陸川油茶花粉貯藏和離體萌發(fā)條件研究

肖玉菲 馬錦林 蔡婭 郝丙青 劉海龍 陳博雯 葉航

摘? 要：以陸川油茶（Camellia vietnamensis）花粉為試驗材料，檢測不同濕度、不同貯藏溫度和時間下的花粉活力，確定適宜的花粉貯藏方法;采用離體培養(yǎng)法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗，篩選適宜花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：短暫的泡水（時間≤3 h）對花粉活力的影響不大，長時間（時間>6 h）泡水或干燥嚴(yán)重影響陸川油茶的花粉活力。各貯藏溫度下不同貯藏時間花粉活力差異顯著，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下新鮮花粉和干燥花粉活力均逐漸降低，在相同貯藏時間下，貯藏溫度越低，花粉活力下降速率越慢。在室溫和4 ℃貯藏溫度下，干燥處理花粉能夠適當(dāng)延長花粉保存時間，采集新鮮花粉直接置于?80 ℃冰箱貯藏180 d花粉活力仍有69.64%，與其他處理相比，較利于陸川油茶花粉保存。陸川油茶花粉離體萌發(fā)最適條件為：蔗糖150 g/L，H3BO3 0.15 g/L，MgSO4 0.04 g/L，pH=6.4，溫度25 ℃。研究結(jié)果可為今后陸川油茶花粉的收集、貯藏提供理論依據(jù)，也為有效解決花期不遇的問題，保障人工雜交育種工作的有效開展提供技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：陸川油茶;花粉活力;花粉貯藏;離體萌發(fā)

中圖分類號：S794.4????? 文獻標(biāo)識碼：A

Pollen Storage and Germination Conditions in vitro of Camellia vietnamensis

XIAO Yufei， MA Jinlin， CAI Ya， HAO Bingqing， LIU Hailong， CHEN Bowen， YE Hang*

Guangxi Forestry Research Institute / Guangxi Key Laboratory of Special Non-wood Forest Cultivation and Utilization， Nanning， Guangxi 530002， China

Abstract： In order to determine the suitable pollen storage method， the pollen viability of Camellia vietnamensis under different humidity， different storage temperature and time was detected. On the basis of single factor experiment， an orthogonal experiment was designed to select the suitable culture conditions for pollen germination by the in vitro culture method. Soaking in water for a short time （time ≤ 3 h） had little effect on pollen viability， while soaking and drying pollen for a long time （time > 6 h） affected the pollen viability of C. vietnamensis seriously. The pollen viability was significantly different at different storage time at different storage temperature. With the extension of storage time， the vitality of fresh pollen and dry pollen decreased gradually at different storage temperature. Lower the storage temperature would lead to slower decline rate of pollen viability was. At room temperature and 4 ℃ storage temperature， the drying treatment of pollen could prolong the preservation time of pollen to some extent. The pollen viability of fresh pollen collected and stored directly in the refrigerator at ?80 ℃ for 180 days was still 69.64%， which was more beneficial to the preservation of C. vietnamensis pollen compared with other treatments. The optimum conditions for in vitro pollen germination of C. vietnamensis were as follows： sucrose 150 g/L， H3BO3 0.15 g/L， MgSO4 0.04 g/L at pH 6.4 and 25 ℃. The results not only provide a theoretical basis for the collection and storage of C. vietnamensis in the future， but also provide technical guidance for effectively solving the problem of asynchronous flowering period and artificial cross breeding.

Keywords： Camellia vietnamensis; pollen viability; pollen storage; in vitro germination

