藜麥甾醇提取工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析

劉雅謙，李琳，孫萬(wàn)成，羅毅皓

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

藜麥（Chenopodium quinoa）是一種古老的假谷物，屬于黎科，主要分布在我國(guó)的甘肅、青海、內(nèi)蒙古等地。藜麥富含蛋白質(zhì)、脂類、纖維素、維生素和礦物質(zhì)，對(duì)極端的環(huán)境條件有很好的適應(yīng)性[1-2]，已有大量的研究報(bào)道了藜麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但對(duì)于藜麥油脂的研究較少見(jiàn)。研究表明[3]，藜麥油脂中包含大量的生物活性化合物（包括棕櫚酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸、植物甾醇、角鯊烯），可應(yīng)用于功能性食品開(kāi)發(fā)[4]。

植物甾醇（phytosterol，PS）是植物細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，被譽(yù)為“生命的鑰匙”，已有大量的報(bào)道[5]證明植物甾醇具有降低低密度脂蛋白膽固醇的特性。近年來(lái)對(duì)于藜麥具有的抗氧化[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[9]等功能特性也相繼被證實(shí)。目前提取植物甾醇的方法，提取率相對(duì)較低且溶劑耗費(fèi)較大，如溶劑提取法、超聲波輔助提取法和皂化法等。

超臨界CO2提取技術(shù)可以排除殘留液體溶劑的污染，且具有更高的擴(kuò)散率（10-4cm2/s）[10]，對(duì)于親脂性化合物有更高的親和力[11]。超臨界CO2提取技術(shù)通過(guò)改變溫度和壓力來(lái)調(diào)節(jié)溶劑溶解力，以獲得高純度的脂質(zhì)；通過(guò)降低壓力將溶解的溶質(zhì)從CO2中分離出來(lái)[12]。華正根等[13]從靈芝中提取三萜和甾醇成分，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取法的提取效果顯著大于乙醇回流法。超臨界CO2萃取法適用于大規(guī)模提取不同類型的基質(zhì)，用于生產(chǎn)食品、藥品、化妝品和其它高價(jià)值的脂質(zhì)和生物活性物質(zhì)[14]。目前有關(guān)超臨界CO2-皂化法協(xié)同輔助提取植物甾醇的研究鮮有報(bào)道。因此本試驗(yàn)探究超臨界CO2法和皂化法協(xié)同提取藜麥甾醇的工藝條件，并對(duì)藜麥油脂中的脂肪酸進(jìn)行成分分析，以期為藜麥資源的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

藜麥：市售；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）:北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、濃磷酸、濃硫酸、無(wú)水乙醇、正己烷、甲醇、三氟化硼:天津巴斯夫化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鉀:唐山三孚硅業(yè)股份有限公司；二氧化碳（純度＞99.99%）:西寧磊豪商貿(mào)有限公司；所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超臨界萃取裝置（Spe-ed SFE-NP）：上海帝博思生物科技有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)（722N）：上海佑科儀器儀表有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGX-9073B）：上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；氮吹儀（DN-12A）：上海比朗儀器制造有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（TSQTM9000）：賽默飛世爾科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州金壇良友儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TCL-16M）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥甾醇的提取

將藜麥清洗除雜，烘箱干燥后，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取30 g藜麥粉置于超臨界CO2萃取釜中，在一定的壓力和溫度下萃取一段時(shí)間后得到藜麥油脂，將藜麥油脂進(jìn)行離心，離心后的上清液放入具塞試管中，加入2 mol/L KOH-乙醇溶液，在70℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行皂化2 h，冷卻后，將其轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入正己烷，振搖數(shù)分鐘，將正己烷層取出，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)正己烷，用無(wú)水乙醇溶出，最終定容至10 mL。以備藜麥甾醇含量的測(cè)定。以萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取壓力為因素，考察不同條件下藜麥甾醇得率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

