肢體脂肪肉瘤組織中沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1的表達及其與預后的關系*

徐鳳周，吳宏增，劉永強，張進明，何紅艷

（1.石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊050000；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊050011）

軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma,STS）屬于惡性腫瘤，占成人實性惡性腫瘤的1%[1]。而脂肪肉瘤是最常見的STS 之一，亦可見于兒童和青少年。脂肪肉瘤主要起源于原始間充質(zhì)細胞，占惡性軟組織腫瘤的16%～18%[2]，好發(fā)于深部軟組織，通常見于肢體和腹膜后等位置，其中肢體脂肪肉瘤約占肢體STS 的24%。手術根治性切除是目前肢體脂肪肉瘤最有效的治療手段，但由于缺乏有效的術后輔助治療，肢體脂肪肉瘤的長期療效欠佳。不斷復發(fā)和多次手術不僅使患者身心承受著極大的痛苦，同時也給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[3]。因此加強對肢體脂肪肉瘤的臨床和基礎研究，積極尋找新的治療靶點具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關酶1（silencing information regulator 2-associated enzyme 1,SIRT1）是一種組蛋白去乙酰化酶，可通過對組蛋白去乙?；揎?，實現(xiàn)調(diào)控細胞生長、分化與新陳代謝等生物學功能[4-6]。既往研究表明[7-9]，SIRT1 在多數(shù)惡性腫瘤組織中均有異常表達，且與腫瘤惡性程度相關。SIRT1 既有癌基因作用，又有抑癌基因作用，對癌基因與抑癌基因平衡關系起著重要調(diào)控作用。目前隨著醫(yī)學界對SIRT1研究的不斷深入，SIRT1 可能作為治療惡性腫瘤的靶點逐漸受到臨床重視。本研究通過分析SIRT1 在肢體脂肪肉瘤組織中的表達及其對患者預后的影響，為肢體脂肪肉瘤的臨床診治及預后評估提供指導依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2019年1月于河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院擇期行手術治療的肢體脂肪肉瘤的患者資料，并隨訪預后。納入標準：①術前未接受新輔助放、化療；②經(jīng)手術病理檢查確診為原發(fā)性肢體脂肪肉瘤；③未合并其他惡性腫瘤或嚴重伴發(fā)疾病；④手術切緣均為陰性。排除標準：①臨床病歷資料不完整；②圍手術期死亡。最終67 例肢體脂肪肉瘤患者納入本研究。其中，男性37 例，女性30例；年齡38～80 歲，平均（54.6±9.4）歲；腫瘤最大徑線3～25 cm，平均最大徑線（12.7±6.1）cm；11 例有肺轉移。同時選取同期30 例正常肢體脂肪瘤組織作對照，納入者經(jīng)術后病理學檢查確診為肢體脂肪瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬術前自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

一抗鼠抗人SIRT1 單克隆抗體購自美國Abcam公司（1∶500），二抗兔抗鼠IgG 抗體購自北京碧云天生物公司（1∶1 000）?？贵w外試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學法檢測30 例正常肢體脂肪瘤組織、67 例肢體脂肪肉瘤組織及11 例肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白的表達，分析SIRT1蛋白表達與肢體脂肪肉瘤患者臨床病理特征的關系，以及SIRT1 蛋白表達對肢體脂肪肉瘤患者生存預后的影響。

1.3.1 鏈菌素親生物素-過氧化酶連接法（SP 法）①病理組織石蠟切片，68℃烘烤固片，20 min；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：0.3%過氧化氫（H2O2），37℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，每次5 min；④抗原修復：置于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 值為6.0）修復；⑤封閉：加1∶20 正常山羊血清，室溫下封閉10 min；⑥一抗：封閉后吸去正常羊血清，不洗，直接加一抗，4℃冰箱孵育過夜；⑦PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑧二抗：37℃，30 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑨滴加過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑩二氨基聯(lián)苯胺（DAB）/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光鏡下觀察。

1.3.2 結果判定[10]①按照染色強度：無色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。②按照陽性細胞數(shù)：總數(shù)<5%計0 分，5%～25%計1 分，>25%～50%計2 分，>50%計3 分。以①×②為最終得分，得分0～3 分為陰性（-），≥4 分為陽性（+）。

1.4 隨訪

通過電話和門診方式進行隨訪，以了解患者生存情況。從手術當天至死亡或最近1 次隨訪的間隔為“隨訪時間”。從手術當天至任何因素所致死亡或最近1 次隨訪時間為“總生存期”?！敖財唷笔录椿颊咴谧罱? 次隨訪仍然存活。隨訪至2019年10月31日。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構成比或率表示，比較做χ2檢驗，進一步兩兩比較采用χ2分割法（檢驗水準α=0.014）；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用多因素Cox 逐步回歸模型。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 隨訪結果

