轉(zhuǎn)基因聚球藻7942的vp19基因表達(dá)效率及其光合生理特性研究

朱 嬋,施定基,何培民,賈 睿?

(1上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,上海201306;2中國(guó)科學(xué)院植物研究所,北京100093)

微藻作為水產(chǎn)動(dòng)物的開(kāi)口餌料,可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物幼體生長(zhǎng),提高其存活率[1],增強(qiáng)其抗逆性[2],而且可以改善水質(zhì)[3],抑制有害菌的生長(zhǎng)[4]。同時(shí),由于微藻結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速,因而一些微藻成為了水產(chǎn)動(dòng)物口服疫苗的表達(dá)載體[5]。為建立口服疫苗產(chǎn)業(yè),微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)是需要考慮的首要問(wèn)題[6]。張春莉等[7]首次將白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白基因vp28在魚(yú)腥藻7120(Anabaenasp.PCC 7120)中表達(dá),并通過(guò)口服用藥的方式提高了對(duì)蝦對(duì)WSSV的免疫力[8],但vp28基因在其中的表達(dá)效率很低,遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。鄧元告等[9]把vp28基因轉(zhuǎn)入聚球藻7942(Synechococcussp.PCC 7942)中,并表達(dá)成功;莊旻敏等[10]研究表明,vp28基因在聚球藻7942中的表達(dá)率是在魚(yú)腥藻7120中的3倍。

VP19蛋白是白斑綜合征病毒中含量?jī)H次于VP28蛋白的囊膜蛋白[11],如果能有效提高目的基因的表達(dá)率,則可進(jìn)一步降低轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的培養(yǎng)成本,從而真正實(shí)現(xiàn)口服劑的產(chǎn)業(yè)化[12]。現(xiàn)有研究表明,目的基因的表達(dá)率可能與生長(zhǎng)時(shí)間有關(guān)[10,12];在微藻的培養(yǎng)研究中,需要確定轉(zhuǎn)基因微藻的生長(zhǎng)活力,溫度、光照強(qiáng)度、pH和鹽度是影響微藻生長(zhǎng)和生化組成的重要環(huán)境因素[13-15]。

本研究采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因聚球藻7942在不同生長(zhǎng)階段vp19基因的相對(duì)表達(dá)量,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)氧電極分析轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942的光合速率隨溫度、光照強(qiáng)度和收集天數(shù)的變化特征,探究其最適生長(zhǎng)條件,以期為后續(xù)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻口服疫苗的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

聚球藻7942(Synechococcussp.PCC7942)由中國(guó)科學(xué)院植物研究所惠贈(zèng),轉(zhuǎn)vp19基因聚球藻7942由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。使用含有卡那霉素的BG-11(+N)培養(yǎng)基[16],在35℃、光照強(qiáng)度2 000—2 500 lx下,135 r∕min振蕩培養(yǎng)聚球藻。

1.2 主要儀器和試劑

FTC-3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Canada Funglyn Biotech Inc.公司),氧電極(Hansatech,UK)?？俁NA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。KAPA通用型SYBR快速定量試劑盒購(gòu)自上海捷易生物科技有限公司。TAE電泳緩沖液、硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。一抗(兔多抗)由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司設(shè)計(jì)合成,二抗(山羊抗兔)購(gòu)自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司,HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Western Blot法檢測(cè)VP19蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)vp19基因聚球藻7942,置于-20℃冰箱冷凍12 h,4℃解凍后再放進(jìn)-20℃冰箱冷凍,反復(fù)凍融3次后,于8 000 r∕min離心取上清,即為藻蛋白樣品。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度后上樣,60 V下進(jìn)行濃縮膠電泳30 min,120 V下進(jìn)行分離膠電泳2 h[17],5%脫脂奶粉封閉后在100 V條件下轉(zhuǎn)膜2 h,一抗二抗孵育,然后顯影。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因聚球藻目的基因相對(duì)含量計(jì)算

根據(jù)GenBank上登記的對(duì)蝦白斑綜合征病毒核酸序列(AJ937860.1),以WSSV病毒DNA為模板擴(kuò)增vp19基因(引物見(jiàn)表1),電泳分離、鑒定后對(duì)產(chǎn)物測(cè)序。以WSSV的DNA作為模板克隆出vp19基因,回收純化后連接到pGEM-T質(zhì)粒載體上轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中,在含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)液中篩選。擴(kuò)培篩選成功的大腸桿菌,提取質(zhì)粒,將濃度稀釋10倍后,計(jì)算雙鏈DNA濃度和拷貝數(shù)[8]。

表1 擴(kuò)增vp19基因的引物序列Table 1 Primer sequence for amplification of vp19 gene

取不同參數(shù)組合的轉(zhuǎn)基因型聚球藻樣品,提取樣品總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。將Ct值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算log拷貝數(shù)的值,計(jì)算樣品拷貝數(shù)和樣品DNA濃度,并以聚球藻干重為底計(jì)算百分比含量[8]。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因藻光合放氧活性計(jì)算