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.021

油茶是山茶屬（Camellia）植物中種子含油率較高、具有一定栽培經(jīng)濟價值的樹種的總稱，原產(chǎn)和主栽于中國，與椰子、油棕、油橄欖并稱為世界四大木本油料植物[1-2]，其主要產(chǎn)品茶油的不飽和脂肪酸含量高達90%，被譽為“東方橄欖油”“油中軟黃金”和“長壽油”[3-4]，已成為聯(lián)合國糧農(nóng)組織重點推廣的健康型食用油[5]。其副產(chǎn)物果殼、茶粕等經(jīng)加工也是重要的醫(yī)藥、化工等工業(yè)原料[6]。陸川油茶（Camellia vietnamensis）也稱越南油茶、高州油茶，分布于越南、老撾和我國廣東、海南、廣西等?。▍^(qū)），在海南和廣西廣為種植，是我國繼普通油茶和小果油茶之后，栽培面積居第3位的重要油茶種[1]。陸川油茶枝葉茂密，開花時滿樹繁花;抗性強，在干旱貧瘠的生境條件下也能正常生長;其果實大于普通油茶，且果大籽多，在適宜生態(tài)環(huán)境下年產(chǎn)油可達1050 kg/hm2，集觀賞、生態(tài)和經(jīng)濟價值于一身，極具發(fā)展?jié)摿7]。

研究表明，油茶屬于自花不孕、異花授粉植物，自交不親和[8]、授粉受精不良、花期不遇等原因?qū)е缕鋯沃戤a(chǎn)果率差異大、大小年明顯等低產(chǎn)低效現(xiàn)象，已成為油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題[9]。陸川油茶也存在同樣問題，致使其潛在優(yōu)勢尚未得以利用。生產(chǎn)上常需要人工輔助授粉和配植授粉樹的方法來解決，而陸川油茶花粉在自然條件下壽命短，低溫貯藏花粉可以適當(dāng)延長花粉的壽命，既可解決因花期不遇、異地授粉問題，又可使種質(zhì)資源以花粉的形式保存，為雜交育種培育新品種解決了花粉的時空限制，是一種簡便經(jīng)濟、應(yīng)用廣泛的花粉保存方法[10]，此外，花粉正常萌發(fā)是確保成功受精的前提，花粉能否成功萌發(fā)除與自身活力有關(guān)外，還與外部環(huán)境條件密切相關(guān)，培養(yǎng)基成分及其濃度對花粉萌發(fā)率和花粉管生長有很大影響，適宜花粉的萌發(fā)培養(yǎng)基成分因植物不同而異[11]，溫度是保證花粉內(nèi)各種酶促反應(yīng)正常進行的重要外界條件[12]。通過花粉離體萌發(fā)研究，探討提高花粉萌發(fā)率的培養(yǎng)條件，可為調(diào)控花粉萌發(fā)有效途徑、人工輔助授粉提供理論指導(dǎo)。因此，開展油茶花粉貯藏和離體萌發(fā)條件的研究顯得格外重要。

目前，我國在油茶品種選育、良種繁育、豐產(chǎn)栽培及加工利用等方面的研究取得了可喜成就[13]，對油茶花粉活力、花粉數(shù)量、貯藏特征及柱頭可授性也進行了一系列的研究[14-15]。但有關(guān)陸川油茶花粉貯藏和離體萌發(fā)條件的研究罕見報道，缺乏對其花粉較為系統(tǒng)的研究，陸川油茶花期遇雨季和采用噴霧法進行人工授粉時，花粉泡在水中是否影響花粉活力？也未見不同濕度下陸川油茶花粉活力的研究，使得進行人工授粉時仍存在一定的盲目性，嚴(yán)重制約了陸川油茶的進一步發(fā)展。為此，本研究以陸川油茶花粉為試驗材料，研究不同濕度、不同貯藏溫度和時間對花粉活力的影響，篩選出陸川油茶花粉貯藏的條件，同時研究其離體萌發(fā)的適宜條件，為解決陸川油茶自交不親和、授粉受精不良、花期不遇等問題提供理論基礎(chǔ)，也為油茶人工輔助授粉和雜交育種提供實踐指導(dǎo)意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗植株位于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院老虎嶺油茶種質(zhì)資源收集圃（22°56′ N，108°21′ E），地處南寧市市郊，屬濕潤的亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫20～21 ℃，1月平均氣溫11.8 ℃以上，7月平均氣溫27.6 ℃，年均降雨量達1304.2 mm，平均相對濕度為79%。選擇生長健康的5年生陸川油茶優(yōu)良無性系作為試驗材料，于大蕾期采摘植株上帶有待開花蕾的枝條，帶回實驗室，常溫下進行水培，待花蕾開放、花藥開裂后，將花粉抖落在鋪有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，收集花粉，備用。

