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    莼菜多糖的提取工藝優(yōu)化研究

    2021-08-27 06:49:28張守花張新海劉延奇秦令祥
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2021年15期
    關(guān)鍵詞:脈沖數(shù)莼菜酶法

    張守花,張新海,劉延奇,秦令祥

    (1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南 鶴壁 458030;2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;3.漯河市食品研究院有限公司,河南 漯河 462300)

    莼菜(Brasenia schreberi),別稱(chēng)馬蹄菜、水葵等,屬睡蓮科的莼屬,多年生水生宿根草本植物[1],廣泛分布于東亞、大洋洲、西非和北美地區(qū)。莼菜是一種珍貴的水生蔬菜,富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等,具有良好的食用和藥用價(jià)值[2-3]。莼菜具有清熱補(bǔ)血、潤(rùn)肺解毒、利尿消腫、健胃促消化、止瀉止嘔、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降三高、抗衰老等功效[4-5],對(duì)胃潰瘍、腫痛、黃疸和熱痢等有治療作用[6-8],有“水中人參”、“美容佳蔬”和“抗癌佳品”之稱(chēng)[9]。莼菜多糖(Brasenia schreberi polysaccharide,BSP)是莼菜中含有的一種重要的生物活性成分,具有提高免疫力和改善亞健康的作用[10-11]。

    目前,植物多糖的提取主要有熱水浸提、酶解[12]、微波輔助、超聲波輔助[13]和微波協(xié)同酶解[14]等方法,這些方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。高壓脈沖電場(chǎng)(high intensity pulsed electric fields,HPEP)是一種新興的現(xiàn)代高新提取技術(shù),其原理是利用瞬間脈沖高壓破壁植物細(xì)胞壁,使細(xì)胞膜電位混亂,使其可逆或不可逆破裂,促進(jìn)極性分子在細(xì)胞內(nèi)定向排列,功效成分溶出。該技術(shù)具有非熱性傳遞均勻、效率高、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物功能成分的提取[15-19]。酶解法是利用酶破壞細(xì)胞壁,溶出功效成分。高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶技術(shù)是一種新型、先進(jìn)的天然產(chǎn)物提取技術(shù),具有提取率高、提取溫度低、提取時(shí)間短、能耗低、對(duì)活性成分損傷小等優(yōu)點(diǎn)[20-21]。然而,高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究采用高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,以期提高BSP提取率,為后續(xù)BSP的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    莼菜(人工種植):蘇州東山東湖莼菜廠;纖維素酶(20 000 U/g):河北利華生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(100 000 U/g):陜西源優(yōu)生物科技有限公司;果膠酶(20 000 U/g):北京藍(lán)博斯特生物有限公司;硫酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DE-100型高精度雙極高壓靜電場(chǎng)發(fā)生器:寧波新芝生物科技有限公司;RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海耀特儀器設(shè)備有限公司;760CRT紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):上海儀電分析儀器有限公司;PE-28酸度計(jì):北京梅特勒-托利多儀器有限公司;D2015W電動(dòng)攪拌器:上海梅穎浦儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 莼菜粉的制備

    將莼菜經(jīng)氫氧化鈉溶液脫去體外膠質(zhì)后,再用清水淋洗,熱風(fēng)干燥,勻漿機(jī)剪切制得莼菜粉,備用。

    1.3.2 BSP的提取

    莼菜粉→按比例加水?dāng)嚢杈鶆颉邏好}沖電場(chǎng)提取→取出調(diào)節(jié)pH值(檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液)→復(fù)合酶法提取→提取液Sevag法[22]脫蛋白→離心(5 000 r/min,10 min)→上清液減壓濃縮→加乙醇沉淀(3倍體積95%乙醇)→靜置(放入4℃冰箱,靜置24h)→離心(5 000 r/min,10 min)→真空冷凍干燥→莼菜粗多糖。

