新生鼠缺氧缺血性腦損傷遠(yuǎn)期行為學(xué)研究

林愛金，王潔瓊，敖麗娟，陳茉弦

昆明醫(yī)科大學(xué)康復(fù)學(xué)院，云南昆明市 650500；

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)由圍產(chǎn)期缺血、缺氧引起，是導(dǎo)致新生兒腦損傷死亡或神經(jīng)功能損害的最重要原因[1-2]，帶來嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、癲癇、孤獨(dú)癥和智力障礙等[3]。動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)已作為較為可靠的手段應(yīng)用于HIBD 模型，但主要集中于早期，且結(jié)論不一。本研究探討腦損傷模型小鼠遠(yuǎn)期行為的變化，主要涉及運(yùn)動(dòng)、情緒和學(xué)習(xí)記憶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠50 只，10 日齡，雌雄不限，體質(zhì)量3.85～4.50 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SCXK(滇)K2015-0002。室溫(23±2)℃飼養(yǎng)，光照12 h(7:00 a.m.～7:00 p.m.)，自由飲食水。

1.2 試驗(yàn)器材

1.2.1 明暗穿梭箱

由塑料板圍成40×40×35 cm 箱體，明箱底部和四壁均為白色，暗箱底部和四壁均為黑色，由一面40×35 cm的墻分隔，墻的底部中心有7×7 cm開口。

1.2.2 高架十字迷宮

由黑色木板圍成兩個(gè)開臂和兩個(gè)閉臂，“十”字型擺放，臂底35×5 cm，閉臂墻高15 cm，開臂邊緣由0.5×0.5 cm 的方塊包圍，距地面100 cm；中央平臺(tái)為5×5cm正方形。

1.2.3 新事物試驗(yàn)箱

由透明塑料板圍成50×50×50 cm 的正方形箱體，周圍用黑布環(huán)繞。

1.2.4 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

30×8×10 cm 迷宮臂3 個(gè)，相互間夾角120°。攝像機(jī)置于臂上方1.5 m，記錄小鼠活動(dòng)，Supermaze 分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司)分析。

1.3 動(dòng)物分組及造模

小鼠分為對(duì)照組(n=20)和HIBD 組(n=30)。HIBD 組異氟烷25 μl 吸入麻醉，固定于無菌動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，頸部切口5～10 mm，分離左頸總動(dòng)脈；5-0 絲線雙重結(jié)扎左頸總動(dòng)脈后離斷，縫合傷口。手術(shù)操作控制在10 min內(nèi)。

術(shù)后，小鼠置于帶有母鼠氣味的墊料上休息30 min，之后轉(zhuǎn)移到母鼠旁休息1 h，再置于含8% O2和92%N2混合氣體的34 ℃恒溫缺氧箱中45 min。

對(duì)照組僅切開左頸部皮膚，暴露頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，直接縫合傷口。

造模結(jié)束后放回母鼠身邊自由飲食。

1.4 模型評(píng)價(jià)

于術(shù)后1 d 和3 d 行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，術(shù)后3 d 各組取3只小鼠行TTC染色，評(píng)估模型是否成功。

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估

采用Longa 評(píng)分法：0 分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1 分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分，先癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，對(duì)側(cè)傾倒；4 分，行走困難、意識(shí)喪失。評(píng)分1～3分進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

評(píng)定者對(duì)分組不知情，重復(fù)評(píng)估3次，取平均值。

1.4.2 TTC染色

每組取3 只小鼠，麻醉后斷頭取腦，肉眼觀察腦組織大體形態(tài)變化。對(duì)照組左右大腦半球?qū)ΨQ，體積未增大，未出現(xiàn)病理變化；模型組左腦組織輕微水腫，體積稍大于右側(cè)，出現(xiàn)梗死灶，呈蒼白色。見圖1。

圖1 兩組大體觀察

腦組織于-20 ℃冰箱中冰凍20 min 后，冠狀切片，厚2 mm，置2%TTC 溶液中，37 ℃恒溫30 min，4%多聚甲醛固定，拍照。結(jié)果與肉眼觀察相似。見圖2。

圖2 兩組TTC染色

造模過程中，結(jié)扎過程死亡2 只，缺氧過程死亡3 只；造模后，Longa 評(píng)分0 分2 只，未出現(xiàn)梗死灶4只。最終造模成功19只，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

小鼠于出生后2 個(gè)月行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，期間無小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d。

1.5.1 運(yùn)動(dòng)功能

采用懸吊試驗(yàn)。鐵絲水平，距桌面50 cm，小鼠前爪抓握鐵絲，記錄小鼠懸吊時(shí)間。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1分，≤10 s；2 分，＞10～30 s；3 分，＞30～120 s；4 分，＞2～5 min；5分，＞5 min。

