發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁揮發(fā)性成分的變化

彭興興，郭巧云，楊土琳

（1.江門(mén)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 江門(mén) 529030；2.廣東省綠色高性能新材料研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東 江門(mén) 529030）

南瓜是一種常見(jiàn)的蔬菜，種植范圍廣，全國(guó)各地都有栽培。南瓜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的各種氨基酸、多糖、類(lèi)胡蘿卜素、礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有輔助降血脂、輔助降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種藥用價(jià)值[1-4]。根據(jù)FAOSTAT數(shù)據(jù)庫(kù)，2014年我國(guó)南瓜總產(chǎn)量超過(guò)3 000萬(wàn)噸，生產(chǎn)面積110萬(wàn)公頃，南瓜資源十分豐富[5]，但南瓜產(chǎn)品形式單一、加工產(chǎn)業(yè)處于下游，附加值低。乳酸菌廣泛存在于自然界中，是一類(lèi)可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱(chēng)[6]。乳酸菌具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，改善人體消化吸收系統(tǒng)，降低膽固醇等生物保健功能[7-10]?，F(xiàn)今，發(fā)酵果蔬汁飲料發(fā)展迅猛[11-12]，已有多款同類(lèi)產(chǎn)品上市，并且深得廣大消費(fèi)者青睞。因此，開(kāi)發(fā)功能性乳酸菌發(fā)酵相關(guān)的南瓜飲品，不僅可以提高南瓜的精深加工附加值，而且可以促進(jìn)南瓜行業(yè)發(fā)展，改變南瓜加工的初級(jí)階段地位。風(fēng)味一直是構(gòu)成食品品質(zhì)最重要的因素之一，也是其能否為廣大消費(fèi)者所接受的關(guān)鍵因素。通過(guò)利用原料當(dāng)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌可以改變果蔬汁的風(fēng)味組成結(jié)構(gòu)，生成揮發(fā)性成分和滋味物質(zhì)，從而影響到產(chǎn)品的風(fēng)味和口感[13-14]?，F(xiàn)今對(duì)發(fā)酵南瓜汁的研究多集中于菌種篩選[15]和工藝優(yōu)化[16]，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化探究較少。

該文選用瑞士乳桿菌[17]作為發(fā)酵菌種，使用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS），測(cè)定南瓜汁發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，探究乳酸菌對(duì)南瓜風(fēng)味感官品質(zhì)產(chǎn)生的影響及其內(nèi)在變化規(guī)律，為生產(chǎn)高品質(zhì)的乳酸菌發(fā)酵南瓜汁的生產(chǎn)提供一定技術(shù)支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜：市售；瑞士乳桿菌菌粉：丹尼斯克公司；NaCl（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS隔水式保溫箱：上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；75 μm CAR/PDMS微萃取頭：美國(guó)Supelco公司；DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司；WH-2微型渦流混合儀：上海瀘西分析儀器廠；yp202n型電子天平：上海精密儀器儀表公司；榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；pHS-25型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 南瓜汁的制備

選擇成熟度合適、無(wú)明顯缺陷的南瓜。將清洗好的南瓜先去皮和去囊處理，后切成小細(xì)塊備用，按照南瓜∶水（質(zhì)量比）=1∶1的比例，將稱(chēng)好的南瓜放入榨汁機(jī)中，加水后榨汁，分裝于干凈的錐形瓶中，密封保存，將南瓜汁快速加熱至90℃，滅菌10 min后，冷卻至室溫備用。

1.3.2 樣品制備

接種瑞士乳桿菌，以106cfu/mL的接種量加入殺菌南瓜汁中[6]，在37℃恒溫條件下靜置發(fā)酵48 h，每隔12 h（0、12、24、36、48 h）準(zhǔn)確移取發(fā)酵液 10 mL 于進(jìn)樣瓶中，各加入1.0 gNaCl，密封后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

pH值采用pHS-25型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可滴定酸度的測(cè)定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；乳桿菌活菌數(shù)的測(cè)定參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；還原糖的測(cè)定參考GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》，采用直接滴定法；每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.4 GC-MS測(cè)定條件