1.2? 方法

1.2.1? 不同濕度下花粉活力測定? 取新鮮花粉均勻分為2組（泡水、干燥）分別放入稱量瓶中，泡水組：向稱量瓶中加入蒸餾水浸泡花粉，用解剖針攪拌均勻，分別泡水0、3、6、12、24、36、48 h;干燥組：將盛有花粉的稱量瓶放入25 ℃人工氣候箱內(nèi)干燥，分別干燥0、3、6、12、24、36、48 h。采用TTC法[16]檢測花粉活力。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察5個視野，計算花粉活力，花粉活力=視野中顯紅色或粉紅色的花粉粒數(shù)/視野中總花粉粒數(shù)×100%。

1.2.2? 不同貯藏條件下花粉活力測定? 將收集的新鮮花粉分為8組：RT新鮮（常溫條件下新鮮花粉放入2 mL離心管，密封，每管花粉量為1/10離心管體積，下同）、4 ℃新鮮、?20 ℃新鮮、?80 ℃新鮮、RT干燥（常溫條件下新鮮花粉放入2 mL離心管中，每管花粉量為1/10離心管體積，置于裝有硅膠的小瓶密封，其他干燥處理相同）、4 ℃干燥、?20 ℃干燥、?80 ℃干燥，分別于貯藏后的第0、5、10、15、20、25、30、60、90、120、150、180天，采用TTC法檢測花粉活力。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察5個視野，計算花粉活力，花粉活力=視野中顯紅色或粉紅色的花粉粒數(shù)/視野中總花粉粒數(shù)×100%。

1.2.3? 花粉的離體萌發(fā)? 花粉萌發(fā)采用液體培養(yǎng)法，液體培養(yǎng)基的主要成分：蔗糖、H3BO3、MgSO4。試驗設(shè)計：（1）單因素試驗：對蔗糖、H3BO3、MgSO4、pH、溫度5個因素進行單因素實驗（表1）。（2）正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交試驗設(shè)計（表2）探討花粉萌發(fā)和花粉管生長的最佳培養(yǎng)條件。用毛筆蘸取新鮮花粉均勻撒于凹形載玻片上的培養(yǎng)基表層，將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放在氣候箱中黑暗保濕培養(yǎng)6 h，以花粉管長度等于或大于花粉粒直徑視為萌發(fā)[17]，統(tǒng)計最長花粉管長度，花粉管長度計數(shù)單位：1 D=1倍的花粉粒長度。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察5個視野，計算花粉萌發(fā)率，萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%

1.3? 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果在LEICA DM2500型數(shù)碼生物顯微鏡下觀察拍照，并用Image J統(tǒng)計每個視野下不同狀態(tài)花粉數(shù)量;采用正交設(shè)計助手ⅡV 3.1進行花粉萌發(fā)正交試驗設(shè)計，并對試驗結(jié)果進行極差分析;采用Excel 2016軟件對不同濕度、貯藏溫度和時間下花粉活力變化進行常規(guī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示;采用SPSS 19.0軟件對花粉萌發(fā)和花粉活力測定試驗結(jié)果進行方差分析、多重比較，統(tǒng)計分析顯著性水平均設(shè)定為P=0.05。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 濕度對花粉活力的影響

由圖1可知陸川油茶新鮮花粉（處理0 h）活力最高，為97.29%，但與泡水3 h花粉活力（93.83%）無顯著差異，說明花粉經(jīng)過短暫的泡水（時間≤3 h）對花粉活力的影響不大。隨著泡水和干燥時間的延長，花粉活力逐漸下降，對比處理相同時間下泡水組和干燥組的花粉活力發(fā)現(xiàn)，處理前6 h泡水組花粉活力下降速度快于干燥組，處理6 h后干燥組花粉活力下降速度快于泡水組，泡水與干燥48 h后花粉活力僅為16.96%和13.24%，說明長時間（>6 h）泡水或干燥嚴(yán)重影響陸川油茶的花粉活力。