光合速率使用氧電極測(cè)定,溫度由恒溫水浴箱通過(guò)循環(huán)水控制。取對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞,把上樣樣品葉綠素質(zhì)量濃度調(diào)至10μg∕mL,用氧電極測(cè)定轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942在不同光照、溫度、收集天數(shù)下的光合放氧活性[18]。其計(jì)算公式:

其中,V:放氧活性,μmol O2∕(mg Chl·h);S:斜率,min-1;K:常數(shù),表示一定溫度下水中的溶氧量mol O2∕mL;P:葉綠素質(zhì)量濃度,mg∕mL。

取藻樣于4 000 r∕min離心10 min,去上清液;加入90%(體積分?jǐn)?shù))甲醇充分混勻,在室溫下萃取2 h,置于4℃下8 h,4 000 r∕min離心10 min取上清,測(cè)定OD665吸光值。計(jì)算樣品的葉綠素含量[19]:Chl(μg∕mL)=13.9×OD665。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制采用Excel 2017軟件和SPSS 24.0軟件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3),所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布數(shù)據(jù)(S-W檢驗(yàn))。利用SPSS 24.0軟件,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組和處理組之間均值比較,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因聚球藻7942中VP19蛋白的表達(dá)

使用Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942中VP19蛋白的表達(dá),從處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型和轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942中提取藻蛋白,測(cè)量蛋白濃度后保證每個(gè)泳道都有10μg的上樣量。如圖1所示,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942中有VP19蛋白表達(dá),野生型聚球藻7942中沒(méi)有VP19蛋白表達(dá)。

圖1 野生型和轉(zhuǎn)v p19基因型聚球藻7942中VP19的蛋白印跡Fig.1 Western Blot of VP19 protein in wild type and transgenic Synechococcus sp.PCC7942

2.2 轉(zhuǎn)基因聚球藻中vp19基因的表達(dá)效率

2.2.1vp19基因片段擴(kuò)增

以WSSV病毒DNA為模板,使用引物P1(表1)擴(kuò)增vp19基因,用2%瓊脂糖電泳檢測(cè),對(duì)產(chǎn)物切膠純化回收。由圖2可知,擴(kuò)增出383 bp的DNA特異性條帶,與目的片段長(zhǎng)度吻合。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2.2vp19基因片段標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將純化回收后的vp19基因片段10倍梯度逐級(jí)稀釋后,使用引物P2(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)品的初始拷貝數(shù)為4.5×1010copies∕μL。

圖3 純化回收的vp19基因片段標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of purified vp19 gene fragment

2.2.3 轉(zhuǎn)基因型聚球藻7942中vp19基因的表達(dá)效率

取接種3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d的轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942,分析其不同生長(zhǎng)時(shí)期vp19基因的表達(dá)效率,得到不同生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻的Ct值、相對(duì)表達(dá)效率及蛋白產(chǎn)率(表2)。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)基因型聚球藻7942中vp19基因的Ct值、相對(duì)表達(dá)效率及蛋白產(chǎn)率Table 2 Ct value,relative expression rate and protein yield of vp19 gene in transgenic Synechococcus sp.PCC 7942 at different growth stages

由圖4可知,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期(約12 d)的轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942表達(dá)率最高,可達(dá)到9.2%,VP19蛋白產(chǎn)率達(dá)到7.31 mg∕L。

圖4 不同生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)基因型聚球藻中vp19基因的相對(duì)表達(dá)率Fig.4 Relative expression rate of vp19 in transgenic Synechococcus sp.PCC 7942 at different growth stage

由上述結(jié)果可知,轉(zhuǎn)基因聚球藻7942中vp19基因表達(dá)量相對(duì)較高,開(kāi)發(fā)該藻作為口服疫苗可以降低生產(chǎn)成本,因此對(duì)其最適生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究。

2.3 轉(zhuǎn)基因聚球藻7942的生長(zhǎng)和光合曲線

2.3.1 聚球藻7942生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)率

如圖5所示,野生型聚球藻7942的生長(zhǎng)從第4天開(kāi)始迅速增加,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942的生長(zhǎng)則是從第3天開(kāi)始逐漸增加,說(shuō)明轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻比野生型聚球藻有更好的適應(yīng)能力,能在接種后迅速繁殖。轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻的細(xì)胞密度比野生型聚球藻大,可以看出轉(zhuǎn)入基因后對(duì)聚球藻的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,在第7天生長(zhǎng)率最大提高了16.9%。在第20天,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻的生物量達(dá)到5.42 g∕L,野生型聚球藻7942的生物量達(dá)到5.07 g∕L,轉(zhuǎn)基因型相對(duì)于野生型提高了6.9%。

圖5 野生型和轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of wild type and transgenic vp19Synechococcus sp.PCC 7942

