一種復(fù)合植物精油體外抑菌效果的研究

◆作者：徐靜 王新嘉 孫冰鋒 孔路軍 鄒冰潔 陳彥宏

◆單位：江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江西正邦科技股份有限公司

近年來，抗生素在畜禽飼料中的大量添加產(chǎn)生了諸多不良影響，如藥物殘留和耐藥菌產(chǎn)生，這些問題嚴(yán)重危害著畜產(chǎn)品安全與人類健康。植物精油作為一種天然提取物，一方面具有抗菌、抗氧化、抗炎癥等作用，另一方面還具有無殘留、無污染、無耐藥性的特點，近年來成為畜禽養(yǎng)殖中替代抗生素潛力的安全、新型、高效的飼料添加劑，而在食品領(lǐng)域中也是應(yīng)用廣泛。植物精油在仔豬、肉豬及其他養(yǎng)殖動物中都有非常好的效果，能保障仔豬的健康成長，提高肉豬的生長性能和豬肉品質(zhì)；同時對柑橘、大米等的保鮮及防腐效果較為顯著。本文作者研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛、百里香酚、香芹酚對致病菌的抑菌效果在市售精油當(dāng)中是比較突出的，且在植物中提取時含量較高，為進(jìn)一步了解植物精油對常見病原微生物的抑菌效果，本文對肉桂醛等3 種植物精油及其復(fù)配產(chǎn)品進(jìn)行體外抑菌試驗研究，為精油抗菌藥物開發(fā)及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試精油

肉桂醛、百里香酚、香芹酚、丁香酚、桉葉素為市場收集，精油產(chǎn)品Y 為本實驗室自制，精油產(chǎn)品J、R、T、L 均為市售產(chǎn)品。

1.2 供試菌種

大腸桿菌（ATCC25922）為本實驗室保藏。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床

1.4 實驗操作方法

1.4.1 精油體外抑菌實驗

1.4.1.1 稱取各樣品1.024g，加入9mL50% 乙醇制成102.4 mg/mL 的樣品液，超聲波處理20min。采用梯度稀釋，先10 倍稀釋一次分別得到10.24mg/mL溶液，然后按照2 倍梯度稀釋，配制 成5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16mg/mL 的樣品溶液，待用。

1.4.1.2 用接種環(huán)挑取單菌落接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h 后，用無菌水調(diào)節(jié)到OD600=0.09～0.1 備用。

1.4.1.3 于超凈工作臺內(nèi)，向每個滅菌培養(yǎng)皿中傾注10 mL的高壓滅菌過的素瓊脂（1.5%瓊脂）進(jìn)行鋪底，每個培養(yǎng)皿厚度均一，待素瓊脂冷卻凝固后，將牛津杯置于瓊脂上面。

1.4.1.4 按照100∶1 稀釋菌懸液至50℃左右的MH 固體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻（細(xì)菌濃度為5×105CFU/mL）。

1.4.1.5 將上述加過菌液的培養(yǎng)基倒入放過牛津杯的培養(yǎng)皿中，每個平皿倒15～20 mL，該層一定要均勻鋪平，待其冷卻凝固。

1.4.1.6 用鑷子夾取牛津杯形成瓊脂孔。吸取150 μL 的待檢樣樣品注入到相應(yīng)的孔內(nèi)。

1.4.1.7 將培養(yǎng)皿移至4℃冰箱中2-4h 后轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在接下來的6-12 h 內(nèi)觀察菌體的生長情況及抑菌效果，一般8-12 h 即可觀察到抑菌圈。

1.4.2 精油產(chǎn)品對飼料中微生物的抑制實驗

分別取三種精油產(chǎn)品各0.1、0.3、0.5g 加入到100mL 樣品瓶中，每個樣品瓶各加入20g 顆粒飼料和80mL 水，同時以不加精油作為對照，敞口靜置觀察產(chǎn)出氣泡的時間和上層液澄清度并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種精油的抑菌結(jié)果

由表1 看出，百里香酚的最低抑菌濃度（即MIC） 在0.64～1.28mg/mL 之間，香芹酚的MIC 在0.64～1.28mg/mL 之間，丁香酚的MIC 在2.56～5.12mg/mL之間，肉桂醛的MIC 在0.64～1.28mg/mL 之間，桉葉素在設(shè)置的濃度范圍之間沒有表現(xiàn)出抑菌效果。因此選擇百里香酚、香芹酚、肉桂醛復(fù)配成精油產(chǎn)品進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 植物精油抑菌圈直徑（mm）

2.2 精油產(chǎn)品對飼料中微生物的抑制結(jié)果

圖2 和圖1 比較，可看出，靜置過夜后，當(dāng)加入0.1g 精油時，與對照相比，R0.1、J0.1 與對照一樣都發(fā)泡嚴(yán)重且上層液變渾濁，而Y0.1 無明顯變化；當(dāng)加入0.3g 精油時，與對照相比，R0.3、J0.3 都產(chǎn)生了少量氣泡且上層液變渾濁，而Y0.3 無明顯變化；當(dāng)加入0.5g 精油時，與對照相比，R0.1、Y0.1、J0.1 均無明顯變化；圖4 和圖3 比較，可看出，靜置過夜后，當(dāng)加入0.1g 精油時，與對照相比，T0.1、L0.1 與對照一樣都產(chǎn)生了氣泡且上層液變渾濁、飼料上浮，而Y0.1 無明顯變化。

圖1 精油+20g 飼料+80mL 水（0h）

圖2 精油+20g 飼料+80mL 水（19h）

圖3 精油+20g 飼料+80mL 水（0h）

圖4 精油+20g 飼料+80mL 水（19h）

由此可得出，精油產(chǎn)品Y 對飼料中微生物的抑制效果優(yōu)于精油產(chǎn)品J、R、T、L。

3 結(jié)論

植物精油種類繁多，不同的種類對病原菌的抑制效果不一樣，而且植物精油與其他物質(zhì)也有一定的協(xié)同作用。王康莉等（2019） 提出肉桂醛和百里香酚的抑菌效果優(yōu)于香蘭素，并且復(fù)配時具有協(xié)同效果；張皓然等（2018） 得出植物精油中肉桂醛的抑菌作用優(yōu)于百里香酚和香蘭素，且植物精油與有機(jī)酸復(fù)合后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均具有明顯抑菌作用；韓乾杰等（2017）研究了丁酸鈉沒有抑菌作用，但是與植物精油復(fù)合后能顯著降低植物精油的使用量。

本試驗通過抑菌試驗，比較了5 種植物精油（肉桂醛、百里香酚、香芹酚、丁香酚、桉葉素）的抑菌效果，其中抑菌效果最好的是肉桂醛、百里香酚和香芹酚，其次是丁香酚。

利用肉桂醛、百里香酚和香芹酚復(fù)配的產(chǎn)品對飼料中微生物的抑制效果優(yōu)于市售精油產(chǎn)品。

參考文獻(xiàn)：（略）