本研究以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算藜麥甾醇的得率，確定最優(yōu)工藝條件。單因素試驗(yàn)水平參照文獻(xiàn)[17]設(shè)計(jì)，CO2流量控制為5 mL/min。固定條件：萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，萃取時(shí)間2 h，選取一個(gè)因素為變量，固定另外兩個(gè)條件。分別考察不同萃取壓力（15、20、25、30、35 MPa）、不同萃取溫度（40、45、50、55、60 ℃）、不同萃取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)藜麥甾醇得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在超臨界CO2-皂化法提取藜麥甾醇單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)三因素三水平L9（33）正交試驗(yàn)表來(lái)確定藜麥甾醇提取的最佳方案。試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor level of orthogonal test

1.2.4 藜麥甾醇得率的測(cè)定

精確稱取5 mL的藜麥甾醇提取物樣品溶液，用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋，利用硫磷鐵法檢測(cè)樣品溶液，在530 nm處測(cè)定吸光值，配制一系列濃度梯度β-谷甾醇溶液，繪制吸光度-β-谷甾醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用回歸方程求出藜麥甾醇的質(zhì)量濃度，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]，計(jì)算公式如下。

式中：X為藜麥甾醇得率，mg/g；C為提取液吸光度對(duì)應(yīng)甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；B為稀釋倍數(shù)；M為藜麥油脂的質(zhì)量，g。

1.2.5 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）前處理及分析

GC-MS前處理及分析參考文獻(xiàn)[16]中的方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 23軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of β-sitosterol

由圖1得到回歸方程y=15.564x-0.003 8，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，根據(jù)方程可知β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸性較好，可進(jìn)行定量分析。

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 萃取壓力對(duì)藜麥甾醇提取效果的影響

不同萃取壓力對(duì)藜麥甾醇得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同萃取壓力對(duì)藜麥甾醇得率的影響Fig.2 Effect of different extraction pressure on the yield of quinoa sterol

由圖2可知，藜麥甾醇得率隨著萃取壓力的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。隨著萃取壓力的增大，藜麥甾醇得率逐漸提高，這可能是由于壓力的增加導(dǎo)致CO2的密度增大，被萃取物的溶解度增加，在壓力為25 MPa時(shí)，藜麥甾醇得率達(dá)到最大值，為19.56 mg/g。但當(dāng)壓力繼續(xù)增高，藜麥甾醇得率開(kāi)始下降，可能是由于隨著萃取壓力的增加，CO2氣體的擴(kuò)散系數(shù)下降，從而不利于藜麥甾醇的提取。因此選擇萃取壓力為25 MPa。

2.2.2 萃取溫度對(duì)藜麥甾醇提取效果的影響

萃取溫度也是影響超臨界CO2萃取能力的主要因素之一。系統(tǒng)溫度的升高會(huì)降低CO2的密度，這可能導(dǎo)致溶劑的溶解能力降低[18]。另一方面，溫度升高會(huì)增加擴(kuò)散率和蒸汽壓力，從而有助于分子輕松釋放到溶劑中。因此，施加溫度的凈效應(yīng)取決于分子蒸汽壓和萃取劑密度的變化[19]。不同萃取溫度對(duì)藜麥甾醇得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同萃取溫度對(duì)藜麥甾醇得率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on the yield of quinoa sterol

由圖3可知，在40℃～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，藜麥甾醇得率逐漸增加。在50℃時(shí)達(dá)到最大值，為19.44 mg/g。在50℃～60℃范圍內(nèi)，隨著溫度繼續(xù)升高，藜麥甾醇得率開(kāi)始下降，此階段可能是CO2密度起主要作用。因此選取萃取溫度為50℃。

2.2.3 萃取時(shí)間對(duì)藜麥甾醇提取效果的影響

不同萃取時(shí)間對(duì)藜麥甾醇得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同萃取時(shí)間對(duì)藜麥甾醇得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on the yield of quinoa sterol

