瓜類果斑病菌熒光免疫層析試紙條的研制

曾海娟,翟緒昭,孫靜娟,王金斌,劉 箐?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海201106;2上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海200093)

瓜類細(xì)菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是一種由革蘭氏染色呈陰性的燕麥?zhǔn)乘峋鞴戏N(Acidovorax citrulli,Ac)引起的具有毀滅性的細(xì)菌性病害。瓜類果斑病菌是典型的種傳病菌,可通過帶菌種子實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播,因此,帶菌種子是果斑病爆發(fā)的重要來源[1]。果斑病菌抗干旱能力非常強(qiáng),可在干燥的種子表面存活35年[2],并且可侵染西瓜、甜瓜、南瓜等多種葫蘆科植物的果實(shí)、植株及種子,使帶菌果實(shí)表面出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn),最終導(dǎo)致整個果實(shí)腐爛,嚴(yán)重影響瓜類產(chǎn)量,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,尚未培育出可以完全抵抗該病菌的商業(yè)化瓜類品種[3]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是用于病原菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法,如常規(guī)PCR、多重PCR[4]、實(shí)時熒光定量PCR[5]、鎖式探針擴(kuò)增[6]及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增[7]等?；赑CR的檢測方法靈敏度較高,與傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的檢測方法相比,檢測時間較短,只需3—4 h即可獲得可靠的結(jié)果。但該方法需要精密的熱循環(huán)儀,對操作人員也有一定的技術(shù)要求。免疫層析試紙技術(shù)是基于免疫學(xué)建立的檢測方法,其操作簡單,檢測時間短,結(jié)果易辨認(rèn),樣品不需要前處理,且不需要復(fù)雜的設(shè)備。試紙條中最常見的標(biāo)記材料是應(yīng)用膠體金作為示蹤物,標(biāo)記抗體后使得檢測結(jié)果肉眼可見。目前,已廣泛用于大腸桿菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌等食源性致病菌的快速檢測[8-10],黃瓜角斑菌、玉米條斑病菌等植物病原菌的田間快速檢測[11-12],玉米赤霉烯酮、黃曲霉素等真菌毒素的檢測[13-14]。近年來,一些新型的標(biāo)記材料獲得越來越多的關(guān)注,其中包括上轉(zhuǎn)化發(fā)光納米粒子[15]、稀土納米材料[16]、量子點(diǎn)[17]、熒光微球[18]等。

異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)是一種熒光染料,可以吸收藍(lán)光或紫外光并發(fā)出黃綠色熒光。作為一種熒光探針,FITC被廣泛用于活細(xì)胞染色以及細(xì)菌染色后的示蹤[19-20]等。本研究在前期制備得到高特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上,采用FITC標(biāo)記抗體,利用“雙抗體夾心”模式制備新型的熒光免疫層析試紙條,并對試紙條的性能(特異性、靈敏度、穩(wěn)定性)及對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行分析,旨在建立一種新型的簡便、快速、成本低的檢測果斑病菌的免疫學(xué)新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

果斑病菌SD01的單克隆抗體6D及4F由本試驗(yàn)室制備并保存;用于測定試紙條特異性的菌株見表1,其中7種野生型果斑菌株(編號1—7)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院從國內(nèi)外瓜類產(chǎn)品中分離所得,已進(jìn)行了分離鑒定及柯赫氏法則驗(yàn)證;其余菌株(編號8—14)均為標(biāo)準(zhǔn)菌株。硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊(20 cm×30 cm)、結(jié)合墊(20 cm×30 cm)、吸水紙(20 cm×30 cm)購自美國Millipore公司。

表1 試驗(yàn)所用菌株Table 1 Bacterial strains used in the test

1.2 試劑

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;羊抗鼠IgG抗體和FITC(≥90%)購自美國Sigma公司;其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司;點(diǎn)樣儀購自美國BioDot公司。