2.2? 貯藏條件對花粉活力的影響

不同貯藏條件下花粉活力見圖2，由圖2可知，各貯藏溫度下不同貯藏時間花粉活力差異顯著?；ǚ凼占?dāng)天花粉活力最高，達97.89%。隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下新鮮花粉和干燥花粉活力均逐漸降低。其中，室溫（RT）貯藏條件下，貯藏0～5 d新鮮花粉活力下降速度慢于干燥花粉，貯藏5～10 d新鮮花粉活力下降速度超過干燥花粉，新鮮花粉貯藏20 d花粉活力僅為1.73%，與貯藏25～180 d的花粉活力無顯著差異，干燥花粉貯藏25 d花粉活力為2.20%，與貯藏30～180 d花粉活力無顯著差異。因此，新鮮花粉和干燥花粉活力均隨貯藏時間的延長迅速降低，新鮮花粉貯藏20 d后失去活力，干燥花粉在貯藏25 d后完全失去活力。

4 ℃貯藏條件下，新鮮花粉貯藏0～10 d花粉活力下降速度較慢，貯藏10～25 d花粉活力下降速度最快，貯藏25～60 d花粉活力逐漸趨于平緩。干燥花粉貯藏0～15 d活力下降速度最快，貯藏15～120 d花粉活力逐漸趨于平緩。新鮮花粉貯藏90 d花粉活力為2.19%，干燥花粉貯藏120 d和125 d花粉活力分別為3.11%和2.50%，均無顯著差異，因此說明，采用4 ℃貯藏，新鮮花粉90 d后失去活力，干燥花粉120 d后失去活力。

?20 ℃貯藏條件下，貯藏前5 d新鮮花粉與干燥花粉活力與采集當(dāng)天花粉活力無顯著差異。新鮮花粉較干燥花粉活力隨著貯藏時間的延長下降速度慢，尤其表現(xiàn)在0～60 d;貯藏60 d，新鮮花

粉活力仍有87.65%，干燥花粉活力降為61.53%;貯藏180 d，新鮮花粉活力為47.85%，干燥花粉活力為39.75%，表明相同貯藏時間下，新鮮花粉活力高于干燥花粉。

?80 ℃貯藏條件下，相比其他貯藏溫度，花粉活力下降速度最慢。貯藏0～15 d新鮮花粉與干燥花粉活力均與采集當(dāng)天花粉活力無顯著差異;貯藏30 d新鮮花粉活力為93.74%，干燥花粉活力為83.51%;貯藏0～60 d，新鮮花粉與干燥花粉活力下降速度趨勢基本一致;貯藏60～180 d，干燥花粉下降速度明顯快于新鮮花粉，貯藏90 d新鮮花粉活力仍有82.83%，干燥花粉活力為71.56%;貯藏180 d時，新鮮花粉活力為69.64%，干燥花粉的活力為60.59%，花粉仍保持較高的活力，顯著高于其他貯藏溫度。

綜合分析可知，在相同貯藏時間下，貯藏溫度越低，花粉活力下降速率越慢。在室溫和4 ℃貯藏溫度下，干燥處理花粉比新鮮花粉保存時間更長，干燥處理花粉能夠適當(dāng)延長花粉保存時間，在?20 ℃和?80 ℃貯藏溫度下，干燥花粉活力較新鮮花粉活力低，其中?80 ℃新鮮花粉在貯藏180 d后花粉活力最高。綜上所述，采集新鮮花粉直接貯藏于?80 ℃冰箱較利于陸川油茶花粉保存。

2.3? 單因素對陸川油茶花粉離體萌發(fā)的影響

單因素試驗結(jié)果見圖3、圖4，結(jié)果表明：不同濃度蔗糖、H3BO3、MgSO4及不同pH和溫度條件下花粉萌發(fā)率和花粉管平均長度均差異顯著（P<0.05），除溫度因素外，其他因素處理下花粉萌發(fā)率和花粉管平均長度均隨處理水平升高，呈先升后降趨勢。

蔗糖濃度為0時，花粉萌發(fā)率僅為3.72%，花粉管平均長度為1.47 D;蔗糖濃度為150 g/L時，花粉萌發(fā)率最高，為25.90%;蔗糖濃度為200 g/L時，花粉管平均長度最長，為8.87 D;蔗糖濃度為250 g/L時，花粉萌發(fā)率降為12.72%，花粉管平均長度降為3.53 D。說明過高或過低的蔗糖濃度均不利于花粉萌發(fā)，相對花粉萌發(fā)率適宜的蔗糖濃度而言，較高濃度的蔗糖能夠促進花粉管的生長。