由圖4可知，萃取時(shí)間在1.0 h～2.0 h內(nèi)，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥甾醇得率逐漸增加，2.0 h后保持穩(wěn)定，分析原因可能是，在1.0 h～2.0 h內(nèi)，CO2流體逐漸進(jìn)入到物料中，并將物料內(nèi)成分溶解，最后通過(guò)強(qiáng)大的氣流將藜麥甾醇萃取出來(lái)，當(dāng)時(shí)間到達(dá)2.0 h時(shí)，藜麥甾醇幾乎全部被萃取出，考慮到過(guò)高的時(shí)間浪費(fèi)成本，因此選取萃取時(shí)間為2.0 h。

2.3 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定出超臨界CO2-皂化法提取藜麥甾醇的適宜條件為：萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，萃取時(shí)間2 h，在此基礎(chǔ)上以藜麥甾醇得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)中各檢測(cè)指標(biāo)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 藜麥甾醇得率方差分析Table 3 Variance analysis of quinoa sterol extraction rate

由表2分析可知，根據(jù)K1、K2、K3可以確定出萃取藜麥甾醇的最優(yōu)試驗(yàn)組合為A2B2C3，即萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50℃，萃取時(shí)間為2 h。這3個(gè)因素對(duì)藜麥甾醇得率的影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞B，即萃取壓力＞萃取時(shí)間＞萃取溫度。按照最優(yōu)的工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均操作3次，藜麥甾醇的得率為20.20 mg/g。此時(shí)藜麥甾醇的得率最高，與正交試驗(yàn)優(yōu)化出的結(jié)果相同，表明該工藝的穩(wěn)定可行。李會(huì)珍等[20]采用超聲波輔助萃取法提取紫蘇中的甾醇，最終紫蘇甾醇得率可達(dá)2.604 mg/g。李波等[21]采用微波輔助提取法提取大豆油中植物甾醇，提取率可達(dá)到36.22%。還有研究表明[22]利用皂化-超聲波法提取玉米須中的植物甾醇，得率可達(dá)10.588 6 mg/g。馬永芹[23]利用超臨界CO2萃取米糠甾醇油，在最佳的工藝條件下制取米糠油中甾醇含量為2.274%，研究結(jié)果的不盡相同可能與原料中甾醇的含量以及提取方法的不同有關(guān)。本試驗(yàn)利用超臨界CO2-皂化法提取藜麥中的甾醇，藜麥甾醇的得率相對(duì)較高，該提取方法可能優(yōu)于超聲波輔助提取法和微波輔助提取法。

F檢驗(yàn)結(jié)果表明，萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)藜麥甾醇得率的影響有顯著性差異（p＜0.05）。

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)

利用GC-MS對(duì)藜麥油脂進(jìn)行成分分析，得到藜麥油脂的色譜圖見(jiàn)圖5，脂肪酸組成成分分析見(jiàn)表4。

表4 藜麥油脂GC-MS成分分析Table 4 GC-MS analysis of components of quinoa oil

圖5 GC-MS色譜圖Fig.5GC-MS chromatogram

從表4中可以看出藜麥油脂中一共有29種脂肪酸，飽和脂肪酸的含量為25.59%，不飽和脂肪酸的含量為74.59%，單不飽和脂肪酸的含量為28.70%，多不飽和脂肪酸的含量為45.89%，超長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量為27.66%，支鏈脂肪酸的含量為0.63%。多不飽和脂肪酸中以常規(guī)的偶數(shù)碳脂肪酸為主。飽和脂肪酸中棕櫚酸的含量最高，不飽和脂肪酸中亞油酸含量最高。藜麥油脂中主要的脂肪酸為亞油酸、亞麻酸和油酸，棕櫚酸的含量相對(duì)較低，其中還檢測(cè)到二十烯酸和介酸，這與Chen等[3]對(duì)藜麥采用氣相色譜法分析的結(jié)果相似。亞油酸是藜麥油脂中含量最多的脂肪酸，Ryan等[25]利用溶劑提取法提取藜麥油脂，氣相色譜法測(cè)定藜麥油脂中脂肪酸，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)亞油酸（48.07%）含量最高，其次是油酸（29.49%）和棕櫚酸（9.18%）含量較高，結(jié)果與本次研究結(jié)果有差異，可能與藜麥品種以及提油方法不同有關(guān)。另外，本次檢測(cè)結(jié)果中含有0.63%的支鏈脂肪酸，這是其他研究人員對(duì)于藜麥脂肪酸分析中尚未見(jiàn)報(bào)道的。

