD4/CD8與25-羥基維生素D及HIV RNA水平之間的相關(guān)性結(jié)果與以往報道的不完全一致[23]，可能由HAART方案差異及樣本量不同所致；而HIV RNA水平與25-羥基維生素D、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平之間的相關(guān)性結(jié)果符合早期研究結(jié)果[24]，也與各指標(biāo)的相互作用機(jī)制一致。

綜上所述，AIDS患者HAART后，25-羥基維生素D水平與CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平及CD4/CD8比值呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞、HIV RNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示通過HAART在降低病毒載量的同時，或可通過補(bǔ)充維生素D以提高AIDS患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的重建。本研究的不足之處：由于為橫斷面研究導(dǎo)致無法縱向觀察HAART后的病毒學(xué)應(yīng)答以及對25-羥基維生素D、T淋巴細(xì)胞亞群的影響；未量化日常飲食中維生素D的含量，未排除季節(jié)的影響；僅收集了一種HAART方案后的臨床數(shù)據(jù)，未對行其他HAART方案后的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。今后仍須進(jìn)一步加大樣本量，擴(kuò)大研究層面以期獲得更加可靠的研究結(jié)果。