1.4 細(xì)菌抗原制備

使用腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)進(jìn)行果斑病菌培養(yǎng)[21]。將冷凍保存的果斑病菌及其近源菌株劃線接種于BHI平板,37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于液體BHI培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)12 h后,菌液采取0.3%甲醛滅活用作檢測抗原。純培養(yǎng)的各種菌株在甲醛滅活前均用無菌生理鹽水梯度稀釋并涂布于BHI平板進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.5 果斑病菌單抗的熒光標(biāo)記

將待交聯(lián)的單克隆抗體4F在交聯(lián)反應(yīng)液中透析過夜,交聯(lián)反應(yīng)液的配方為:7.56 g NaHCO3,1.06 g Na2CO3,7.36 g NaCl,加水定容到1 L。按單抗4F∶FITC=1 mg∶150μg的比例將新鮮配制的FITC緩慢加入抗體溶液中,邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻,置于室溫反應(yīng)2 h。將交聯(lián)物在PBS中透析,至透析液清亮。FITC交聯(lián)的抗體置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中4℃避光保存。交聯(lián)效果判定方法為FITC∶抗體=2.77×OD495∕[OD280-0.35×OD495],該值應(yīng)為5—10[22]。

1.6 檢測線濃度及熒光抗體使用量的優(yōu)化

為確定最適的檢測線濃度,將不同質(zhì)量濃度的單克隆抗體6D(2.5 mg∕mL、2 mg∕mL、1.5 mg∕mL)與1 mg∕mL羊抗鼠IgG抗體噴涂于NC膜上分別形成檢測線與質(zhì)控線,再將NC膜(2.5 cm×30 cm)、結(jié)合墊(0.5 cm×30 cm)、樣品墊(2.5 cm×30 cm)、吸水紙(3 cm×30 cm)依次貼在PVC底板(8 cm×30 cm)上,并互相重疊1—2 mm,如圖1A所示,切成3 mm左右的條帶?？瞻譈HI培養(yǎng)基75μL逐滴滴加至樣品墊,作為陰性對照。判定最適的檢測線(T線)濃度:只出現(xiàn)一條質(zhì)控線(C線)的抗體6D最高濃度。

圖1 試紙條的模擬結(jié)構(gòu)(A)及陽性結(jié)果(B)和陰性結(jié)果(C)Fig.1 The simulated structure(A),positive result(B)and negative result(C)of the test strip

優(yōu)化后的單克隆抗體6D與1 mg∕mL羊抗鼠二抗噴涂于NC膜上,并進(jìn)行試紙組裝。將不同質(zhì)量(2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg)的熒光抗體4F噴涂于試紙條的結(jié)合墊,空白培養(yǎng)基滴加至樣品墊作為陰性對照,最適熒光抗體(FITC-4F)的質(zhì)量為僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線(C線)時的最高熒光抗體量。

檢測原理為:當(dāng)樣品中含有待檢靶標(biāo)時,樣品中的抗原首先與結(jié)合墊上的熒光抗體結(jié)合,形成熒光抗體4F-抗原復(fù)合物,當(dāng)復(fù)合物流經(jīng)NC膜上的檢測線時,與檢測線上的6D結(jié)合,形成熒光抗體4F-抗原-抗體6D“雙抗體夾心”模式,由于FITC在T線和C線上的堆積,在檢測線及質(zhì)控線區(qū)域產(chǎn)生肉眼可見的黃綠色熒光(圖1B);當(dāng)樣品中無待測靶標(biāo)時,FITC不會在T線上堆積,僅可見一條C線(圖1C)。

1.7 試紙條特異性測定

采用無菌生理鹽水將8種果斑病菌(SD01、ATCC 29625、99-5、xj112、PLSB1、00-1、plsb91、tw31),及6種同屬近源的植物病原菌(ATCC33996、NCPPB961、ATCC19307、NCPPB2597、NCPPB540、ATCC2975)的菌懸液稀釋至108CFU∕mL,并滴加75μL至相應(yīng)試紙條的樣品墊。靜置10 min后在紫外燈下觀察結(jié)果,用裝有熒光濾光片(525 nm,Semrock,USA)的相機(jī)拍照記錄檢測結(jié)果。當(dāng)試紙條出現(xiàn)兩條線時,判定為陽性;若試紙條只有一條C線,則判定為陰性;若無線或者只有一條T線則判定為無效結(jié)果。若8種果斑病菌均能檢出,而6種近源的植物病原菌不能檢出,則表明該試紙條在檢測果斑菌時具有較高的特異性。