    1.3.3 BSP測(cè)定

    BSP測(cè)定采用苯酚-硫酸法[23]。

    1.3.4 BSP提取率計(jì)算

    BSP提取率計(jì)算公式如下。

    1.3.5 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.5.1 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    按1.3.2的方法,稱(chēng)取10 g莼菜粉5份進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP,研究不同因素對(duì)BSP提取率的影響。固定條件:料液比 1∶30(g/mL),電場(chǎng)強(qiáng)度 20 kV/cm,脈沖數(shù)8,提取時(shí)間30 min。分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL),電場(chǎng)強(qiáng)度為 10、15、20、25、30 kV/cm,脈沖數(shù)為 2、4、6、8、10,提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min,進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組重復(fù)3 次,取平均值。

    1.3.5.2 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取表1列出的4個(gè)因素,采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design

    1.3.6 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.6.1 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)提取后,再按1.3.2的方法稱(chēng)取10 g莼菜粉5份耦合復(fù)合酶法提取BSP,研究不同因素對(duì)BSP提取率的影響。固定條件:復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶質(zhì)量比為1∶1∶1)添加量 2.5%,酶解pH4.5,酶解溫度50℃,酶解時(shí)間50 min。分別設(shè)定復(fù)合酶添加量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,酶解pH3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0,酶解溫度 30、40、50、60、70℃,酶解時(shí)間 20、30、40、50、60 min,進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組重復(fù)3次,取平均值。

    1.3.6.2 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取表2列出的4個(gè)因素,采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

    表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor levels table of orthogonal experimental design

    1.3.7 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行測(cè)定的結(jié)果的平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel整理,采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP工藝條件優(yōu)化

    2.1.1 料液比對(duì)BSP提取率的影響

    料液比對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖1。

    圖1 料液比對(duì)BSP提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the BSP extraction rate

    由圖1可知,BSP提取率隨著溶劑用量的增加先升高后趨于平緩。這是因?yàn)槿軇┯昧吭黾樱徊思?xì)胞與其接觸面之間的濃度差增大,促進(jìn)了多糖的浸出,提取率升高。但當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值時(shí),多糖基本完全被溶出,提取率不再顯著升高,而趨于穩(wěn)定。這與代名君等[24]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此,料液比1∶30(g/mL)為佳。

    2.1.2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響

    電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖2。

    圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響Fig.2 Effect of electric field intensity on the BSP extraction rate

    由圖2可知,BSP提取率隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加先升高再降低。這是因?yàn)殡妶?chǎng)強(qiáng)度增加,莼菜細(xì)胞破壞增多,極性溶劑運(yùn)動(dòng)加快,進(jìn)入細(xì)胞的溶劑增多,多糖溶出更易,提取率升高。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度≥20 kV/cm時(shí),過(guò)大的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)使多糖降解,提取率降低。這與Wang Ke等[25]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此,電場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm為佳。

    2.1.3 脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響

    脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖3。

    圖3 脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響Fig.3 Effect of the number of pulses on the BSP extraction rate

    由圖3可知,BSP提取率隨著脈沖數(shù)的增加先升高再降低。這是因?yàn)槊}沖次數(shù)增加,電場(chǎng)作用于提取液的程度和頻率增加,莼菜細(xì)胞破壞的程度和數(shù)量增加,提取率升高。當(dāng)脈沖數(shù)≥8時(shí),過(guò)大的電場(chǎng)和脈沖頻率增強(qiáng)了多糖的電解,促使多糖部分降解,提取率降低。這與Zhou Yajun等[26]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此,脈沖數(shù)8為佳。

    2.1.4 提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響

    提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖4。

    圖4 提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the BSP extraction rate

    由圖4可知,BSP提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低。這是因?yàn)樘崛r(shí)間增加,高壓電場(chǎng)作用程度增加,細(xì)胞破裂程度和數(shù)量增多,提取率升高。當(dāng)提取時(shí)間≥30 min時(shí),細(xì)胞基本完全破裂,再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,多糖結(jié)構(gòu)會(huì)部分被破壞,提取率降低。這與周亞軍等[27]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此,提取時(shí)間30 min為佳。

    2.1.5 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果

    高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of orthogonal experimental design

    高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results

    由表3、表4結(jié)果分析可知,各因素影響關(guān)系為:A>D>B>C。料液比和提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響較大,達(dá)到顯著水平,其它不顯著。通過(guò)k值的分析,其最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶30(g/mL),提取時(shí)間40 min,電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm,脈沖數(shù)6。在上述最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn),平行驗(yàn)證3次,BSP提取率為10.75%(3次平均值)。

