劍麻抗病基因Hevein的導(dǎo)入研究

陳河龍 楊峰 高建明 張世清 鄭金龍 譚施北 黃興 習(xí)金根 易克賢

摘? 要：劍麻是我國乃至世界熱帶地區(qū)最重要的麻類經(jīng)濟(jì)作物，用途廣泛，綜合利用價(jià)值高。而斑馬紋病是劍麻生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重制約著劍麻產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將抗病的Hevein基因?qū)?，獲得37株劍麻抗性植株，陽性率約為24.7%。經(jīng)PCR檢測，證明外源基因Hevein已成功整合到該劍麻植株的基因組中。并通過體外抑菌和抗病性檢測，說明轉(zhuǎn)基因劍麻植株中表達(dá)出一定的活性，而且還提高了對劍麻斑馬紋病的抗性。研究結(jié)果為培育抗病高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因劍麻新品種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：劍麻;斑馬紋病;轉(zhuǎn)基因;Hevein;抗病

中圖分類號：S563.8????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Introduction of Disease Resistance Genes Hevein in Sisal

CHEN Helong1，2， YANG Feng3*， GAO Jianming2， ZHANG Shiqing2， ZHENG Jinlong1， TAN Shibei1， HUANG Xing1 ， XI jingen2 ， YI Kexian1**

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rice and Sorghum Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Deyang， Sichuan 618000， China

Abstract： Sisal is the most important fibre crop in the south subtropical and tropical regions in China and the world. It possesses broad usages and high integrated values. Unfortunately， zebra disease， caused by Phytophthora nicotianae， is one of the most common and serious diseases of sisal， which seriously restricts the sustainable and stable development of the industry. In this study， by introducing the disease-resistant Hevein gene by Agrobatorium -mediated transformation， 37 resistant sisal plants were obtained with a positive rate of 24.7%. PCR showed that Hevein was successfully integrated into the genome of sisal plant. In addition， through in vitro bacteriostasis and disease resistance tests， it was shown that the transgenic sisal plants showed some activity， and the resistance to zebra striatosis was also improved. The results would lay a solid foundation for the breeding of new transgenic sisal varieties with high yield and resistance to disease.

Keywords： sisal; zebra disease; transgene; Hevein; disease-resistant

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.026

劍麻是熱帶地區(qū)最重要的纖維作物，用途廣泛，纖維具有堅(jiān)韌耐磨、質(zhì)地剛?cè)?、富有彈性、低溫下不會硬化脆斷、不霉變、耐腐蝕、無毒、無過敏、無污染、防靜電等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于紡織、航運(yùn)、電梯、工礦、物流運(yùn)輸、新型材料等多種領(lǐng)域，而劍麻渣、麻渣水等副產(chǎn)物則作為生物質(zhì)資源和生物制藥原料，應(yīng)用前景廣闊[1]。此外，在全球性劍麻種植規(guī)模縮減的背景下，劍麻原料及其制品的需求呈增長趨勢，因而市場前景可期。然而，我國劍麻主栽品種單一，60多年來僅有品種‘H.11648，品種單一的種植風(fēng)險(xiǎn)逐漸凸顯出來，早衰退化并面臨新一輪劍麻病蟲害的威脅，每年因病蟲害死亡的劍麻面積達(dá)千畝，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因此培育抗病品種成為生產(chǎn)上的當(dāng)務(wù)之急，而斑馬紋病是目前劍麻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，該病由煙草疫霉菌引起，可造成植麻區(qū)的麻田早期發(fā)生大量缺株，產(chǎn)量出現(xiàn)大幅降低甚至絕收，嚴(yán)重制約著劍麻產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，作物轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為劍麻育種開辟了新的途徑。通過外源抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化可克服劍麻種間雜交的不育性，顯著縮短育種周期，提高育種效率。同時(shí)與其他作物相比，劍麻作為纖維作物在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)上獨(dú)具優(yōu)勢，在轉(zhuǎn)基因安全性方面更易控制和被人們所接受。Hevein基因來源于橡膠樹，編碼一類能結(jié)合幾丁質(zhì)的小分子蛋白，編碼蛋白不但在體外表現(xiàn)出廣譜的抗菌性，在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)也表現(xiàn)出很好的廣譜抗菌性，不僅能抗細(xì)菌、真菌，對煙草疫霉等卵菌類也表現(xiàn)出很好的抗性[2-5]。因此，本研究將外源抗病Hevein基因?qū)雱β橹?，?chuàng)制劍麻新種質(zhì)，縮短育種周期，提高育種效率，為培育抗病高產(chǎn)劍麻新品種奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