H3BO3濃度為0時花粉萌發(fā)率為25.97%，花粉管平均長度為6.33 D;H3BO3濃度為0.15 g/L時花粉萌發(fā)率最高，為58.72%，花粉管平均長度最長，為10.47 D，顯著高于H3BO3濃度為0時，但H3BO3濃度為0.20 g/L和0.25 g/L時，花粉萌發(fā)率分別降為24.97%和16.35%，花粉管平均長度分別降為4.60 D和1.33 D，說明適宜濃度的H3BO3才能促進花粉萌發(fā)。

MgSO4濃度為0.05 g/L時，花粉萌發(fā)率最高，為43.66%，花粉管平均長度最長，為11.33 D，且高于其他試驗組，說明MgSO4能夠促進花粉管的生長。MgSO4濃度提高至0.07～0.09 g/L時，花粉萌發(fā)率和花粉管平均長度均顯著下降，且低于不添加MgSO4試驗組，說明過高濃度的MgSO4會抑制花粉萌發(fā)。

當(dāng)pH為6.0時，花粉萌發(fā)率最高，為25.51%，花粉管平均長度最長，為6.33 D;pH為7.0和8.0時，花粉萌發(fā)率分別為22.61%和18.48%，花粉萌發(fā)率顯著下降，花粉管平均長度分別為2.67 D和2.13 D，無顯著差異;當(dāng)pH為9.0時，花粉萌發(fā)率僅為0.73%，顯著低于其他水平，花粉管平均長度僅為0.47 D，與pH為5.0時無顯著差異，均顯著低于其他水平，說明偏堿性環(huán)境對于花粉萌發(fā)較為不利。

溫度為10 ℃時花粉萌發(fā)率僅為9.58%，花粉管平均長度為1.87 D，顯著低于其他水平，隨著溫度升高，花粉萌發(fā)率和花粉管平均長度逐漸提高，溫度為25 ℃時花粉萌發(fā)率為25.97%，高于溫度為30 ℃時的23.81%，溫度為30 ℃時花粉管平均長度最長，為9.33 D，說明溫度較低不利于陸川油茶花粉萌發(fā)，花粉管生長需要較高的溫度。

綜合分析單因素試驗結(jié)果，陸川油茶花粉萌發(fā)較為適宜的條件為：蔗糖150～200 g/L，H3BO3 0.15 g/L，MgSO4 0.05 g/L，pH 6.0，溫度25～30 ℃。

2.4? 正交試驗對陸川油茶花粉離體萌發(fā)的影響

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為尋求蔗糖、H3BO3、MgSO4、pH和溫度的最佳組合，進行L16（45）正交試驗，正交試驗設(shè)計組合及結(jié)果如表2所示，各處理對陸川油茶花粉萌發(fā)的影響呈差異顯著。其中處理12的花粉萌發(fā)率最高，為63.26%，處理14花粉管平均長度最長，為12.47 D，均顯著高于其他處理。對正交試驗結(jié)果進行極差分析（表3），極差值R越大代表其對結(jié)果影響越大。結(jié)果顯示針對花粉萌發(fā)率這個指標(biāo)，各因素的極差分別為：R蔗糖=20.24，RH3BO3=17.36，RMgSO4=14.82，RpH=0.36，R溫度=14.75，即因素影響作用的主次順序為：蔗糖>H3BO3>MgSO4>溫度>pH，蔗糖4個水平下萌發(fā)率的均值最大為K3，H3BO3四個水平下萌發(fā)率的均值最大為K2，MgSO4四個水平下萌發(fā)率的均值最大為K2，pH 4個水平下萌發(fā)率的均值最大為K2，溫度4個水平下萌發(fā)率的均值最大為K3，故花粉萌發(fā)率最高的組合是：蔗糖（水平3）為150 g/L，H3BO3（水平2）為0.15 g/L，MgSO4（水平2）為0.04 g/L，pH（水平2）為6.4，溫度（水平3）為25 ℃。針對花粉管萌發(fā)長度這個指標(biāo)，各因素的極差分別為：R蔗糖=1.72，RH3BO3= 2.14，RMgSO4=4.53，RpH= 2.07，R溫度=2.53，即因素影響作用的主次順序為：MgSO4>溫度>H3BO3>pH>蔗糖，蔗糖4個水平下花粉管平均長度的均值最大為K4，H3BO3四個水平下花粉管平均長度的均值最大為K2，MgSO4四個水平下花粉管平均長度的均值最大為K3，pH 4個水平下花粉管平均長度的均值最大為K2，溫度4個水平下花粉管平均長度的均值最大為K4，故花粉管平均長度最長的組合是：蔗糖（水平4）為175 g/L，H3BO3（水平2）為0.15 g/L，MgSO4（水平3）為0.05 g/L，pH（水平2）為6.4，溫度（水平4）為30 ℃，而萌發(fā)率是評價花粉萌發(fā)效果的最主要指標(biāo)，因此，陸川油茶花粉離體萌發(fā)的最適條件為：蔗糖150 g/L，H3BO3 0.15 g/L，MgSO4 0.04 g/L，pH 6.4，溫度25 ℃。