    2.2 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP工藝條件的優(yōu)化

    在高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的最佳工藝條件下,再進(jìn)一步耦合復(fù)合酶法提取BSP。

    2.2.1 復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響

    復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖5。

    圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響Fig.5 Effect of compound enzyme addition on the BSP extraction rate

    由圖5可知,BSP提取率隨復(fù)合酶添加量的增加先升高再趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?,酶添加量的增加,加大了與底物接觸面積,酶解更充分,多糖溶出增多,提取率升高。當(dāng)復(fù)合酶添加量≥2.5%時(shí),酶解反應(yīng)基本完全,再繼續(xù)增加添加量,多糖提取率也不會(huì)顯著變化而是趨于穩(wěn)定。HUYNH等[28]的研究也表明酶添加量過(guò)多,酶解已完全,對(duì)提取率影響不明顯而趨于穩(wěn)定。因此,復(fù)合酶添加量2.5%為佳。

    2.2.2 酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響

    酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖6。

    圖6 酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis pH value on the BSP extraction rate

    由圖6可知,BSP提取率隨著酶解pH值的增大呈先升高再降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)?,pH值是影響酶活性的重要因素之一,酶解反應(yīng)在最適宜pH值時(shí),酶活性最高,酶解最充分,提取率也最高,反之提取率降低。這與孟利娜等[29]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此,酶解pH值為4.5最佳。

    2.2.3 酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響

    酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖7。

    圖7 酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis temperature on the BSP extraction rate

    由圖7可知,BSP提取率隨著酶解溫度的升高呈先升高再降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)槊附鉁囟壬?,酶活性增?qiáng),酶解反應(yīng)加快,多糖溶出增多,提取率升高;當(dāng)酶解溫度≥50℃后,酶活性開(kāi)始降低,再繼續(xù)增加酶解溫度,部分酶會(huì)失去活性,提取率降低。這與李曉等[30]的研究結(jié)果趨勢(shì)基本一致。因此,酶解溫度50℃最佳。

    2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響

    酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響見(jiàn)圖8。

    圖8 酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響Fig.8 Effect of enzymolysis time on the BSP extraction rate

    由圖8可知,BSP提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高再趨于平緩。這是因?yàn)?,酶解時(shí)間過(guò)短,酶解程度較低,酶解不充分,多糖溶出不多;而酶解時(shí)間達(dá)到最佳時(shí)間后,酶解已經(jīng)完全,再延長(zhǎng)酶解時(shí)間,提取率也不會(huì)明顯升高而趨于平緩。這與Sowbhagya等[31]的研究結(jié)果趨勢(shì)基本相似。因此,酶解時(shí)間50 min最佳。

    2.2.5 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果

    高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal experimental design

    高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

    表6 方差分析結(jié)果Table 6 The variance analysis results

    由表5、表6結(jié)果分析可知,各因素的影響順序?yàn)椋篍>F>H>G,復(fù)合酶添加量和酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響較大,達(dá)到了顯著水平,其它不顯著。通過(guò)對(duì)k值的分析,高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的最佳工藝參數(shù)為:E2F2G1H3,即復(fù)合酶添加量2.5%,酶解pH值4.5,酶解時(shí)間60 min,酶解溫度40℃。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),平行驗(yàn)證3次,得到BSP提取率為12.27%(3次平均值)。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)為了比較單一提取方法提取BSP和復(fù)合提取方法提取BSP的不同,試驗(yàn)先進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)法提取BSP,再進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP,并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳工藝參數(shù)為:料液比 1∶30(g/mL),提取時(shí)間 40 min,電場(chǎng)強(qiáng)度 25 kV/cm,脈沖數(shù)6;然后再耦合復(fù)合酶法提取,復(fù)合酶添加量2.5%,酶解pH值4.5,酶解時(shí)間60 min,酶解溫度40℃,該條件下,BSP提取率為12.27%。本試驗(yàn)所用的高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP,與單一的高壓脈沖電場(chǎng)提取相比,其提取率明顯提高,是一種新的提取BSP的方法,為后續(xù)BSP的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

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