大腸桿菌菌株DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，質(zhì)粒載體pCAMBIA3301和含有目的基因片段的載體pUC57-Hevein均由本實(shí)驗(yàn)室保存，抑菌試驗(yàn)中接種用的劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉由本實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定并保存。常用培養(yǎng)基配制如下：

LB培養(yǎng)基：氯化鈉（10 g/L）+蛋白胨（10 g/L）+酵母提取物（5 g/L）;若是固體培養(yǎng)基加瓊脂粉（15 g/L），pH 7.0。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

YEP培養(yǎng)基：氯化鈉（5 g/L）+蛋白胨（10g/L）+酵母提取物（10 g/L）;若是固體培養(yǎng)基加瓊脂粉（15 g/L），pH 7.0。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（300 g/L）+葡萄糖（20 g/L）+瓊脂粉（15 g/L），自然pH。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：SH + 6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）+2，4-D（0.1 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6.5 g/L），pH 5.8。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

愈傷繼代培養(yǎng)基：SH+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6.5 g/L），pH 5.8。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

出芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基：SH+6-BA

（1.5 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6.5 g/L），pH 5.8。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：SH+IAA（0.1 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6.5 g/L），pH 5.8。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

轉(zhuǎn)化用基本培養(yǎng)基：SH + 6-BA（2.0 mg/L）+ NAA（0.1 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6.5 g/L），pH 5.8。于121 ℃，高壓滅菌20 min。

1.2? 方法

1.2.1? 植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Hevein的構(gòu)建? pCAMBIA3301和pUC57-Hevein質(zhì)粒的提取與純化按試劑盒說明書進(jìn)行操作，即分別用Hind III和SacⅠ進(jìn)行雙酶切，并通過試劑盒（OMEGA）進(jìn)行膠回收，連接后轉(zhuǎn)化DH5α，涂板后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。以P1、P2為引物，進(jìn)行目的基因Hevein的PCR擴(kuò)增，鑒定篩選重組子，通過驗(yàn)證即可完成構(gòu)建（圖1）。P1： 5-CTGCAGATG AAATACTGTACTATGTTTAT-3 （29 bp）;P2： 5- TCTAGATCAGTTGGCACCGC-3 （20 bp）。

1.2.2? 劍麻對bar基因篩選劑PPT的敏感性? 經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)，脫菌抗生素Timentin濃度為200 mg/L時(shí)的最佳使用組合：劍麻葉片在農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.8、侵染時(shí)間為15 min、As濃度為200 μmol/L、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d，劍麻愈傷組織在OD600=0.6、侵染時(shí)間為10 min、As濃度為200 μmol/L、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase， GUS）瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到最高。采用bar基因篩選劑中膦絲菌素（phosphinothricin， PPT）作為后續(xù)試驗(yàn)的篩選劑，為確定其使用濃度，首先將劍麻葉片及愈傷組織切小在預(yù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)入含不同濃度PPT（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)， 每處理接種30塊葉片及愈傷組織，設(shè)置3次重復(fù)。30 d后觀察各處理的外植體變化情況，調(diào)查統(tǒng)計(jì)外植體的分化率和死亡率。