1.8 試紙條靈敏度和穩(wěn)定性測定

用無菌生理鹽水將果斑病菌SD01懸液按10倍梯度稀釋為3.1×105—3.1×108CFU∕mL,以空白BHI培養(yǎng)基作為陰性對照,每個樣品在試紙條的樣品墊逐滴滴加75μL,10 min后觀察結(jié)果。可以觀察到出現(xiàn)兩條線的最小細(xì)菌懸液濃度,即為該試紙條的檢出限。

將制備好的試紙條室溫放置3月后,通過測定試紙條的靈敏度來評估試紙條的穩(wěn)定性。試驗(yàn)方法同上,若檢出限未發(fā)生變化,則表明試紙條在室溫存放3個月后仍具有穩(wěn)定檢出果斑病菌的能力。

1.9 實(shí)際樣品的檢測

將經(jīng)PCR驗(yàn)證無果斑病菌污染的葫蘆科植物西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黃瓜、冬瓜、絲瓜、西葫蘆的莖葉搗碎,收集汁液5 mL分別添加到45 mL BHI中,并接種果斑病菌SD01單菌落,37℃過夜培養(yǎng)后,菌濃度調(diào)至3.1×106CFU∕mL,每個樣品在試紙條的樣品墊上逐滴滴加75μL,10 min后在紫外燈下觀察結(jié)果。若上述樣品均可以檢出,則說明試紙條在檢測樣品時,最小檢出濃度不受瓜類莖葉中未知雜質(zhì)的影響,該試紙條適用于實(shí)際樣品的現(xiàn)場快速檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌計數(shù)結(jié)果

使用BHI液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h,14種細(xì)菌濃度均在2×109—4×109CFU∕mL,其中用于測定靈敏度的野生型菌株SD01平板計數(shù)結(jié)果為3.1×109CFU∕mL。

2.2 單抗的熒光標(biāo)記效果測定

采用酶標(biāo)儀測定單抗4F與FITC的交聯(lián)比例,計算得到2.77×OD495∕[OD280-0.35×OD495]值為9.45,nanodrop測定標(biāo)記后單抗質(zhì)量濃度并調(diào)整為2 mg∕mL。由圖2可見,在280 nm處有蛋白的最大吸收峰,在495 nm處有FITC的最大吸收峰,表明FITC標(biāo)記抗體成功。

圖2 熒光抗體全波長掃描Fig.2 Full wavelength scanning of fluorescent antibody

2.3 檢測線濃度的確定

空白BHI培養(yǎng)基用來確定試紙條的最適檢測線濃度,選取檢測結(jié)果不出現(xiàn)假陽性的最高檢測線濃度為最適濃度。將75μL空白BHI培養(yǎng)基滴加至不同檢測線濃度的試紙條的樣品墊,當(dāng)檢測線質(zhì)量濃度為2.5 mg∕mL時,試紙條測定空白BHI培養(yǎng)基時出現(xiàn)假陽性結(jié)果,檢測線6D質(zhì)量濃度低于2 mg∕mL時,只有一條質(zhì)控線質(zhì)量,因此本試驗(yàn)選取最適檢測線質(zhì)量濃度為2 mg∕mL。

2.4 熒光抗體最適量的確定

空白BHI培養(yǎng)基用來確定熒光抗體的最適量,先在試紙條的結(jié)合墊上噴涂不同質(zhì)量的熒光抗體,再將空白培養(yǎng)基滴加至試紙條的樣品墊,如圖3所示,當(dāng)熒光抗體的量達(dá)到6μg時,試紙條檢測空白培養(yǎng)基出現(xiàn)假陽性結(jié)果,因而最適熒光抗體的噴涂量為5μg。