67 例肢體脂肪肉瘤患者均獲得術后隨訪，隨訪時間為2～81 個月，中位隨訪時間為39 個月。至隨訪結束，67 例肢體脂肪肉瘤患者中死亡34 例，死因均為腫瘤復發(fā)。

2.2 正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率的比較

正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率高于正常肢體脂肪瘤組織（P<0.014），肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率高于肢體脂肪肉瘤組織（P<0.014）。見表1和圖1。

圖1 SIRT1蛋白在肢體脂肪肉瘤組織中的表達

表1 正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1蛋白表達陽性率的比較

2.3 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1蛋白陽性表達率的比較

不同性別、年齡、腫瘤大小及發(fā)病部位的肢體脂肪肉瘤患者SIRT1 蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。不同腫瘤深度、Enneking外科分期、病理學類型及有無肺轉移肢體脂肪肉瘤患者的SIRT1 蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1蛋白陽性表達率比較

2.4 SIRT1 蛋白陽性表達者和陰性表達者總體生存分析

隨訪期間，40 例SIRT1 蛋白陽性表達者中存活13 例，死亡27 例；最短總生存期為2 個月，最長總生存期為74 個月。27 例SIRT1 蛋白陰性表達者中存活20 例，死亡7 例；最短總生存期為5 個月，最長總生存期為81 個月。兩組生存曲線比較，采用Logrank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝15.796，P=0.000）。見圖2。

圖2 SIRT1蛋白陽性表達者和陰性表達者總體生存曲線

2.5 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者1年、3年、5年生存率的比較

不同年齡、Enneking 外科分期、SIRT1 蛋白表達、病理學類型及有無肺轉移患者的1年、3年、5年生存率比較，采用Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同性別、腫瘤大小、發(fā)病部位及腫瘤深度患者的1年、3年、5年生存率比較，采用Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者1年、3年、5年生存率的比較（%）

2.6 肢體脂肪肉瘤患者生存預后的影響因素

將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的年齡、Enneking 外科分期、SIRT1 蛋白表達、病理學類型及肺轉移納入多因素Cox 逐步回歸模型，結果：年齡[=1.724（95% CI：1.180，3.075）]、Enneking 外科分期[=1.379（95% CI：1.015，2.952）]、SIRT1 蛋白表達[=1.403（95% CI：1.068，2.494）]、病理學類型[=4.620（95% CI：1.517，10.325）]及肺轉移[R^R=6.641（95% CI：1.655，17.808）]是影響肢體脂肪肉瘤患者生存預后的危險因素（P<0.05）。見表4。

表4 影響肢體脂肪肉瘤患者生存預后的多因素Cox逐步回歸分析參數(shù)

3 討論

脂肪肉瘤是一種由異型程度和分化程度不等的脂肪細胞所組成的罕見的惡性腫瘤，具有局部侵襲性強（呈局部浸潤性或破壞性生長）、可多次復發(fā)及可遠處轉移（血行轉移至肺部是其最常見的轉移方式）等特點[11-13]。該病患者一般主訴無明顯誘因發(fā)現(xiàn)包塊或腫物，本研究中67 例肢體脂肪肉瘤患者中因無痛性腫塊就診者有51 例，占76.12%。同時本研究中≥50 歲的患者有46 例，占68.66%，說明此惡性腫瘤好發(fā)于高齡人群；男性略多于女性。由于肢體是脂肪肉瘤的常見發(fā)病部位之一，故本研究以肢體脂肪肉瘤為重點，且在67 例肢體脂肪肉瘤患者中下肢發(fā)病占70.15%，與朱剛等[14]研究結果的下肢發(fā)病者占69.77%相似。另外本研究中下肢發(fā)病者主要發(fā)生于大腿部位，占85.11%；提示肢體脂肪肉瘤最常見的發(fā)病部位是大腿。世界衛(wèi)生組織（WHO）軟組織腫瘤分類（2002年版）中將脂肪肉瘤分為高分化型、去分化型、多形性型、黏液樣/圓細胞型和混合型[15]。在本研究67 例肢體脂肪肉瘤患者中高分化型/去分化型最為常見，占50.75%，其次為黏液樣/圓細胞型，占32.84%，多形性型則相對較少，占16.42%，這與既往報道[16]結果大致相同。但不管是哪種病理分型，手術治療仍是肢體脂肪肉瘤最主要的治療手段，且應盡量做到廣泛切除，保持切緣距離>1 cm。不過多數(shù)肢體脂肪肉瘤發(fā)病部位位于深層肌肉間隙，與重要神經(jīng)、血管臨近，故很多情況下無法達到廣泛切除的要求，加之術后尚無特效的輔助治療方法，因此長期療效并不理想。

