高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測仲丁靈在人參中的殘留及消解動態(tài)

尤慶航, 彭 湃, 宋雨桐, 方 楠, 朱宗利, 侯新港,梁 爽, 逯忠斌, 曲 彤, 侯志廣*,

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，長春 130118)

人參Panax ginsengC. A. Mey為五加科多年生草本植物，現(xiàn)代醫(yī)學證明，人參及其制品能促進新陳代謝，調(diào)節(jié)生理機能，對治療心血管疾病、胃病和肝臟疾病、糖尿病、不同類型的神經(jīng)衰弱癥等均有較好療效[1-4]，其皂苷除藥用制成人參茶以外，還在食品和化妝品的生產(chǎn)等方面均有較好的應用前景[5]。人參是一種宿根性藥用植物[6]，自然界的土壤條件，大多不符合獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)參根的要求，因此，多數(shù)參區(qū)都是選擇適宜的天然林地，伐木整地后進行栽培。而我國林地面積較少，為保護森林資源，防止水土流失，近年來中國已逐漸從林下栽參轉(zhuǎn)向農(nóng)田栽參。與林地相比，農(nóng)田草害更為嚴重，嚴重影響人參產(chǎn)量。但目前尚未見除草劑在人參上的登記，因此選用高效、低毒、低殘留的除草劑來防除參地雜草具有十分重要的現(xiàn)實意義。

仲丁靈 (butralin) 是一種二硝基苯胺類芽前土壤處理除草劑，具有觸殺兼局部內(nèi)吸的作用，藥劑可通過植物的根莖和幼芽吸收，在植物體內(nèi)抑制分生組織細胞的分裂和分化，從而達到阻礙雜草的生長使其死亡的目的[7]。因其除草范圍廣，且低毒、低殘留、安全性高，所以近年來仲丁靈越來越多的作為選擇性芽前除草劑被應用于防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草[8]。根據(jù)田間藥效試驗資料，仲丁靈在人參田防除雜草的藥效較好，但不恰當?shù)氖褂脮屛幢焕玫霓r(nóng)藥遷移到土壤中，被人參根系吸收并轉(zhuǎn)運到其他部位富集積累，進而影響食用者健康。因此，檢測人參及其土壤中仲丁靈的殘留量十分必要。

在GB 2763—2019[9]中，仲丁靈的殘留物定義為仲丁靈母體，與仲丁靈結構相似且同為二硝基苯胺類除草劑的二甲戊靈的膳食攝入評估和MRL監(jiān)測的殘留物定義均定為二甲戊靈母體[10]。本文以此作為參考，將殘留檢測物暫定為仲丁靈母體。目前，關于仲丁靈的殘留檢測多集中在煙草[11]、土壤[12]、大豆[13]、水果[14]、水稻[15]等作物上，檢測方法主要有配備電子捕獲檢測器的氣相色譜法 (GC-NPD)[16]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (GCMS/MS)[17]、高效液相色譜法 (HPLC)[18]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS)[19]。截至目前尚未見有關仲丁靈在人參及其土壤中殘留動態(tài)的相關報道。由于人參中含有皂苷、揮發(fā)油、酚類、氨基酸、有機酸、維生素、脂肪和甾醇等多種成分，致使基質(zhì)較為復雜，當農(nóng)藥理化性質(zhì)不穩(wěn)定或目標分析物濃度過低時，復雜基質(zhì)會對人參中農(nóng)藥殘留檢測造成困難[20]。與傳統(tǒng)分析手段相比，HPLC-MS/MS對于復雜基質(zhì)中痕量化合物的檢測適用性更強[21]。鑒于此，本研究建立了一種快捷簡便的HPLC-MS/MS測定鮮人參、干人參、人參植株及人參土壤中仲丁靈殘留量的分析方法。此外，還通過1年4地的田間試驗，研究了仲丁靈在人參及其土壤中的消解動態(tài)和最終殘留量。旨在指導農(nóng)民合理施藥，保障仲丁靈在人參上的安全使用，為我國仲丁靈在人參中最大殘留限量標準的制定以及仲丁靈在人參上的登記使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑與試劑

Agilent 1260-6470高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)；T25 ULTRA-TURRAX勻漿機 (德國IKA集團)；SHZ-88水浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (德國IKA集團)；LE204E萬分之一天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

仲丁靈 (butralin) 標準品 (純度98.7%，Dr.Ehrenstorfer公司)；48%仲丁靈乳油 (EC，大弓農(nóng)化有限公司)；乙腈 (色譜純，MREDA公司)；甲醇 (色譜純，MREDA公司)；甲酸 (色譜級，福晨化學試劑有限公司)；乙酸銨 (色譜級，Sigma-Alorich集團)；氯化鈉 (分析純，北京化工廠)；水(杭州娃哈哈集團有限公司)；1 g NH2固相萃取柱(Agilent公司)。

1.2 田間試驗

根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[22]進行。于2019年在吉林省白山市、撫松縣、延吉市以及遼寧省桓仁縣進行1年4地的田間試驗，供試藥劑為48%仲丁靈乳油 (推薦劑量為制劑量3 750 g/hm2)，供試人參Panax ginsengC. A. Mey品種為大馬牙。

1.2.1 消解動態(tài)試驗 選擇栽有人參的土壤進行，小區(qū)面積50 m2，施藥劑量以制劑量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人參出苗前通過土壤噴霧施藥1次。分別于施藥后0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45和60 d、收獲期采集深度0～10 cm土壤樣品；施藥后，待人參植株生長至15 cm高時，分別于0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45、60 d及收獲期采集人參莖葉。上述樣品均于 ?20 ℃下儲藏，待測。