GC條件：TR-5MS彈性石英毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度 250℃，載氣為高純度氦氣（純度 99.999%，流速 1.0 mL/min），分流比 10∶1。升溫程序條件：起始溫度45℃，保留2 min，以5℃/min升到150℃，保持1 min，再以10℃/min升至220℃，保持5 min。

MS條件：電子轟擊電離（EI）離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比35～500。

1.3.5 感官評(píng)定

感官評(píng)價(jià)對(duì)樣品的總體接受度、氣味、口味進(jìn)行評(píng)分，由10名專(zhuān)業(yè)人員對(duì)每項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行打分，最終評(píng)分結(jié)果取平均值，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin9.0軟件處理分析。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定根據(jù)NIST14數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)合相關(guān)資料，選擇匹配度大于85的物質(zhì)作為有效的揮發(fā)性成分[18]，按照峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算各揮發(fā)性化合物的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑞士乳桿菌在南瓜汁中生長(zhǎng)代謝情況

發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁的指標(biāo)變化見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁的指標(biāo)變化Fig.1 The index change of pumpkin juice during fermentation

圖1反映了瑞士乳桿菌在南瓜汁中的生長(zhǎng)情況，發(fā)酵至12 h時(shí)，pH值由最初的6.5下降至4.2，活菌數(shù)由初始的6.0 lgcfu/mL增加至8.4 lgcfu/mL，能夠比較好的適應(yīng)南瓜汁發(fā)酵，pH值的下降和活菌數(shù)的變化呈現(xiàn)一種對(duì)應(yīng)關(guān)系。多糖和葡萄糖是南瓜的主要糖類(lèi)物質(zhì)，瑞士乳桿菌在南瓜汁中代謝增殖，利用南瓜內(nèi)的葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物，使其總酸含量增加、總糖含量下降，影響到糖酸比，表現(xiàn)出酸味。有研究表明南瓜在發(fā)酵過(guò)程中大部分活性多糖成分能被保留[19]。酸度和還原糖含量變化與前面南瓜汁中pH值和活菌數(shù)的變化情況相呼應(yīng)，這與盧嘉懿等[20]研究植物乳桿菌發(fā)酵不同果蔬汁中的結(jié)論相一致。

2.2 瑞士乳桿菌發(fā)酵南瓜汁揮發(fā)性成分變化

通過(guò) GC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì) 0、12、24、36、48 h發(fā)酵南瓜汁的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析，根據(jù)圖譜檢索，發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁的揮發(fā)性成分物質(zhì)鑒定結(jié)果，如表2所示。

表2 發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁揮發(fā)性成分相對(duì)含量Table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

續(xù)表2 發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁揮發(fā)性成分相對(duì)含量Continue table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

續(xù)表2 發(fā)酵過(guò)程中南瓜汁揮發(fā)性成分相對(duì)含量Continue table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

