β-胡蘿卜素乳液凝膠微球制備與理化特性研究

江連洲 廖培龍 連子騰 田 甜 嚴(yán) 仁 王 歡

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

β-胡蘿卜素是一種脂溶性的天然色素，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是維生素A的前體物質(zhì)，在高溫、光照和氧氣條件下易被氧化和降解[1]，從而喪失生物活性。由于β-胡蘿卜素水溶性差、生物利用度相對(duì)較低，故在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素在人體腸道部位可被有效吸收[2]，但在多變環(huán)境(如pH值、離子強(qiáng)度、溫度等)下乳液變得不穩(wěn)定，β-胡蘿卜素易發(fā)生氧化或降解，大大降低了它的利用率[3]。研究者們采取了不同的方法來(lái)提高β-胡蘿卜素的利用率，如微膠囊化[4]、乳液凝膠[5]等。

靜電層層自組裝技術(shù)通過(guò)建立一個(gè)保護(hù)屏障來(lái)封裝生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。文獻(xiàn)[6-7]研究表明，利用靜電層層自組裝技術(shù)，將多糖吸附在乳液周?chē)纬砂鈱?，能顯著增強(qiáng)乳液對(duì)外界多變環(huán)境的抵抗力，進(jìn)一步提高對(duì)生物活性物質(zhì)的保護(hù)能力。此外，離子凝膠化技術(shù)通過(guò)生物聚合物與離子交聯(lián)作用形成凝膠微球運(yùn)載體系，也能顯著提高生物活性物質(zhì)的利用率，并延緩釋放。

海藻酸鈉(Sodium alginate, SA)是從海藻中提取的一種酸性陰離子多糖，由(1,4)-β-D-甘露酸(M)和α-L-古魯酸(G)殘基組成[8]。殼聚糖(Chitosan, CS)是一種由甲殼素經(jīng)脫乙酰化后形成的陽(yáng)離子多糖[9]。兩種多糖都具有生物相容性、可降解性，被廣泛用于食品、藥品和再生藥物領(lǐng)域。CS與SA可通過(guò)靜電相互作用形成聚合物，利用SA與二價(jià)陽(yáng)離子的較強(qiáng)交聯(lián)能力制備凝膠微球[10]。將靜電層層自組裝技術(shù)與離子凝膠化技術(shù)相結(jié)合，制備凝膠微球，既可以提高對(duì)生物活性物質(zhì)的包埋率，又可以提高生物活性物質(zhì)的生物利用率及緩釋效果。文獻(xiàn)[11]以SA與CS為壁材、以維生素B2為模擬藥物，研究了多層凝膠微球的緩釋能力，結(jié)果表明，凝膠微球具有良好的緩釋效果。文獻(xiàn)[12]成功制備了延緩脂質(zhì)氧化、提高脂類(lèi)氧化穩(wěn)定性的生物聚集顆粒。目前，關(guān)于靜電層層自組裝技術(shù)或離子凝膠化技術(shù)已有深入的研究，但對(duì)兩種技術(shù)相結(jié)合的研究很少。

本文以大豆分離蛋白為水相、以玉米油為油相制備β-胡蘿卜素乳液，利用靜電相互作用將殼聚糖、海藻酸鈉逐層吸附到乳液外層，形成β-胡蘿卜素三層乳液，再通過(guò)離子凝膠化技術(shù)利用Ca2+交聯(lián)制備乳液凝膠微球。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素(純度97%以上)，海藻酸鈉，殼聚糖(脫乙酰度97%以上)，氯化鈣，均來(lái)自于北京源葉生物有限公司；脫脂豆粕、玉米油，黑龍江省九三集團(tuán)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T18型分散機(jī)，德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司；SPCH-10型超高壓納米均質(zhì)機(jī)，英國(guó)安盛聯(lián)合科技有限公司；Delta 320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Mastersizer 3000型粒度儀、ZS 90s型電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；LSM 710型共聚焦顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司股份公司；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；HH-S26型恒溫水浴鍋，金壇市梅香儀器有限公司；THR-16-A型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的制備