1.2.3? Hevein基因轉(zhuǎn)化劍麻? 按照優(yōu)化后的劍麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，用已得到的農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-Hevein菌液侵染劍麻幼葉及愈傷組織，得到分化出的劍麻小苗。當(dāng)分化出的小苗長到1～2 cm高時(shí)，在出芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基中添加全致死的PPT量進(jìn)行3次篩選，每次篩選時(shí)間間隔15 d。

1.2.4? 劍麻轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測? PCR檢測是一種非常簡單、快速和直接的轉(zhuǎn)基因苗檢測方法，本試驗(yàn)用此方法對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)陽性轉(zhuǎn)化率。

1.2.5? 轉(zhuǎn)基因劍麻植株對斑馬紋病的抗病性鑒定? （1）轉(zhuǎn)基因劍麻植株葉片粗蛋白對斑馬紋病原疫霉菌的抑制試驗(yàn)。取1個(gè)錐形瓶的PDA固體培養(yǎng)基溶解，待降溫后（手能握住同時(shí)未凝固），加入250 μL轉(zhuǎn)Hevein基因劍麻植株葉片粗蛋白液，然后迅速搖動錐形瓶使其分散，并在培養(yǎng)皿上倒一薄層，待其凝固后，挑取已活化培養(yǎng)好的斑馬紋病原疫霉菌菌絲轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中心。以同樣操作方法，分別加入250 μL未轉(zhuǎn)基因劍麻植株葉片粗蛋白液和250 μL已配置好的10 mg/L烯酰嗎啉，

前者作為陰性對照，后者作為陽性對照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，觀察劍麻斑馬紋病原菌煙草疫霉的生長情況，并測量菌圈直徑的大小，挑取菌圈邊緣菌絲，于電鏡下觀察其形態(tài)的變化。

（2）轉(zhuǎn)基因劍麻植株人工接種斑馬紋病菌的抗病性檢測。用滅菌打孔器在已活化培養(yǎng)的斑馬紋病原疫霉菌培養(yǎng)基上，從中心向外取菌餅。用小型注射器以菌餅大小為模板，在劍麻葉片上集中打上小孔，每片葉打3處小孔，再將帶有菌絲的菌餅緊貼在打有小孔的葉片上，立即用濕潤的紙巾將其迅速包起來，于25 ℃溫室放置2 d，期間每4 h澆1次水，保持劍麻的葉片處于一定的濕度中。2 d后，去掉紙巾，觀測記錄劍麻葉片發(fā)病情況。每個(gè)處理重復(fù)3次。

按照Chao [7]的分級標(biāo)準(zhǔn)（表1），根據(jù)最終累計(jì)葉片感染率確定劍麻株系的抗性等級和抗病反應(yīng)型，累計(jì)發(fā)病葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Hevein的構(gòu)建

質(zhì)粒pCAMBIA3301和質(zhì)粒pUC57-Hevein分別用Hind III和Sac I的雙酶切，分別回收大片段和小片段，連接構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- Hevein。對構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- Hevein進(jìn)行Hind III和Sac I的雙酶切鑒定（圖2）。由圖可知，同對照的質(zhì)粒pCAMBIA3301（CK）相比較，表達(dá)載體pCAMBIA3301-Hevein（P）酶切獲得1條1000 bp左右的條帶，與預(yù)期的1070 bp相符，表明包含35S啟動子、Hevein基因和Nos終止子的片段已成功連接到載體pCAMBIA3301上，成功獲得Hevein基因的植物表達(dá)載體，將其命名為pCAMBIA3301-Hevein。然后利用“凍融法”將植物表達(dá)載體pCAMBIA3301- Hevein導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中（圖3），隨機(jī)挑選5個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行目的基因Hevein的PCR鑒定，均能擴(kuò)增得到與目的片段大小（276 bp）相符的片段（圖4），表明植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Hevein已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。