由表2可知，南瓜汁的揮發(fā)性物質(zhì)鑒定出29種化合物，南瓜汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)有己醛、2-甲基丁醛、2，4-二叔丁基苯酚、1-戊醇和1-己醇，含量依次為12.72%、6.61%、6.17%、4.93%和4.04%。羰基化合物是南瓜汁中揮發(fā)性成分含量最高的一類(lèi)，總共占28.7%，相對(duì)含量第二高的是醇類(lèi)物質(zhì)。李瑜[21]在研究酶解后南瓜汁揮發(fā)性成分時(shí)也有類(lèi)似結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，鏈狀的醇、醛、酮、酸、酯等化合物，在低分子量范圍內(nèi)由于揮發(fā)性強(qiáng)，官能團(tuán)的比重大，官能團(tuán)特有的氣味也較強(qiáng)烈。隨著分子碳鏈的增長(zhǎng)，其氣味也由果實(shí)香型→清香型→脂肪臭型的方向變化，而且氣味的持續(xù)性也隨著增強(qiáng)。通常低級(jí)飽和醇和醛C1-C10范圍內(nèi)具有令人愉快的氣味，低級(jí)飽和酮具有特殊香氣，低級(jí)飽和羧酸一般都有不愉快的嗅感，酯類(lèi)物質(zhì)大多具有水果香味，芳香族化合物都有其特殊的嗅感。比如，己醛具有清香和果香味、丁醇和戊醇有醉人的香氣、壬醇有芳香味，丙酮有薄荷味。南瓜汁中己醛、2-甲基丁醛、1-戊醇、1-己醇的含量占28.30%，可能是賦予南瓜清香的主要原因。發(fā)酵南瓜汁揮發(fā)性物質(zhì)的變化見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵南瓜汁揮發(fā)性物質(zhì)的變化Fig.2 The changes of volatile compound in fermented pumpkin juice

由圖2可以看出，經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后，南瓜汁揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量均增加，不同發(fā)酵時(shí)間其各類(lèi)物質(zhì)含量存在差異。由表2知發(fā)酵南瓜汁共有相同成分34種，主要是3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和丙酮。與未發(fā)酵的南瓜汁相比，共有相同成分11種，這說(shuō)明瑞士乳桿菌對(duì)南瓜汁風(fēng)味物質(zhì)的變化是有影響的。

羰基化合物是發(fā)酵南瓜汁的主要風(fēng)味物質(zhì)，含量最高的揮發(fā)性成分是3-羥基-2-丁酮，是南瓜汁的主要特征香氣成分[22]。發(fā)酵過(guò)程中，南瓜汁中酮類(lèi)物質(zhì)占比迅速增加，至發(fā)酵36 h達(dá)最大值，特別是以乳酸菌發(fā)酵所特有的3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和丙酮的增加量最為明顯。與此相對(duì)的是醛類(lèi)占比呈下降趨勢(shì)，特別是己醛占比大量減少，至發(fā)酵36 h后，未再檢測(cè)到該物質(zhì)，但整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，醛類(lèi)的種類(lèi)是相對(duì)增加的。有研究報(bào)告醛、酮的產(chǎn)生與乳酸菌代謝氨基酸和糖類(lèi)有關(guān)[23-24]，其中 3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮具有清香氣味。

相比未發(fā)酵南瓜汁，發(fā)酵后的南瓜汁醇和酚類(lèi)物質(zhì)大幅下降，醇和酚類(lèi)含量的變化可能與菌種以及菌內(nèi)胞內(nèi)酶有關(guān)。發(fā)酵后丁醇和環(huán)丁醇消失不見(jiàn)，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生新的（E）-2-壬烯-1-醇、1，9-壬二醇，新增的不飽和醇往往比飽和醇具有更強(qiáng)烈的風(fēng)味。另外，發(fā)酵后醇的種類(lèi)略有增多，發(fā)酵0 h時(shí)為6種，12 h時(shí)有8種，最后又變?yōu)?種。發(fā)酵12 h之后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醇類(lèi)含量呈上升趨勢(shì)，從2.93%上升至3.95%，而酚類(lèi)物質(zhì)有下降的趨勢(shì)，這可能是瑞士乳桿菌存在某種能分解酚類(lèi)物質(zhì)的酶，使之轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)而減少。

酯類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)影響風(fēng)味物質(zhì)重要化合物，通常酯類(lèi)的生成是由醇和酸發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來(lái)的，也可以由微生物代謝脂類(lèi)物質(zhì)得到，如QIN等[25]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸是梨中多種水果香味的前體物質(zhì)。發(fā)酵南瓜汁酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量均有不同程度的增加，這與發(fā)酵過(guò)程中醇類(lèi)含量下降相對(duì)應(yīng)。0 h時(shí)有2種，占比1.23%；12 h時(shí)有6種，占比6.96%；24 h時(shí)有5種，占比7.97%；36 h時(shí)有5種，占比6.51%；48 h時(shí)有5種，占比5.31%。新增加的酯類(lèi)物質(zhì)主要有丙酸乙酯、辛酸乙酯，盡管某些酯類(lèi)的含量相對(duì)較低，但對(duì)南瓜汁風(fēng)味的改變影響甚大，有時(shí)起關(guān)鍵作用。