(1)大豆分離蛋白

將脫脂豆粕粉碎過(guò)60目篩，按照液料比10 mL/g，加水混合攪拌，同時(shí)用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值到8.5，攪拌2 h，然后在9 000g條件下離心20 min，取上清液，并將清液pH值調(diào)到4.5，放置到4℃冰箱靜置12 h，然后在9 000g下離心20 min，棄去上清液，將得到的大豆分離蛋白水洗3次，并將pH值調(diào)節(jié)到7.0，經(jīng)冷凍干燥后得到大豆分離蛋白粉末，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(2)乳液

將大豆分離蛋白粉末溶于去離子水中(pH值7.0)，磁力攪拌2 h，水化2 h，使其充分溶解，制備2.5%蛋白溶液作為水相；β-胡蘿卜素溶于玉米油中，50℃加熱攪拌1 h并且超聲2 min，使其充分溶解，制備含β-胡蘿卜素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)玉米油作為油相，油水兩相按體積比1∶9混合，8 000 r/min粗均質(zhì)3 min形成粗乳液，在60 MPa下高壓均質(zhì)3次得到納米乳液，放置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(3)β-胡蘿卜素雙層乳液

將所制得的乳液與殼聚糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)以料液比2 g/mL、轉(zhuǎn)速6 000 r/min快速混合1 min，并用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.0，制備β-胡蘿卜素雙層乳液。

(4)β-胡蘿卜素三層乳液

將所制得的海藻酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)與雙層乳液以料液比1 g/mL、轉(zhuǎn)速6 000 r/min快速混合1 min，并調(diào)節(jié)pH值為5.0，形成β-胡蘿卜素三層乳液。

(5)乳液凝膠微球

將形成的β-胡蘿卜素三層乳液通過(guò)5 mL注射器以10 滴/min的速度滴加到5%的CaCl2溶液中，滴加完成后在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)30 min，用濾布過(guò)濾出凝膠微球并用蒸餾水沖洗除去多余的Ca2+離子，室溫(20℃)下干燥，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2平均粒徑及電位分析

(1)平均粒徑測(cè)定

樣品的平均粒徑使用馬爾文激光粒度儀測(cè)定。用蒸餾水作為分散介質(zhì)，取1 mL樣品并稀釋100倍，設(shè)置分析條件為：顆粒(玉米油)折射率1.472，顆粒吸收率0.100，分散劑(水)折射率1.33，激光遮光度10%左右。

(2) ζ-電位測(cè)量

取1 mL樣品用相應(yīng)pH值的蒸餾水稀釋100倍后，用馬爾文ZS 90s型電位分析儀測(cè)定ζ-電位，測(cè)試參數(shù)為：溫度25℃，折光率1.333，激光波長(zhǎng)635 nm，外部光纖角18.9°，散射角14.063 6°。

1.3.3濁度測(cè)定

通過(guò)濁度測(cè)定來(lái)獲取乳液吸附情況，參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改。將制備的乳液、β-胡蘿卜素雙層乳液、β-胡蘿卜素三層乳液靜置24 h后，用pH值為5.0的蒸餾水稀釋100倍，以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.4界面蛋白吸附量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]的測(cè)定方法并稍作改動(dòng)。取50 mL待測(cè)樣品于離心管中，室溫下離心(11 000g，30 min)，用注射器小心吸取底部清液于另一離心管中，再次離心(11 000g，30 min)，收集下層清液，用Bradford法[15]測(cè)定清液中的蛋白質(zhì)量濃度Ci，界面蛋白吸附量計(jì)算公式為

C=C0-Ci

(1)

式中C0——初始乳液中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

C——界面蛋白吸附量，mg/mL

1.3.5乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]方法略作修改。取50 μL樣品加入4 950 μL 0.1 g/L的SDS(十二烷基硫酸鈉)稀釋?zhuān)?00 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0，靜置30 min后，再次測(cè)定吸光度A30，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為