2.2? 劍麻對bar基因篩選劑PPT的敏感性

采用bar基因篩選劑PPT作為后續(xù)試驗(yàn)的篩選劑，調(diào)查統(tǒng)計(jì)外植體的分化率和死亡率，其中劍麻葉片在PPT濃度達(dá)到2.5 mg/L時(shí)出現(xiàn)全致死，而劍麻愈傷組織在PPT濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)了全致死（表2，圖5）。

2.3? 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的劍麻轉(zhuǎn)化

根據(jù)劍麻遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化體系結(jié)果，作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)Hevein基因轉(zhuǎn)入劍麻愈傷組織的實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)。當(dāng)分化出的小苗長到約1 cm高時(shí)，往分化增殖培養(yǎng)基中添加PPT（1.0 mg/L）進(jìn)行第一次篩選，篩選的效果非常明顯（圖6A），經(jīng)統(tǒng)計(jì)，幼苗存活率約25%。此時(shí)幼苗比較弱，對篩選壓力很敏感，有一些轉(zhuǎn)化苗也會抵擋不住選擇壓力而被誤殺，因此第一次篩選的效果會很明顯。15 d后，挑選生長良好的小苗分成單株接種到含1.3 mg/L PPT的分化增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次篩選，幼苗存活率約65%（圖6B）。15 d后，再一次挑選生長良好的小苗接種到含1.5 mg/L PPT的分化增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第三次篩選，幼苗存活率約95%（圖6C）。然后對抗性苗進(jìn)行組培快繁（圖7）。當(dāng)抗性苗在生根培養(yǎng)基上長到超過8 cm時(shí)（如圖8A），將根系發(fā)達(dá)、葉色濃綠的抗性苗組培瓶打開，進(jìn)行室內(nèi)煉苗，待植株長出大量的新根，將小苗移植于配置好的混合沙土中進(jìn)行煉苗（圖8B）。

2.4? 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

以CTAB法小量提取的劍麻總DNA為模板，通過引物P1和P2對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行目的基因Hevein（GenBank：L41873.1）的PCR擴(kuò)增檢測。其中用pCAMBIA3301-Hevein質(zhì)粒作為陽性對照，用未轉(zhuǎn)化劍麻的DNA作為陰性對照。共提取了37株Hevein基因轉(zhuǎn)化植株的DNA，其中有10株能擴(kuò)增到與預(yù)期片段大小一致的條帶（276 bp），部分電泳結(jié)果如圖9，初步證明Hevein基因已經(jīng)整合到了劍麻基因組中。

2.5? 轉(zhuǎn)基因劍麻植株對斑馬紋病的抗病性鑒定

2.5.1? 轉(zhuǎn)基因劍麻植株葉片粗蛋白的體外抑菌檢測? 用含有10 mg/L烯酰嗎啉的PDA培養(yǎng)基接種劍麻斑馬紋病原菌煙草疫霉作為陽性對照[8]，用未轉(zhuǎn)基因劍麻葉片提取的粗蛋白作為陰性對照，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Hevein基因劍麻植株葉片提取的粗蛋白對劍麻斑馬紋病原菌煙草疫霉均有一定的抑菌作用（圖10）。再分別挑取菌落邊緣的菌絲經(jīng)行電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)從烯酰嗎啉和轉(zhuǎn)基因劍麻葉片粗蛋白處理的菌絲中均有出現(xiàn)癟平或斷裂的情況，而未轉(zhuǎn)基因的對照組卻完好無損，且菌絲數(shù)量和密度明顯多于其余2個(gè)處理（圖11）。說明轉(zhuǎn)Hevein基因劍麻葉片提取的粗蛋白有一定的抑菌作用。同時(shí)在抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，7株轉(zhuǎn)基因劍麻植株中有5株具有較強(qiáng)的抑制煙草疫霉的作用。