3? 討論

3.1? 濕度對花粉活力的影響

花粉活力是影響初始坐果率和產(chǎn)量的重要因素，花粉活力受環(huán)境因素影響較大，其中濕度是重要因素之一[18]。水分是花粉中淀粉、脂肪水

解等各種生理生化反應(yīng)的良好溶劑，但花粉長時間泡在水中不利于進行呼吸作用，還會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)浸出，同時泡水還會破壞花粉壁[19];干燥處理會影響花粉的含水量，研究表明花粉含水量是影響花粉活力的重要因素之一，適當(dāng)干燥有利于花粉的保存，但干燥時間過長會對花粉細(xì)胞造成水脅迫，難以維持其正常的生理活動[20-21]。本研究也證實了這一點，長時間（時間>6 h）泡水或干燥嚴(yán)重影響花粉活力。鄧鑫州等[19]通過研究泡水時間對望謨油茶和岑溪軟枝油茶花粉萌發(fā)率的影響，發(fā)現(xiàn)泡水后嚴(yán)重影響花粉萌發(fā)率，泡水10～ 30 min的花粉平均萌發(fā)率僅為6.3%，顯著低于未泡水的花粉，且萌發(fā)的花粉管質(zhì)量較差;蔡堅等[22]通過研究不同干燥方式對普通油茶花粉萌發(fā)率的影響，發(fā)現(xiàn)不同干燥方式處理花粉3 h均會提高花粉萌發(fā)率，烘箱25 ℃處理效果最佳。本研究發(fā)現(xiàn)隨泡水和干燥時間的延長花粉活力逐漸下降，但短暫的泡水（時間≤3 h）對花粉活力影響不大，與其結(jié)果不一致，可能是由于本研究中采用的是TTC法檢測花粉活力，檢測方法不同導(dǎo)致的結(jié)果差異，采用不同方法檢測花粉活力有待研究。

3.2? 貯藏條件對花粉活力的影響

花粉貯藏是植物種質(zhì)資源保存和雜交育種的關(guān)鍵，簡便有效的花粉貯藏方法可為保育工作的順利進行奠定重要的基礎(chǔ)[23]?；ǚ刍盍Ρ３謺r間的長短受自身遺傳和環(huán)境因素的共同影響，通?？赏ㄟ^降低溫度、調(diào)節(jié)花粉含水量來延長花粉的壽命，不同植物花粉貯藏時所需的最適含水量和溫度不同[24]。