在一定程度上,藻的OD750值可以反應(yīng)出最終收集到干藻的質(zhì)量,兩者之間呈線性關(guān)系(圖6),因此可以根據(jù)OD750值計(jì)算出干藻質(zhì)量,再根據(jù)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)率,進(jìn)而確定VP19蛋白的質(zhì)量。

圖6 轉(zhuǎn)基因聚球藻7942的OD750和干藻質(zhì)量的關(guān)系Fig.6 Relationship between dry weight and OD750 of transgenic Synechococcus sp.PCC 7942

2.3.2 溫度、光強(qiáng)、pH、鹽度對(duì)轉(zhuǎn)vp19基因聚球藻7942光合作用的影響

從圖7a可知,野生型聚球藻和轉(zhuǎn)基因聚球藻對(duì)溫度的響應(yīng)一致。放氧活性均在38℃達(dá)到最高,野生型聚球藻和轉(zhuǎn)基因聚球藻的凈光合速率分別為59.2μmol∕(m2·s)和65.1μmol∕(m2·s)。之后的下降趨勢(shì)表明,40℃以上高溫對(duì)聚球藻的生長(zhǎng)有抑制作用。通過(guò)圖7a的縱向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因藻在高溫時(shí)凈光合速率下降快于野生型藻。

如圖7b所示,野生型聚球藻在光照強(qiáng)度為1 500 lx時(shí)到達(dá)光飽和點(diǎn),此時(shí)的凈光合速率為50.1μmol∕(m2·s),野生型聚球藻在光照強(qiáng)度為2 250 lx時(shí)到達(dá)光飽和點(diǎn),此時(shí)的凈光合速率為62.4μmol∕(m2·s)。光強(qiáng)達(dá)到3 000 lx后,野生型聚球藻和轉(zhuǎn)基因型聚球藻均出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象。相對(duì)于野生型聚球藻,轉(zhuǎn)基因型聚球藻的光飽和點(diǎn)有所提高,凈光合速率也提高了19.7%。

圖7 環(huán)境因子對(duì)野生型與轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942光合作用的影響Fig.7 Effects of environment factors on photosynthesis of wild type and transgenic vp19 Synechococcus sp.PCC 7942

野生型聚球藻和轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻對(duì)pH的響應(yīng)趨勢(shì)較為一致。由圖7c可知,野生型聚球藻的最適pH為7.5,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻的最適pH為8.0。

由圖7d可知,兩者最適的鹽度均為0 mol∕L NaCl,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻比野生型聚球藻對(duì)鹽度的抗性高。在到達(dá)0.1 mol∕L NaCl之前,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻光合速率的下降趨勢(shì)相對(duì)野生型聚球藻較緩。

3 結(jié)論與討論

本研究表明,采收天數(shù)是決定目的基因表達(dá)的關(guān)鍵因素,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942表達(dá)率最高,達(dá)9.2%,VP19蛋白產(chǎn)率達(dá)7.31 mg∕L。這與目前的研究結(jié)果相同[8,10],可能是細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段的主要功能不同,光合作用產(chǎn)物在前期主要用于合成結(jié)構(gòu)物質(zhì),到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,細(xì)胞內(nèi)基因傾向于分泌特異性的RNA和蛋白,進(jìn)入分化狀態(tài);到穩(wěn)定期后,細(xì)胞功能老化,吸收的養(yǎng)分有限,基因表達(dá)量下降。朱嘉誠(chéng)[20]也認(rèn)為藍(lán)藻細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段的主要功能不同,到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后轉(zhuǎn)為合成分泌目的蛋白。

在轉(zhuǎn)vp19基因聚球藻7942的培養(yǎng)過(guò)程中,藻細(xì)胞的活力是決定微藻接種后能否正常生長(zhǎng)的重要因素之一[21]。一定程度上,放氧活性可以體現(xiàn)藍(lán)藻細(xì)胞新陳代謝的活性,溫度、光強(qiáng)、pH、鹽度是影響放氧活性的重要環(huán)境因素。通過(guò)氧電極法對(duì)聚球藻的生理活性進(jìn)行分析,確定了轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻的最適生長(zhǎng)條件為:溫度38℃,光照強(qiáng)度2 500 lx,pH 8.0,鹽度0 mol∕L NaCl。相對(duì)于野生型聚球藻7942,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻7942的光強(qiáng)和pH有所提高,可以通過(guò)控制這兩個(gè)條件篩選轉(zhuǎn)基因藻。

本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)vp19基因在聚球藻7942不同生長(zhǎng)階段的表達(dá),確定了轉(zhuǎn)基因藻的最佳采收時(shí)間,避免盲目收集,節(jié)約了培養(yǎng)成本,還可為對(duì)蝦攻毒實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因藻用藥劑量提供依據(jù)。藍(lán)藻作為對(duì)蝦的天然餌料,轉(zhuǎn)vp19基因型聚球藻既可以作為餌料又可以作為免疫口服劑,表達(dá)率高、傳代效率好、成本低的口服疫苗有更加廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。