(2)

(3)

式中N——稀釋倍數(shù)

ρ——混合液形成前質(zhì)量濃度，取0.025 g/mL

φ——乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，取10%

EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

1.3.6掃描電鏡觀察

參照文獻(xiàn)[17]的方法，在觀察前，將β-胡蘿卜素雙層乳液和凝膠微球冷凍干燥粉碎，然后表面噴金。用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表觀形貌。

1.3.7紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[17]的方法，海藻酸鈉、殼聚糖和冷凍干燥后的乳液凝膠微球研磨成粉末，紅外光譜記錄從500 cm-1到4 000 cm-1，每個(gè)光譜以4 cm-1分辨率平均進(jìn)行64次連續(xù)掃描。

1.3.8包埋率測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg β-胡蘿卜素溶于5 mL正己烷，配置成0.1 mg/mL的β-胡蘿卜素母液，然用正己烷分別稀釋成一定濃度梯度的β-胡蘿卜素溶液，以正己烷為空白對(duì)照，于450 nm處測(cè)量吸光度，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

參照文獻(xiàn)[18]并作修改，分別取β-胡蘿卜素雙層乳液、β-胡蘿卜素三層乳液1 mL加入4 mL正己烷渦旋1 min后，5 000 r/min離心3 min，取上層液，以正己烷為空白對(duì)照，在450 nm處測(cè)定其吸光度A1。將萃取后的脂質(zhì)體懸浮液與3 mL乙醇混合，超聲破乳10 min后，加入4 mL正己烷，5 000 r/min離心3 min，取上層液，以正己烷為空白對(duì)照，在450 nm處測(cè)定其吸光度度A2，將A1和A2代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算游離β-胡蘿卜素含量和包埋β-胡蘿卜素含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3組平行，β-胡蘿卜素包埋率計(jì)算公式為

(4)

式中B0——游離β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度

Bi——包埋β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度

1.3.9體外釋放及釋放動(dòng)力學(xué)研究

參照文獻(xiàn)[17]的方法并稍作修改。分別取2.0 g凝膠微球置于離心管中加入正己烷30 mL。將離心管在37℃下恒溫水浴，每30 min對(duì)樣品進(jìn)行取樣，每次取0.1 mL樣品，然后將相同量正己烷立即加入離心管中，以保持總體積不變。取0.1 mL樣品與4.9 mL正己烷混合，在450 nm處測(cè)定吸光度。

參照文獻(xiàn)[19-20]的方法并稍作修改，零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和基于Fickian擴(kuò)散的Higuchi模型分別為

Qt=Q0+K0t

(5)

(6)

Qt=Q0+KHt1/2

(7)

式中Qt——時(shí)間t中釋放的β-胡蘿卜素的累積量

Q0——溶液中β-胡蘿卜素的初始量

K0——零級(jí)釋放常數(shù)

K1——一級(jí)釋放常數(shù)

KH——Higuchi常數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖表和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙層乳液粒徑、電位及聚集狀態(tài)的影響

通過(guò)平均粒徑、ζ-電位、PDI(分散指數(shù))及濁度表征雙層乳液的聚集特征。如圖1a(圖中相同圖例、不同字母表示差異顯著，下同)所示，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～2%時(shí)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，雙層乳液的平均粒徑及PDI都呈上升的趨勢(shì)，且在2.0%時(shí)平均粒徑最大，這可能是由于隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，殼聚糖分子被吸附到多個(gè)乳液液滴表面而引起液滴聚集使粒徑變大[21-22]，形成的雙層乳液粒度分布不均，PDI也變大。與此相反，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.5%的平均粒徑及PDI小于2.0%的雙層乳液，結(jié)合圖1b可知，這可能是由于殼聚糖將乳液液滴完全包裹，增加了液滴之間的空間排斥和靜電排斥[13]，從而降低了雙層乳液液滴的平均粒徑。

