青稞品種‘喜馬拉22號’小孢子培養(yǎng)植株再生體系的建立

郭桂梅,宗營杰?,何 婷,張述偉,杜志釗,陸瑞菊,王亦菲??,劉成洪

(上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所∕上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海201106;上海市農(nóng)業(yè)科技服務中心,上海200335)

青稞是我國西藏地區(qū)居民的主要食糧,同時還是優(yōu)良的飼料和釀酒原料,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位[1]。青稞優(yōu)良品種的選育關系到我國邊疆地區(qū)的糧食安全,具有較為重要的社會經(jīng)濟效益[2-3]。青稞作為一種可食用的裸大麥,具有“三高兩低”(蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素含量高;脂肪、糖含量低)的特點,同時還富含β-葡聚糖和黃酮類功能性成分,具有很好的營養(yǎng)保健價值[4-6],正由區(qū)域糧食作物轉(zhuǎn)向全球健康食源作物[7]?！柴R拉22號’由西藏自治區(qū)日喀則市農(nóng)業(yè)科學研究所選育[8],具有高產(chǎn)、耐逆抗倒、耐旱耐濕等特點,是春青稞良種中產(chǎn)量較高的品種,也是近年來青稞育種中的重要親本來源之一。

青稞生產(chǎn)中存在品種更換周期長、老品種混雜退化嚴重、優(yōu)異種質(zhì)資源匱乏等問題[3,9-10],應用小孢子培養(yǎng)技術可以快速純合、穩(wěn)定優(yōu)良基因,加快青稞育種進程[11-13]。目前青稞的花藥培養(yǎng)和小孢子離體培養(yǎng)已在一些青稞材料上獲得成功[14-17],但小孢子培養(yǎng)存在基因型依賴性,不同青稞材料的培養(yǎng)反應特性差異較大,‘喜馬拉22號’作為西藏自治區(qū)主栽青稞品種,還未見小孢子培養(yǎng)研究成功的報道。本研究對‘喜馬拉22號’游離小孢子培養(yǎng)中的多個環(huán)節(jié)進行研究,包括供體植株的種植與春化處理、愈傷組織的誘導及分化、再生植株倍性的鑒定及移栽等,以期建立其小孢子培養(yǎng)再生植株體系,為以后青稞的遺傳改良提供單倍體快速育種技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

‘喜馬拉22號’種子由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)科學研究所曾興權(quán)博士提供。2018年11月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學院南門大田中,2019年春季參照郭桂梅等[18]方法進行取材、修剪及低溫處理。

1.2 春化處理

試驗種子于28℃浸泡6 h后催芽過夜,穴盤種植,3 d后,將幼苗移入5℃冰箱,弱光照(通過冰箱玻璃透明門提供的自然光),處理37 d后,移栽大田。田間直播材料作為對照組。

1.3 小孢子培養(yǎng)方法

選取5℃低溫處理2—3周的青稞穗,剝?nèi)ト~鞘,參考郭桂梅等[18-19]方法進行消毒、收集游離小孢子。19 d后稱取愈傷組織質(zhì)量并將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,25℃、12 h光照培養(yǎng),進行綠苗統(tǒng)計及壯苗生根培養(yǎng)。

選擇根系發(fā)達的再生植株,移出壯苗生根培養(yǎng)基,去除黃葉后在Hoagland營養(yǎng)液中進行水培煉苗,獲得生長健壯植株。同時對水培苗進行染色體倍性鑒定與加倍處理(單倍體植株幼苗剪根,用0.2%秋水仙堿+2%二甲基亞砜浸泡,20℃暗處理12 h),提高其二倍化率。煉苗3—4周后加倍單倍體(Double haploid,DH)植株送往云南昆明基地加代種植,收獲DH株系種子。

1.4 提取液和培養(yǎng)基的配制

誘導培養(yǎng)基以N6為基本培養(yǎng)基,添加0.5 mg∕L KT、0.4 g∕L水解干酪素、1.6 g∕L谷氨酰胺及0.976 g∕L MES,pH 5.8,用0.22μm膜過濾滅菌。麥芽糖設置60 g∕L、75 g∕L、90 g∕L、105 g∕L和120 g∕L 5種濃度,2,4-D設置0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L和2.0 mg∕L 4種濃度。