從表4中可以看到參考文獻(xiàn)[24]中研究人員對(duì)藜麥油脂脂肪酸檢測(cè)的結(jié)果，一共檢測(cè)出26種脂肪酸，檢測(cè)出的脂肪酸種類與本次研究結(jié)果相似，但也具有一定的差異，其中亞麻酸的含量為30.96%，亞油酸的含量為21.94%。棕櫚酸的含量為7.15%，超長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量為15.37%，而本次試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中亞油酸含量為25.03%，亞麻酸的含量為18.85%，棕櫚酸含量為7.96%，超長(zhǎng)鏈脂肪酸含量為27.66%。該研究人員還檢測(cè)出了藜麥油脂中的反油酸以及二十碳五烯酸等，這些都是本次檢測(cè)所沒(méi)有檢測(cè)到的。這些檢測(cè)結(jié)果的差異可能與藜麥品種不同有關(guān)。該研究人員檢測(cè)的結(jié)果中ω-3∶ω-6脂肪酸為1.3，而本次研究結(jié)果為0.7。表明本次的研究結(jié)果中ω-6系列的脂肪酸相對(duì)含量較高。這兩種脂肪酸的平衡在人類飲食中很重要[26]。在現(xiàn)代人的飲食中，建議食用富含ω-3和ω-6系列脂肪酸的食物，因?yàn)檫@兩種必需脂肪酸在人體中不合成。

亞油酸是人體健康必不可缺的一種多不飽和脂肪酸，屬于ω-6系列，多數(shù)研究報(bào)道了亞油酸能夠降低低密度脂蛋白膽固醇，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[27-28]，是生產(chǎn)功能性食品補(bǔ)充劑的常用成分，還具有降低炎癥反應(yīng)的作用，例如，Lowry等[29]研究證明了亞油酸通過(guò)降低一氧化氮合酶降低脂多糖刺激的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放。亞麻酸屬于ω-3系列，ω-3脂肪酸可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、血壓和發(fā)炎過(guò)程[30]，是人類健康飲食中不可或缺的一部分。亞麻酸能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫力和抗氧化能力，改善肉質(zhì)并降低血脂[31]，可用作保健品和醫(yī)藥品。超長(zhǎng)鏈脂肪酸是脂質(zhì)介質(zhì)的前體，也是細(xì)胞脂質(zhì)如鞘脂和甘油磷脂的組成成分。油酸對(duì)人體也有一定的積極作用，膳食油酸對(duì)老年人的認(rèn)知具有保護(hù)作用[32]。研究表明[33]，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸具有保護(hù)視網(wǎng)膜的潛力。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合超臨界CO2-皂化法萃取技術(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，得到超臨界CO2-皂化法萃取藜麥甾醇的最佳工藝條件，即萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50℃，萃取時(shí)間為2.0 h，在此條件下，藜麥甾醇得率可達(dá)20.20 mg/g；通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜分析得出，從藜麥油脂中共分離鑒定出29種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸的相對(duì)含量為74.59%，亞油酸、亞麻酸和油酸為藜麥油脂的主要脂肪酸。由于藜麥油脂中植物甾醇以及不飽和脂肪酸的存在，使得藜麥油脂可用于功能性食品和化妝品配方。藜麥油脂極具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。