如圖1b所示，未添加殼聚糖的乳液表面呈電中性(-2.26 mV)，這是由于在pH值為5.0時(shí)未加入殼聚糖的乳液接近大豆分離蛋白的等電點(diǎn)(pI值為4.5)。加入殼聚糖后，其表面帶有正電荷，這可能是由于靜電和疏水共同作用使殼聚糖吸附到乳液表面[23]。雙層乳液的表面電荷都呈正電荷，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)2.0%時(shí)雙層乳液電位接近飽和且在2.0%時(shí)電位絕對(duì)值最大(56.21 mV)。雙層乳液的濁度明顯低于未加入殼聚糖乳液的濁度，這可能是由于pH值5.0時(shí)未添加殼聚糖的乳液為電中性，使其不穩(wěn)定而導(dǎo)致濁度較大，加入的殼聚糖形成雙層乳液，增強(qiáng)了液滴間的靜電排斥作用，穩(wěn)定性增強(qiáng)，使得雙層乳液濁度下降[24]。因此，在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，乳液對(duì)殼聚糖的吸附效果最佳。

2.2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙層乳液穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，與未加殼聚糖的乳液相比，0.5%～2.0%樣品中乳化活性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，加入殼聚糖后乳化活性指數(shù)降低，這可能是因?yàn)榧尤霘ぞ厶呛蟠龠M(jìn)了油滴分裂成更小的液滴，使乳化活性降低[25]。在2.0%時(shí)乳化穩(wěn)定性指數(shù)最大，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%，所形成的乳液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，乳化穩(wěn)定性指數(shù)最小，最不穩(wěn)定。因此，在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)所形成的雙層乳液穩(wěn)定性最佳。原因可能是殼聚糖在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，會(huì)吸附在雙層乳液液滴周?chē)谷榛€(wěn)定性增加[25]。隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在乳液周?chē)采w的殼聚糖分子趨于飽和[13,26]，存在于乳液體系中過(guò)量的殼聚糖會(huì)破壞雙層乳液的平衡，引起損耗絮凝，使雙層乳液穩(wěn)定性降低，這與文獻(xiàn)[27]結(jié)果一致。

2.3 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)界面蛋白吸附量及β-胡蘿卜素包埋率的影響

通過(guò)對(duì)界面蛋白吸附量和β-胡蘿卜素包埋率的測(cè)定，來(lái)表征殼聚糖對(duì)乳液的包埋情況。由圖3可知，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1.5%時(shí)，雙層乳液的界面蛋白吸附量隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加；殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)2.0%時(shí)，界面蛋白吸附量趨于穩(wěn)定(P>0.05)。這是由于隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，殼聚糖與乳液的靜電相互作用逐漸達(dá)到飽和并趨于穩(wěn)定[28-29]，殼聚糖分布在乳液周?chē)⑼耆采w在乳液表面，因此界面蛋白吸附量先升高后平穩(wěn)。

由圖3可知，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1.5%時(shí)，β-胡蘿卜素包埋率無(wú)顯著變化(P>0.05)，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%～2.0%時(shí)，隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，β-胡蘿卜素包埋率顯著升高，這可能是隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液液滴逐漸被殼聚糖包裹，吸附在外側(cè)的殼聚糖層逐漸變得緊密，對(duì)β-胡蘿卜素的包埋作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，過(guò)量的殼聚糖存在于乳液體系中會(huì)導(dǎo)致殼聚糖分子間的聚解和解吸[30]，減弱對(duì)乳液的包封效果，因此殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%時(shí)，β-胡蘿卜素的包埋率降低。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，所獲得的雙層乳液對(duì)β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(64.82±0.31)%。

2.4 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)三層乳液粒徑、ζ-電位及聚集狀態(tài)的影響