2.5.2? 轉(zhuǎn)基因劍麻植株人工接種斑馬紋病菌的抗病性檢測? 將葉片粗蛋白對斑馬紋病菌有強(qiáng)烈抑制作用的5株劍麻轉(zhuǎn)基因株系（T4、T5、T6、T8和T9）進(jìn)行人工接種斑馬紋病菌，同樣方法接種未轉(zhuǎn)基因的劍麻植株作為對照，7 d后統(tǒng)計(jì)其發(fā)病情況（圖12），計(jì)算發(fā)病率。按照Chao [7]的分級標(biāo)準(zhǔn)方法，根據(jù)最終累計(jì)葉感染率確定劍麻株系的抗病反應(yīng)型和抗性等級。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：T8和T6表現(xiàn)為抗病（R），抗病等級分別為2和3;T5和T9表現(xiàn)為中抗（I），抗病等級均為5級;T4表現(xiàn)為感?。⊿），抗病等級為7;非轉(zhuǎn)化植株CK表現(xiàn)為高感?。℉S），抗病等級為8。

3? 討論

劍麻愈傷組織的分化能力非常強(qiáng)，因此劍麻愈傷組織在農(nóng)桿菌浸染后，很容易出現(xiàn)假陽性和

嵌合體植株，所以需要對分化出來的幼苗進(jìn)行篩選，盡可能地剔除假陽性和嵌合體植株。劍麻對PPT敏感，臨界致死濃度較低（2 mg/L），因此PPT可用于劍麻轉(zhuǎn)化植株的篩選。bar基因是抗除草劑基因，將其導(dǎo)入劍麻后，劍麻轉(zhuǎn)化植株對PPT具有抗性。

當(dāng)幼苗生長至1～2 cm時(shí)，此時(shí)苗較弱，對篩選壓力很敏感，因此篩選效果明顯，但有些轉(zhuǎn)化苗也會抵擋不住選擇壓力而被誤殺，且過早地施加選擇壓力不利于苗的后期生長。當(dāng)幼苗已分化成單株、長至4 cm以上，此時(shí)苗比較健壯，不易造成誤殺，但其對篩選物質(zhì)的抗性能力也有所增強(qiáng)，因此需要提高PPT的篩選濃度。本研究進(jìn)行連續(xù)多次篩選，篩選過程中PPT的濃度遞增，盡量剔除假陽性和嵌合體植株。第一次篩選（PPT 1.0 mg/L），其幼苗存活率約25%，第二次篩選（PPT 1.3 mg/L）幼苗存活率約65%，第三次篩選（PPT 1.5 mg/L）幼苗存活率約95%。經(jīng)過連續(xù)3次PPT篩選獲得的抗性幼苗進(jìn)行PCR檢測，陽性植株的所占比例可達(dá)到70%。表明進(jìn)行連續(xù)多次篩選，且篩選過程中PPT的濃度遞增，可剔除大部分假陽性和嵌合體植株。

目前，劍麻材料的斑馬紋病抗性鑒定的評價(jià)指標(biāo)通常為累計(jì)叢感率（IPmax）、累計(jì)葉感率（Ymax）和病害進(jìn)展曲線下的面積（AUDPC）。累計(jì)叢感率是在整個(gè)種植期中，累計(jì)發(fā)病叢數(shù)占總叢數(shù)的百分?jǐn)?shù)。累計(jì)叢感率主要是反映劍麻材料抗初浸染的能力，不反映劍麻材料抗再浸染的能力，不包含病原菌對孽芽和側(cè)芽的浸染情況。由于再浸染是斑馬紋病造成危害不可缺少的部分。因此累計(jì)叢感率作為評價(jià)指標(biāo)存在一定的缺陷。病害進(jìn)展曲線下的面積是指一定時(shí)間內(nèi)葉感染率與時(shí)間的乘積之和，涉及病害在整個(gè)作物季中發(fā)生的全過程，病害最短潛伏期（LP）、發(fā)病持續(xù)期（SDD）以及從發(fā)病開始到病害結(jié)束整個(gè)過程中葉感染率的動態(tài)大小都對它有影響，且其計(jì)算較為復(fù)雜，因此病害進(jìn)展曲線下的面積作為評價(jià)指標(biāo)應(yīng)用得不多。累計(jì)葉感率是在整個(gè)種植期中，累計(jì)發(fā)病葉數(shù)占總?cè)~數(shù)的百分?jǐn)?shù)，是病害在整個(gè)種植期中的累計(jì)量，統(tǒng)計(jì)比較全面，較為常用。因此，本研究用累計(jì)葉感率作為劍麻轉(zhuǎn)基因株系的斑馬紋病抗性鑒定的評價(jià)指標(biāo)是合理可靠的。