SIRT1 基因定位于人類染色體10q21.3，有8 個內(nèi)含子與9 個外顯子，長約33 kb，編碼747 個氨基酸，SIRT1 蛋白質(zhì)相對分子量120 kD，細胞核是其主要分布區(qū)域。SIRT1 是第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）具有依賴性，與組織細胞生長、衰老、凋亡以及能量代謝等有關[17-19]。SIRT1 不僅能對組蛋白進行去乙酰化修飾，還可與多種非組蛋白質(zhì)進行相互作用，共同參與基因沉默、能量代謝調(diào)節(jié)、細胞衰老、抗氧化應激、脫氧核糖核酸（DNA）損傷修復等多種生理、病理過程[20-21]。SIRT1 在進行細胞自我修復與調(diào)整，增加細胞存活機會的同時，也可能會增加腫瘤細胞的存活機會，導致腫瘤細胞異常生長，使其凋亡受到抑制[22-23]。研究顯示[24-25]，SIRT1 在多種腫瘤細胞中的表達均有異常增加，如甲狀腺癌、胃癌、胰腺癌等，SIRT1 可能起著腫瘤促進作用。東星等[26]通過研究SIRT1 蛋白在大腸癌組織中的表達得出，SIRT1 蛋白表達隨著大腸癌浸潤深度的加深、TNM 分期的增加及淋巴結轉移而升高，且SIRT1 蛋白陽性表達者術后5年生存率低于SIRT1蛋白陰性表達者，該研究指出SIRT1 蛋白表達的增加引發(fā)了大腸癌細胞浸潤與轉移?？梢婋S著對SIRT1 研究的不斷深入，其在大腸癌和胃癌等多種惡性腫瘤中所扮演的角色逐漸被人們認識并爭論，以SIRT1 作為靶點來治療甲狀腺癌、消化系癌癥等惡性腫瘤正逐漸成為研究的熱點[27]。

筆者所在省份是腫瘤高發(fā)區(qū)，近年來肢體脂肪肉瘤的發(fā)病率、診斷率逐年升高，且部分患者已出現(xiàn)肺轉移，大部分患者需采取外科手術聯(lián)合新輔助化療的方案進行治療，手術和化療給患者及家屬造成了巨大的痛苦和經(jīng)濟損失，故而針對肢體脂肪肉瘤的早期干預性治療是醫(yī)生及患者非常關注的問題。為此本研究旨在檢測肢體脂肪肉瘤及肢體脂肪肉瘤肺轉移病灶中SIRT1 蛋白的表達特征，并分析SIRT1 蛋白表達水平與患者臨床病理特征及預后的關系，以期為筆者所在省份及全國的肢體脂肪肉瘤患者提供診治依據(jù)。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率分別為10.00%、59.70%及90.91%，肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率均高于正常肢體脂肪瘤組織，而肢體脂肪肉瘤肺轉移組織中SIRT1 蛋白陽性表達率又高于肢體脂肪肉瘤組織。這提示SIRT1 蛋白的異常表達在肢體脂肪肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用。本研究比較不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1 蛋白陽性表達率發(fā)現(xiàn)，SIRT1 蛋白的表達與肢體脂肪肉瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小和發(fā)病部位均無關。但SIRT1 蛋白表達強弱與肢體脂肪肉瘤患者的腫瘤深度、Enneking 外科分期、病理學類型和肺轉移有關，并呈現(xiàn)出SIRT1 蛋白表達強者腫瘤侵襲能力和惡性程度往往較高，肺轉移多見。同時本研究比較40 例SIRT1 陽性表達的肢體脂肪肉瘤患者與27 例SIRT1陰性表達者的生存情況得出，SIRT1 蛋白陽性表達者的總生存期短于SIRT1 蛋白陰性表達者，SIRT1蛋白陽性表達者的1年、3年和5年生存率低于陰性表達者。說明SIRT1 蛋白的表達強弱與肢體脂肪肉瘤患者的預后密切相關，SIRT1 陽性表達者的預后較差。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 陽性表達是影響肢體脂肪肉瘤患者預后的獨立危險因素之一，SIRT1 蛋白陽性表達者的死亡風險是陰性表達者的1.403 倍。針對SIRT1 蛋白相關生物學行為，采取沉默SIRT1基因表達、阻斷SIRT1 相關信號通路或干擾SIRT1蛋白合成的方法，可能達到抑制肢體脂肪肉瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的目的。

綜上所述，SIRT1 蛋白在肢體脂肪肉瘤中高表達，其表達與腫瘤深度、Enneking 外科分期、病理學類型及肺轉移有關，影響患者預后。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，本研究為今后肢體脂肪肉瘤患者采用以SIRT1 蛋白作為靶點的分子靶向治療提供了一定的參考價值。