在確定了形成雙層乳液的最佳殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%后，向其中加入陰離子多糖海藻酸鈉形成三層乳液，如圖4a所示，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，三層乳液的平均粒徑增大并趨于穩(wěn)定，且當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)2.0%，平均粒徑的降低無(wú)顯著性差異(P>0.05)，原因可能是在靜電相互作用下，帶負(fù)電的海藻酸鈉與帶正電的雙層乳液產(chǎn)生吸附且逐漸達(dá)到飽和，三層乳液的粒徑變大并趨于穩(wěn)定。與圖1a相比，三層乳液的整體粒徑大于雙層乳液，這表明加入的海藻酸鈉在一定程度上吸附在雙層乳液上[21]，使其粒徑增大。

如圖4b所示，加入海藻酸鈉形成的三層乳液表面帶負(fù)電荷，這表明海藻酸鈉吸附在雙層乳液表面，使其表面電荷由正電變?yōu)樨?fù)電。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，三層乳液表面電荷呈現(xiàn)急速增加并趨于穩(wěn)定，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于靜電相互吸引，海藻酸鈉快速地吸附在雙層乳液表面[31]，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，形成的海藻酸鈉吸附層越厚，其表面電荷越強(qiáng)；當(dāng)覆蓋在雙層乳液表面的海藻酸鈉達(dá)到飽和后，三層乳液之間的斥力增大就會(huì)造成絮凝[32]，使海藻酸鈉層厚度降低，三層乳液粒徑下降。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%形成的三層乳液最佳。

2.5 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)β-胡蘿卜素包埋率的影響

通過(guò)對(duì)β-胡蘿卜素包埋率的測(cè)定，能更好地反映出海藻酸鈉對(duì)雙層乳液包覆性能。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，β-胡蘿卜素的包埋率顯著提高(P<0.05)。當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%時(shí)，β-胡蘿卜素的包埋率趨于穩(wěn)定，且在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.0%時(shí)對(duì)β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(86.75±2.00)%，這一現(xiàn)象表明海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，由于靜電相互作用，海藻酸鈉吸附在雙層乳液表面，逐漸形成包覆層，三層乳液的粒徑變大，且隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，海藻酸鈉的包覆層逐漸緊密；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)一定值時(shí)，雙層乳液表面電荷被海藻酸鈉中和[13]，進(jìn)而阻止了多余的海藻酸鈉吸附在上面，因此對(duì)β-胡蘿卜素的包埋率趨于穩(wěn)定。

2.6 紅外光譜分析

以粒徑、ζ-電位、β-胡蘿卜素包埋率等指標(biāo)篩選出海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為1.5%～2.5%，并將制備的三層乳液滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的CaCl2溶液形成凝膠微球，用紅外光譜測(cè)定了海藻酸鈉、殼聚糖及凝膠微球的吸收峰，進(jìn)一步研究了海藻酸鈉和殼聚糖之間的相互作用(圖5)。在海藻酸鈉(SA)的紅外光譜圖中，3 417.56 cm-1是O—H鍵的拉伸振動(dòng)，在2 925.49 cm-1和2 849.32 cm-1處，是脂肪族C—H的拉伸振動(dòng)的結(jié)果[33]。在1 416.98 cm-1和1 030.78 cm-1處觀測(cè)到的峰分別是COO—的對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)、C—O的伸縮振動(dòng)[34]。

雙層乳液中具有殼聚糖常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)(1 258.5 cm-1和1 064 cm-1)。在2 926 cm-1和2 855 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰是β-胡蘿卜素—CH2振動(dòng)引起的。這表明β-胡蘿卜素存在于雙層乳液中。當(dāng)乳液凝膠微球形成時(shí)，光譜中的峰變化顯著，殼聚糖在1 597.68 cm-1處的吸收峰消失，這可能是由乳液表面負(fù)電荷與殼聚糖—NH3+發(fā)生靜電相互作用引起的，表明殼聚糖吸附在乳液表面。殼聚糖的O—H和N—H在3 423.42 cm-1處的拉伸振動(dòng)向3 420.15 cm-1輕微移動(dòng)，海藻酸鈉的羧基峰從1 609.02 cm-1移至1 640.76 cm-1，變得更強(qiáng)，這表明海藻酸鈉與殼聚糖之間發(fā)生了聚電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)[38]。2 926 cm-1和2 855 cm-1這兩處吸收峰是β-胡蘿卜素內(nèi)部疏水性基團(tuán)CH2的振動(dòng)引起的，兩處峰未發(fā)生明顯變化，這表明凝膠微球的形成并未對(duì)β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.7 乳液凝膠微球表觀形貌觀察