花粉對溫度反應(yīng)敏感，在自然條件下很容易失去活力[25]，低溫貯藏會對花粉活力產(chǎn)生顯著影響，可減緩其代謝活動、降低酶活性和呼吸作用等，使花粉活力下降的速率變慢，從而使花粉保存較長時間[26]。許多學(xué)者針對油茶花粉的貯藏特性進行了研究，花粉活力通常隨貯藏時間的延長而降低，并因貯藏方法不同而異。鄒鋒等[14]研究發(fā)現(xiàn)，采用4 ℃貯藏時，攸縣油茶、長尾紅山茶、廣寧紅山茶、多齒紅山茶花粉可有效保存7 d，石果紅山茶、扁果紅山茶、厚葉紅山茶花粉可有效保存14 d，溆浦大紅花和長毛紅山茶花粉可有效保存21 d;蔡堅等[22]比較室溫、4 ℃和?20 ℃貯藏普通油茶花粉時發(fā)現(xiàn)，?20 ℃貯藏花粉活力保存效果最佳，顯著好于前二者;本研究發(fā)現(xiàn)新鮮花粉在室溫和4 ℃時花粉活力下降較快，分別在貯藏20 d和90 d后失去活力，在?20 ℃貯藏90 d時活力仍有79.74%，在?80 ℃貯藏180 d后花粉活力仍有69.64%，說明溫度越低花粉保存時間越長，與前人研究結(jié)果一致，因為低溫環(huán)境下花粉的能量代謝會降低[27]，但具體保存時間有所差異，可能與樹種、樹齡、樹體營養(yǎng)狀況有關(guān)[14]。

在貯藏過程中，花粉內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)被不斷消耗，活性氧自由基增多，花粉細(xì)胞易受水分脅迫，適宜的含水量有利于其貯藏的生理活動[20]，但含水量過高，在低溫下細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰過多，會造成細(xì)胞膜受損，影響保存后的生活力[28]，適當(dāng)干燥可以減少水介導(dǎo)的酶解反應(yīng)，從而延長花粉貯藏時間[29]。普通油茶、多齒紅花油茶、廣寧紅花油茶、浙江紅花油茶、攸縣油茶等5種油茶花粉常溫干燥貯藏，活力迅速下降[30];王玉娟等[31]研究發(fā)現(xiàn)?20 ℃真空干燥條件下貯藏的花粉能保存9個月左右;張鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)花粉干燥后比未經(jīng)干燥的25 ℃和4 ℃下貯藏時間明顯加長，?20 ℃干燥和?80 ℃干燥在貯藏90 d花粉仍能保持80%以上的活力，能夠滿足高州油茶花粉的長期貯藏要求。但本研究中在?20 ℃和?80 ℃低溫貯藏90 d時，干燥花粉活力均在80%以下，新鮮花粉活力均在80%以上，顯著低于新鮮花粉，可能由于本研究中采用的干燥方式未能準(zhǔn)確控制花粉含水量，過度脫水對花粉細(xì)胞造成了一定的損傷，影響了其花粉活力[33]，準(zhǔn)確控制含水量的干燥方式對低溫貯藏花粉活力的影響有待進一步研究。

3.3? 花粉離體萌發(fā)的影響因素

花粉萌發(fā)是一個復(fù)雜的生理和形態(tài)建成過程，在花粉離體培養(yǎng)時，除受自身條件的影響外，培養(yǎng)基、pH和溫度對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響也較大[34-35]。

3.3.1? 培養(yǎng)基組分對花粉萌發(fā)的影響? 花粉萌發(fā)和花粉管生長過程需要多種成分參與，蔗糖是花粉粒萌發(fā)及花粉管壁合成的主要營養(yǎng)物質(zhì)，參與跨膜運輸，可在代謝過程中為呼吸作用和淀粉合成提供原料，為花粉萌發(fā)和花粉管生長提供所需的能源和碳源[36]，同時還可以在一定程度上維持花粉細(xì)胞外界環(huán)境的滲透壓，保證花粉萌發(fā)形態(tài)[37]，是影響植物花粉萌發(fā)的重要因素。蔗糖濃度過高，會使培養(yǎng)基的滲透勢降低，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離、花粉管破裂甚至細(xì)胞脫水死亡[38];蔗糖濃度過低，會發(fā)生吸脹作用，均會降低花粉萌發(fā)率[39]，本研究也證實了這一點，隨著蔗糖濃度水平的提高，花粉萌發(fā)率和花粉管生長均呈先升高后降低的趨勢。在離體萌發(fā)過程中，不同花粉萌發(fā)的最適蔗糖濃度隨自身花粉所儲存的營養(yǎng)物質(zhì)不同而有所區(qū)別[40]，不同油茶花粉萌發(fā)時所需蔗糖濃度不同，以50～250 g/L居多，本研究陸川油茶花粉離體萌發(fā)的最佳蔗糖濃度為150 g/L，與黃國文等[41]研究普通油茶花粉萌發(fā)的結(jié)果一致。