圖3 最適熒光抗體量的確定Fig.3 Determination of the optimal amount of fluorescent antibody

2.5 試紙條的特異性測定

由圖4所示,試紙條1—8檢測8種果斑菌,有兩條線,為陽性結(jié)果;9—14檢測與果斑病毒近源的植物病原菌,只有一條質(zhì)控線,為陰性結(jié)果;0為陰性對照,表明試紙條可以檢出該8株果斑病菌,并且與其他近源的植物病原菌無交叉反應(yīng),具有良好的特異性。

圖4 試紙條的特異性測定Fig.4 Determination of specificity of test strip

2.6 試紙條的靈敏度測定

試紙條對野生型菌株SD01的檢測靈敏度結(jié)果如圖5所示,菌液濃度在3.1×106—3.1×108CFU∕mL時可見兩條線,為陽性結(jié)果;濃度為3.1×105CFU∕mL時只有一條質(zhì)控線,為陰性結(jié)果,因而試紙條的檢測靈敏度為3.1×106CFU∕mL。

圖5 試紙條的靈敏度測定Fig.5 Sensitivity determination of test strip

2.7 試紙條的穩(wěn)定性

將研制的熒光試紙條室溫放置3個月后,檢測靈敏度仍能達(dá)到3.1×106CFU∕mL,表明試紙條最少可以在室溫存放3個月,仍具有檢測果斑病菌的能力。

2.8 試紙條檢測實(shí)際樣品

試紙條對含有3.1×106CFU∕mL果斑病菌SD01的8種葫蘆科植物的檢測結(jié)果如圖6所示,試紙條1—8均有兩條線,為陽性結(jié)果;試紙條0僅有一條質(zhì)控線,為陰性結(jié)果,表明汁液中的未知雜質(zhì)不會對試紙條的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,試紙條可用于田間實(shí)際樣品的快速檢測。

圖6 試紙條的實(shí)際樣品檢測Fig.6 Actual sample detection of test strip

3 討論

試紙條的特性與抗體的特性直接相關(guān),試驗(yàn)中所用單克隆抗體6D、4F為前期試驗(yàn)所得[21],6D效價為1∶6 400,可識別并結(jié)合8種果斑病菌,與6種近源植物病原菌無交叉反應(yīng);4F效價為1∶6 400,可識別并結(jié)合8種果斑菌,但與ATCC19307、ATCC33996有交叉反應(yīng)。試紙條的研制是建立在“雙抗體夾心”技術(shù)基礎(chǔ)上的,ATCC19307、ATCC33996雖然與單克隆抗體4F存在交叉反應(yīng),但與固定在檢測線區(qū)域的單克隆抗體6D不能結(jié)合,因而制備出的熒光試紙條與這兩株菌并無交叉反應(yīng)。

目前報道的果斑病菌的檢測方法主要有PCR法、酶聯(lián)免疫吸附測定法[23]、膠體金免疫層析試紙條[24]等。熒光免疫層析法是目前一種新型的免疫學(xué)檢測技術(shù),可用于病原菌的快速檢測。熒光免疫層析法的熒光標(biāo)記物質(zhì)常見的有熒光素、量子點(diǎn)及一些熒光乳膠微粒等,FITC作為一種熒光染料,價格低廉,可降低試紙條的成本。本試驗(yàn)以FITC為標(biāo)記物,利用熒光免疫層析試紙條選出可以配對的抗體,成功研制出果斑病菌的熒光免疫層析試紙條,并對熒光試紙條的檢測靈敏度、特異性、穩(wěn)定性及實(shí)際樣品檢測結(jié)果進(jìn)行了分析,結(jié)果表明試紙條的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性良好,可用于實(shí)際樣品的快速檢測,特別適用于無復(fù)雜儀器設(shè)備的田間、倉儲等場所的大批量樣品的快速篩查,具有方便、快速、操作簡單、檢測結(jié)果肉眼可見等優(yōu)勢。