提取液、分化培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基成份及滅菌方法均參照郭桂梅等[20]方法。

1.5 生長統(tǒng)計指標

愈傷組織產(chǎn)量:每皿小孢子培養(yǎng)19 d時產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量,用“mg”表示;綠苗產(chǎn)量:每皿愈傷組織分化出的綠苗數(shù),用“株”表示;綠苗再生能力:每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數(shù),用“株”表示。

1.6 倍性鑒定

選用第3片葉的中部,長度3—4 cm,放入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1,V∕V)中,浸泡至葉片完全褪色,在蒸餾水中漂洗后置于400倍顯微鏡下測量葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細胞長度,每葉片隨機統(tǒng)計10個細胞,取平均值。

每棵苗剪取3條根尖,長度1—2 cm,放入預冷的90%冰醋酸中,放置10 min后取出,用吸水紙吸干,放入70%乙醇中,-20℃保存放置。45%冰醋酸中解離制片,每個片子至少觀察5個分裂相。

1.7 田間調(diào)查

考察大田種植的‘喜馬拉22號’株高、分蘗、穗長、穗粒數(shù)、癟粒數(shù)、單株產(chǎn)量及千粒重等農(nóng)藝性狀,千粒重測定重復3次,其余均重復5次。穗密度=穗粒數(shù)∕穗長;結(jié)實率=(穗粒數(shù)-癟粒數(shù))∕穗粒數(shù)×100%。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、DPSv7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 春化處理對小孢子愈傷組織誘導的影響

春化處理組單皿小孢子培養(yǎng)誘導愈傷組織的產(chǎn)量均高于對照組。對照組單皿愈傷組織產(chǎn)量均值為33.27 mg,春化處理后其愈傷組織產(chǎn)量提高了1倍,達到66.57 mg,兩個處理間存在極顯著差異。

2.2 誘導培養(yǎng)基中麥芽糖濃度對小孢子培養(yǎng)愈傷組織誘導的影響

由圖1可知,麥芽糖質(zhì)量濃度在90 g∕L和105 g∕L時小孢子愈傷組織產(chǎn)量顯著提高,其中麥芽糖質(zhì)量濃度為90 g∕L時,愈傷組織產(chǎn)量最高(57.12 mg)。

圖1 誘導培養(yǎng)基中麥芽糖濃度對愈傷組織誘導的影響Fig.1 Effects of maltose concentration in induction medium on the yields of callus

2.3 誘導培養(yǎng)基中2,4-D濃度對小孢子培養(yǎng)愈傷組織誘導的影響

由圖2可知,2,4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg∕L時,愈傷組織產(chǎn)量誘導最高,達56.50 mg,與其他濃度處理存在顯著差異。

圖2 誘導培養(yǎng)基中2,4-D濃度對愈傷組織誘導的影響Fig.2 Effects of 2,4-D concentration in induction medium on the yields of callus

2.4 小孢子植株的再生、生根與移栽

在優(yōu)化后的愈傷誘導條件下,成功獲得青稞‘喜馬拉22號’游離小孢子胚性愈傷組織和分化綠苗,平均每皿可以誘導出92.3 mg愈傷組織,平均每皿愈傷組織能分化出56.5株綠苗,平均每100 mg愈傷組織能分化出60.9株綠苗。當分化苗長至1.5—2.0 cm高時,及時轉(zhuǎn)移至生根壯苗培養(yǎng)基上,4周后將再生植株經(jīng)過水培煉苗后移栽至盆缽(圖3)。

圖3 小孢子培養(yǎng)愈傷組織誘導及植株再生Fig.3 Callus induction and plants regeneration of isolated microspore culture

2.5 小孢子再生植株的倍性鑒定

對56株小孢子來源的‘喜馬拉22號’再生植株進行染色體倍性鏡檢,單倍體為7條染色體(n=7),二倍體為14條染色體(2n=14),四倍體為28條染色體(2n=28)(圖4)。56株再生植株中3株為單倍體植株,占5.4%;32株為二倍體植株,占57.1%;21株為四倍體植株,占37.5%。

圖4 不同倍性的小孢子再生植株的染色體鏡檢(400×)Fig.4 Chromosomal microscopy of microspore regeneration plants with different ploidy