此外，劍麻存在基因轉(zhuǎn)化率較低，基因型依賴性強(qiáng)，再生細(xì)胞部位與轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞部位不一致等亟待解決的問題。只有解決這些問題才能使基因工程技術(shù)在劍麻品種改良上得到廣泛應(yīng)用。為此，本研究進(jìn)行了劍麻抗除草劑基因轉(zhuǎn)移及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究，旨在建立高效、穩(wěn)定的劍麻遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，獲得抗草丁膦的轉(zhuǎn)基因劍麻，為改良劍麻對草丁膦的抗性研究奠定基礎(chǔ);另外本研究以bar基因作為篩選標(biāo)記基因來驗(yàn)證該遺傳轉(zhuǎn)化體系，克服了抗生素篩選的局限性，為今后除草劑PPT篩選轉(zhuǎn)基因劍麻提供了有效參考。

由于劍麻生長期長達(dá)十年以上，又主要是通過吸芽、地下走莖、組培快繁等無性繁殖方式進(jìn)行繁殖，因此培育出來的新種質(zhì)抗病性可以穩(wěn)定表達(dá)。而且劍麻是纖維用經(jīng)濟(jì)作物，在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，容易被人們接受和推廣，不易引起轉(zhuǎn)基因安全問題。同時(shí)本研究的成功，預(yù)示著在未來可將晚花、高纖維率等基因?qū)雱β椤瓾.11648中，快速提高劍麻的抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)我國劍麻產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]? 陳河龍， 高建明， 張世清， 等. 劍麻ISSR反應(yīng)體系的建立及其優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（2）： 20-23.

[2]? Lee H I， Broekaert W F， Raikhel N V. Co-and post-translational processing of the hevein preproprotein of latex of the rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Journal of Biological Chemistry， 1991， 266（24）： 15944-15948.

[3]? Gidrol X， Chrestin H， Tan H L， et al. Hevein， a lectin-like protein from Hevea brasiliensis （rubber tree） is involved inthe coagulation of latex[J]. Journal of Biological Chemis-try， 1994， 269（12）： 9278-9283.

[4]? Gao A G， Hakimi S M， Mittanck C A， et al. C M. Fungal

pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide[J]. Nature Biotechnology， 2000， 18（12）： 1307-1310.

[5]? Koo J C， Chun H J， Park H C， et al. Over-expression of a seed specific hevein-like antimicrobial peptide from Pharbitis nil enhances resistance to a fungal pathogen in transgenic tobacco plants[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 50（3）： 441-452.

[6]? 鐘? 坤， 譚德冠， 孫雪飄， 等. 一株木薯生淀粉糖化酶菌株的分離及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 33（7）： 1239-1244.

[7]? Chao C P. Heritability of resistance and repeatability of clone reactions to sugarcane smut in Louisiana[J]. Sugarcane & Canesugar， 1990， 80（7）： 622-626.

[8]? 劉巧蓮， 鄭金龍， 張世清， 等. 13種藥劑對劍麻斑馬紋病病原菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（11）： 2010-2014.

責(zé)任編輯：謝龍蓮