有關(guān)硼酸對花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究報道較多，認(rèn)為硼酸可與蔗糖形成絡(luò)合物，提高糖的吸收和代謝，同時可引導(dǎo)胞外Ca2+進入細(xì)胞，有利于花粉管壁的建造促進花粉萌發(fā)和花粉管的生長[42-43]，硼還能影響果膠甲酯酶活性，促進構(gòu)成花粉管壁的成分果膠物質(zhì)的合成[44]，缺硼導(dǎo)致酸性果膠質(zhì)在頂端大量富集，造成花粉管破裂[45]。但硼對花粉萌發(fā)的促進作用有一定的限度[46]，本研究表明硼酸濃度為0.15 g/L時，陸川油茶花粉萌發(fā)率最高，與其他油茶有所差異，可能是不同植物所需的最適硼離子濃度不同[47]。

已有報道認(rèn)為Mg2+能夠影響花粉萌發(fā)[48]，在適宜濃度下能夠促進花粉的萌發(fā)。本研究在進行單因素試驗時發(fā)現(xiàn)MgSO4濃度為0.05 g/L時，花粉萌發(fā)率顯著高于MgSO4濃度為0時的花粉萌發(fā)率;正交試驗結(jié)果顯示MgSO4濃度為0.04 g/L時花粉萌發(fā)率最高，MgSO4濃度為0.05 g/L時花粉管平均長度最長，再次證實這一觀點。

3.3.2? 溫度和pH對花粉萌發(fā)的影響? 花粉的萌發(fā)需要適宜的條件，pH和培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)和花粉管生長都有顯著的影響[38]。不同植物花粉萌發(fā)的適宜pH和溫度條件也不盡相同，只有在其適合的范圍內(nèi)才能順利萌發(fā)，低于或者高于適宜范圍，都會對花粉萌發(fā)和花粉管生長產(chǎn)生不利影響[49]。溫度對于不同油茶品種花粉萌發(fā)的影響差異較大，岑溪軟枝油茶1號、2號和3號花粉萌發(fā)的最適溫度分別是20 ℃、25 ℃和30 ℃，桂3和桂24油茶花粉萌發(fā)的最適溫度均為20 ℃[50]，普通油茶花粉萌發(fā)的最適pH為6.0，最適溫度為25 ℃[41， 51]，本研究陸川油茶花粉萌發(fā)的最適pH為6.2，最適溫度為25 ℃，與其略有差異，再次證明不同植物花粉萌發(fā)的最適范圍不同。在花粉萌發(fā)過程中，花粉內(nèi)部的酶及化學(xué)物質(zhì)會對溫度作出反應(yīng)，從而影響花粉的萌發(fā)，本研究中溫度對于花粉萌發(fā)率和花粉管生長的影響作用均較強，陸川油茶授粉期處于11—12月，外界溫度低于花粉萌發(fā)的最適溫度，嚴(yán)重影響花粉的萌發(fā)，可能是導(dǎo)致授粉成功率低、座果率低的原因之一。

綜上所述，本研究認(rèn)為，短暫的泡水（時間≤ 3 h）對花粉活力的影響不大，但長時間（時間>6 h）泡水或干燥嚴(yán)重影響陸川油茶的花粉活力，采用噴霧法進行人工授粉時應(yīng)注意控制時間，與其他處理相比，采集新鮮花粉直接貯藏于?80 ℃冰箱較利于陸川油茶花粉保存，花粉離體萌發(fā)的最適條件為：蔗糖150 g/L，H3BO3 0.15 g/L，MgSO4 0.04 g/L，pH 6.4，25 ℃。研究結(jié)果為今后陸川油茶花粉的收集、貯藏提供了理論依據(jù)，也為有效解決花期不遇的問題、保障人工雜交育種工作的有效開展提供技術(shù)指導(dǎo)。

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