測量‘喜馬拉22號’小孢子培養(yǎng)獲得的56株再生植株和20株種子苗葉片保衛(wèi)細胞長度,發(fā)現(xiàn)單倍體葉片保衛(wèi)細胞長度為36.71—39.93μm,二倍體葉片保衛(wèi)細胞長度為42.29—60.38μm,四倍體葉片保衛(wèi)細胞長度為59.98—93.49μm(圖5)。其均值長度呈正態(tài)分布,單倍體葉片保衛(wèi)細胞長度平均值為38.83μm,二倍體平均值為51.94μm,四倍體平均值為71.18μm,種子苗平均值為57.13μm(圖6)。

圖5 小孢子再生植株的單倍體、二倍體、四倍體的保衛(wèi)細胞Fig.5 The guard cells of monoploid,diploid,and tetraploid from the microspore regeneration plants

2.6 大田適應性

試驗表明,青稞‘喜馬拉22號’在上海地區(qū)種植能正常完成整個生育期,且其籽粒結(jié)實率在97%以上;春化處理與對照組在株高、穗密度和單株產(chǎn)量上均存在顯著性差異(表1)。

表1 上海地區(qū)種植的‘喜馬拉22號’的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic character of field grown locally in Shanghai of‘Himala 22

3 討論與結(jié)論

春青稞‘喜馬拉22號’適宜在西藏自治區(qū)海拔4 300 m以下中高肥水農(nóng)田種植,在上海地區(qū)也能正常完成生育期,但在兩地種植植株的一些基本農(nóng)藝性狀有一定差異[8]。如在西藏地區(qū)種植時,‘喜馬拉22號’全生育期134 d,株高94.7 cm,穗長6.02 cm,平均穗粒數(shù)53.6粒,平均千粒重42.9 g;而在上海地區(qū)種植時,春化處理和對照組其全生育期分別為217 d和194 d,株高分別為121.6 cm和105.5 cm,穗長分別為6.9 cm和8.0 cm,平均穗粒數(shù)分別為82.8粒和81.6粒,平均千粒重分別為49.1 g和48.2 g。其差異可能是因種植方式和生產(chǎn)條件的不同所致。

本研究發(fā)現(xiàn),春化處理更利于春青稞‘喜馬拉22號’游離小孢子愈傷組織的形成,其原因可能是低溫條件可促進花芽的形成和花器官的發(fā)育[21-22],誘導體內(nèi)核酸蛋白質(zhì)代謝發(fā)生變化,改變體內(nèi)激素水平、酶活性及DNA甲基化等[23-24]。小孢子供體植株低溫預處理對象主要是幼穗,目前,關于在幼苗期進行低溫預處理的報道較少,劉成洪等[17]認為,幼苗10℃低溫處理1個月可以提高愈傷和綠苗產(chǎn)量。麥芽糖在誘導培養(yǎng)基中不僅可作為碳源,還可以調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的滲透壓,對小孢子的孢子體啟動起著重要作用;激素2,4-D有利于小孢子的脫分化啟動,因此,麥芽糖和2,4-D的濃度是否合適對小孢子培養(yǎng)成功與否十分關鍵[16]。本研究發(fā)現(xiàn),誘導培養(yǎng)基中麥芽糖質(zhì)量濃度為90 g∕L時和2,4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg∕L時可顯著增加愈傷組織產(chǎn)量。

花藥∕小孢子再生植株的倍性可以通過葉片保衛(wèi)細胞長度來確定[25-28],而根尖染色體制片計數(shù)是經(jīng)典的植株倍性鑒定方法。本研究表明:‘喜馬拉22號’單倍體和二倍體(加倍單倍體)的界限值為40μm,比大麥上的界限值37μm略大[27],這可能和研究群體的大小和葉齡有關?！柴R拉22號’小孢子再生植株的倍性鑒定結(jié)果表明,相比大麥小孢子再生植株,其單倍體比例較低,四倍體比例較高,這與青稞材料小孢子培養(yǎng)中自發(fā)加倍的頻率有關。而青稞小孢子再生植株葉片保衛(wèi)細胞長度的分布、自發(fā)加倍頻率與前期大麥的研究結(jié)果之間存在差異的原因還有待于進一步研究。