發(fā)酵南瓜汁酸類(lèi)含量明顯增多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸遞增。由0 h時(shí)的1.94%，到24 h時(shí)的4.19%，再到36 h時(shí)的5.72%，最后增至48 h時(shí)的8.12%，增加的酸類(lèi)物質(zhì)主要是乙酸，這與發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌大量增殖，不斷消耗葡萄糖，累積代謝生成乙酸有關(guān)。

對(duì)于芳香族化合物來(lái)說(shuō)，苯的氣味不好聞，但在苯環(huán)上引入烴基后，其嗅感就會(huì)發(fā)生變化，如甲基異丙苯具有胡蘿卜氣味，在發(fā)酵南瓜汁中檢測(cè)到甲苯和1，4-二甲苯。發(fā)酵后，南瓜汁中烷烴類(lèi)含量和種類(lèi)均變少，其閾值相對(duì)較高，變化與脂肪代謝相關(guān)。此外，在南瓜汁中還發(fā)現(xiàn)有2-戊基呋喃和β-環(huán)檸檬醛，這可能與南瓜發(fā)生美拉德反應(yīng)和類(lèi)胡蘿卜素降解反應(yīng)有關(guān)。

2.3 瑞士乳桿菌發(fā)酵南瓜汁感官評(píng)定變化

瑞士乳桿菌發(fā)酵南瓜汁感官評(píng)價(jià)見(jiàn)圖3。

圖3 瑞士乳桿菌發(fā)酵南瓜汁感官評(píng)價(jià)Fig.3 Sensory evaluation of pumpkin juice fermented by Lactobacillus helveticus

瑞士乳桿菌消耗南瓜汁中的糖類(lèi)、氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行代謝生成酸類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，使得南瓜汁甜味逐步下降，酸味開(kāi)始增加。發(fā)酵0 h時(shí)，南瓜汁有一股蒸煮味，掩蓋了南瓜的清香味；發(fā)酵12 h時(shí)，瑞士乳桿菌在南瓜汁中大量增殖，南瓜汁中風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵12 h后開(kāi)始迅速累積，酮類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)增加，香味增強(qiáng)，酸度適口，使得南瓜汁在發(fā)酵12 h時(shí)各項(xiàng)評(píng)分最高；發(fā)酵24 h后，由于酸類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)含量過(guò)高，使得南瓜汁整體氣味不協(xié)調(diào)，具有刺激性，令人不愉快，總體可接受度變低。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，從發(fā)酵0、12、24、36、48 h 的南瓜汁中分別鑒定出 29、44、44、40、38種揮發(fā)性物質(zhì)，相同的揮發(fā)性物質(zhì)有11種，經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后，其風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量均增多，顯著影響了南瓜汁風(fēng)味的改變，且發(fā)酵時(shí)間不同，揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量存在差異。未發(fā)酵時(shí)南瓜汁的主要揮發(fā)性成分是己醛、2-甲基丁醛、2，4-二叔丁基苯酚、1-戊醇、1-己醇；發(fā)酵后南瓜汁的主要揮發(fā)性成分是3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、丙酮、乙酸、丙酸乙酯等物質(zhì)。瑞士乳桿菌傾向于將南瓜汁中的醛類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酮類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)。發(fā)酵12 h時(shí)南瓜汁感官評(píng)分最高，發(fā)酵時(shí)間的控制對(duì)南瓜汁風(fēng)味影響較大，這為發(fā)酵南瓜汁飲料工藝優(yōu)化提供一定參考價(jià)值。