1.5.2 情緒

1.5.2.1 明暗箱試驗(yàn)

小鼠從明箱放入，自由活動(dòng)5 min，記錄潛伏期、明箱累積時(shí)間和進(jìn)入明箱次數(shù)。

1.5.2.2 高架十字迷宮

將小鼠從中央?yún)^(qū)放入，頭朝向開放臂，自由活動(dòng)5 min，記錄小鼠在中心區(qū)、開/閉臂停留時(shí)間以及進(jìn)入開/閉臂的次數(shù)。

1.5.3 學(xué)習(xí)和記憶功能

1.5.3.1 物體識(shí)別試驗(yàn)

新事物試驗(yàn)箱左上角和右上角各放置一個(gè)形狀大小相同的長方形物體；將小鼠從下墻中央放入，自由活動(dòng)10 min；取出小鼠休息1 h；箱內(nèi)一個(gè)長方體改為一個(gè)大小相似的圓柱體；小鼠同一位置放入，自由活動(dòng)5 min。記錄后5 min 內(nèi)小鼠在新、舊物體旁停留時(shí)間，計(jì)算物體識(shí)別指數(shù)。

1.5.3.2 Y迷宮

先將一臂用擋板擋住(新異臂)，小鼠從其他任一臂進(jìn)入(起始臂)，自由活動(dòng)10 min。取出小鼠休息1 h。移除新異臂擋板，小鼠從起始臂進(jìn)入，自由活動(dòng)5 min，記錄在三個(gè)臂的停留時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以()表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能

HIBD 組懸吊試驗(yàn)評(píng)分(2.4±0.62)分，低于對(duì)照組的(3.0±0.58)分(t=2.785,P=0.01)。

2.2 情緒

2.2.1 明暗箱試驗(yàn)

HIBD 組潛伏期顯著長于對(duì)照組(P＜0.001)，明箱累積時(shí)間和穿入明箱次數(shù)少于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組明暗箱試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2.2 高架十字迷宮

HIBD 組開臂停留時(shí)間顯著短于對(duì)照組(P＜0.001)，閉臂停留時(shí)間明顯長于對(duì)照組(P＜0.01)。見表2。

表2 兩組高架十字迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 學(xué)習(xí)和記憶功能

2.3.1 物體識(shí)別試驗(yàn)

HIBD 組舊事物停留時(shí)間長于對(duì)照組(P＜0.05)，物體識(shí)別指數(shù)低于對(duì)照組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組別新物體識(shí)別試驗(yàn)結(jié)果比較

2.3.2 Y迷宮

HIBD 組起始臂停留時(shí)間短于對(duì)照組(P＜0.05)，新異臂停留時(shí)間短于對(duì)照組(P＜0.05)。見表4。

表4 各組別Y迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較(s)

3 討論

圍產(chǎn)期缺氧、缺血導(dǎo)致新生兒死亡或殘疾是一個(gè)重要的臨床問題。每年早產(chǎn)并發(fā)癥占全球新生兒死亡的29%，其中3%導(dǎo)致終生殘疾[4]。新生兒HIBD 最常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀蒖ice 等[5]于1981 年首次提出，即單側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎后暴露于低氧環(huán)境中一段時(shí)間，根據(jù)缺氧暴露的持續(xù)時(shí)間，可誘導(dǎo)輕、中、重度損傷，模型利用出生7～12 d 幼鼠復(fù)制，約相當(dāng)于人類妊娠36～40周。C57BL/6 小鼠對(duì)缺氧、缺血損傷特別敏感，適合研究新生兒腦損傷[6]。許多針對(duì)缺氧缺血性腦病的研究用出生10 d的小鼠[7-8]。

新生兒腦損傷與皮質(zhì)下白質(zhì)和灰質(zhì)損傷、結(jié)構(gòu)連接受損有關(guān)[9]，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙[10]。由于海馬、紋狀體和皮質(zhì)損傷，發(fā)育早期和晚期會(huì)出現(xiàn)焦慮相關(guān)行為和認(rèn)知障礙，以及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙[11]。腦缺氧、缺血會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝、發(fā)育和結(jié)構(gòu)破壞，改變髓鞘形成模式，導(dǎo)致行為障礙[12]。

懸吊試驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力[13]；明暗箱試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的自發(fā)活動(dòng)和探索行為，反映是否存在焦慮、抑郁行為[14]；高架十字迷宮試驗(yàn)也用于評(píng)價(jià)小鼠的焦慮和抑郁行為[15]；物體識(shí)別試驗(yàn)[16]和Y 迷宮試驗(yàn)[17]主要用于評(píng)估小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

本研究顯示，新生小鼠發(fā)生HIBD 后，運(yùn)動(dòng)、情緒和認(rèn)知功能損害會(huì)持續(xù)到成年。早期診斷和治療至關(guān)重要。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。