如圖6所示，干燥的凝膠微球呈球形或近球形(圖6a)，在掃描電鏡下觀察，凍干的乳液凝膠微球皺縮(圖6b)，隨海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加無(wú)明顯的變化。對(duì)凝膠微球表面觀察發(fā)現(xiàn)，雙層乳液表面結(jié)構(gòu)松散(圖6c)，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，凝膠微球表面不平整(圖6d)，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凝膠微球結(jié)構(gòu)變得緊實(shí)且表面趨向平滑(圖6e、6f)，這表明隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凝膠微球的結(jié)構(gòu)變得更加緊密，對(duì)β-胡蘿卜素能夠?qū)崿F(xiàn)更好的包封。

2.8 β-胡蘿卜素乳液凝膠微球的體外釋放

以海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、2.0%、2.5%形成的三層乳液制備乳液凝膠微球?yàn)閷?duì)象，研究其在模擬介質(zhì)中的積累釋放情況。由圖7可知，在30～60 min，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉對(duì)β-胡蘿卜素釋放方面的影響并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，在1～2 h內(nèi)β-胡蘿卜素均呈爆發(fā)性釋放，釋放出75%左右的β-胡蘿卜素，這可能是由于凝膠微球在初始階段開(kāi)始溶脹，導(dǎo)致β-胡蘿卜素在初始階段釋放率較高，文獻(xiàn)[39]的體外釋放實(shí)驗(yàn)同樣觀察到凝膠微球在最初階段呈爆炸式釋放。在3 h后β-胡蘿卜素釋放率降低且三者都進(jìn)入緩慢和持續(xù)性釋放階段；結(jié)果表明，運(yùn)載β-胡蘿卜素凝膠微球具有良好的緩釋效果。

表1從零級(jí)、一級(jí)和Higuchi動(dòng)力學(xué)模型[19-20]中確定β-胡蘿卜素的釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)?；贔ickian擴(kuò)散機(jī)制的Higuchi模型是最合適來(lái)表示β-胡蘿卜素從凝膠微球的釋放行為的模型，該模型的決定系數(shù)R2高于其他動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)果表明β-胡蘿卜素在凝膠微球中的釋放主要受自身擴(kuò)散行為的影響。

表1 釋放動(dòng)力學(xué)模型

3 結(jié)論

(1)加入殼聚糖形成的雙層乳液的平均粒徑顯著增大，電位變?yōu)檎担瑲ぞ厶桥c乳液相互吸附。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，雙層乳液的乳化活性及乳化穩(wěn)定性最佳，β-胡蘿卜素的包埋率最高，為(64.82±0.31)%；加入海藻酸鈉形成的三層乳液平均粒徑明顯增大，表面電位變?yōu)樨?fù)值，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%形成的三層乳液對(duì)β-胡蘿卜素的包埋率顯著提高，為(86.75±2.00)%。

(2)制備得到的β-胡蘿卜素凝膠微球組分間存在靜電相互作用。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠微球變得致密，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，β-胡蘿卜素從凝膠微球釋放行為遵循Fickian擴(kuò)散機(jī)制的Higuchi模型，在3 h后進(jìn)入緩慢和持續(xù)性釋放階段，β-胡蘿卜素凝膠微球運(yùn)載體系具有很好的包封和緩釋效果。

(3)由殼聚糖、海藻酸鈉、乳液構(gòu)建的凝膠微球可實(shí)現(xiàn)對(duì)β-胡蘿卜素更好的包埋及緩釋。凝膠微球在生物活性物質(zhì)運(yùn)載及緩釋領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。