1.2.2 最終殘留試驗 施藥劑量以制劑量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人參出苗前噴霧施藥1次，小區(qū)面積為50 m2。于收獲期分別采集人參(地下肉質(zhì)根部分)、人參莖葉、人參土壤樣品。于?20 ℃下儲藏，待測。另設清水空白對照，處理間設保護帶。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的制備 稱取500 g于 ?20 ℃下保存的人參，經(jīng)切片機切片后，一部分用食品加工機搗碎，混勻，制得鮮人參樣品，于 ?20 ℃保存；另一部分根據(jù)GB/T 19506—2009[23]方法置于80 ℃烘箱中烘干24 h，用粉碎機粉碎，過篩孔直徑為180 μm 篩，制得干人參樣品，于 ?20 ℃保存。

1.3.2 提取 稱取鮮人參樣品和人參植株樣品各20.0 g，分別置于250 mL燒杯中，加入100 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，高速勻漿約2 min，在鋪有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾。將濾液全部收集于裝有5～7 g氯化鈉的具塞量筒中，振搖150次，靜置1 min；再次振搖100次，靜置1 h以上。取上清液待凈化。

稱取干人參樣品5.0 g和種植人參土壤樣品20.0 g，分別置于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，振蕩提取1 h。后續(xù)抽濾等處理同鮮人參樣品的處理。取上清液待凈化。

1.3.3 凈化 移取20 mL上述提取液于250 mL平底燒瓶中，于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液溶解，向NH2固相萃取柱中加入4 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液預淋洗，棄去流出液。當液面下降到柱填充物頂部時，將樣品溶解液轉(zhuǎn)移到凈化柱上，并用新平底燒瓶接收，再用2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液分別洗滌試樣燒瓶3次，轉(zhuǎn)移到凈化柱中，最后用20 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液洗脫；收集全部洗脫液，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用氮氣吹干，加入5 mLV(乙腈) :V(水)=3 : 2混合溶液復溶，混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱 (3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)；流動相為V(甲醇)和V[(0.1%甲酸 + 5 mmol/L甲酸銨) 水溶液]=8 : 2，等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；多反應監(jiān)測 (MRM)；毛細管電壓4 000 V；霧化氣為氮氣，霧化氣壓力為0.207 MPa；干燥氣溫度330 ℃，干燥氣流速為7 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速8 L/min。質(zhì)譜參數(shù)如表1。

表1 仲丁靈的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of butralin

1.5 標準溶液配制與基質(zhì)匹配標準曲線繪制

準確稱取仲丁靈標準品0.01 g (精確至0.000 1 g)，先用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準母液，再用乙腈稀釋，制備100 mg/L的標準溶液，于4 ℃貯存，備用。使用時用乙腈稀釋成0.2、1和10 mg/L的系列仲丁靈標準工作液。

取空白基質(zhì)樣品按1.3節(jié)的方法進行樣品前處理，添加仲丁靈標準溶液，配成質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L系列的基質(zhì)匹配標準溶液。按1.4節(jié)條件測定，以仲丁靈質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標，峰面積 (y) 為縱坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。

1.6 基質(zhì)效應

在HPLC-MS/MS分析過程中，電噴霧電離源(ESI) 易受樣品中分析目標化合物以外的基質(zhì)成分和目標化合物在離子化過程中相互競爭的影響，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應[24]，影響HPLC-MS/MS在定量分析中的準確性與重現(xiàn)性[25]，因此本研究分別用空白溶劑和空白基質(zhì)提取溶液配制一系列濃度梯度的標準溶液，在相同的色譜條件下檢測，根據(jù)標準溶液的校正曲線斜率按公式 (1)分別計算鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的基質(zhì)效應。

式中Smatrix為基質(zhì)空白提取液制備的標準曲線的斜率，Ssolvent為空白溶劑乙腈制備的標準曲線的斜率。當Me值在0.8～1.2之間時，其基質(zhì)效應可以忽略；當Me值大于1.2時表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應；當Me值小于0.8時表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應[26]。

1.7 添加回收試驗

稱取不含仲丁靈的鮮人參樣品20 g、干人參樣品5 g、人參植株樣品20 g和人參土壤樣品20 g，按1.3節(jié)方法進行樣品前處理。向空白基質(zhì)中添加仲丁靈標準溶液，仲丁靈在鮮人參和干人參中添加水平為0.01、0.05、0.5 mg/kg，在人參植株和人參土壤中的添加水平為0.01、0.05、0.5、10 mg/kg。每個水平重復5次，按1.4節(jié)條件測定，計算添加回收率及相對標準偏差 (RSD)。

2 結果與分析

2.1 HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別在ESI+和ESI?模式下以0.3 mL/min的流速直接注入1.0 mg/L仲丁靈標準溶液進行掃描。結果發(fā)現(xiàn)，在ESI+下獲得了豐度較高的母離子[M+H+]離子峰，進一步優(yōu)化二級質(zhì)譜的條件來獲得特征子離子，并從中選擇兩個離子豐度較強，響應值較高，干擾較小的兩個離子作為其定性與定量的離子對m/z240.2/222.2。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 C18色譜柱對于大多數(shù)化合物分辨效果好，保留性強且在液相色譜儀中應用較為廣泛，故選用了Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)，并在甲醇相和水相體積比為8 : 2的等度洗脫條件下對仲丁靈在不同流動相條件下的響應值和峰型進行了觀察，比較了甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸銨)、甲醇-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含5 mmol/L氫氧化銨) 和甲醇-水4種流動相組合。由圖1表明：當有機相為甲醇溶液，水相為含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的水溶液時，仲丁靈的響應值最高，峰型較為尖銳，故選用甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸銨) 作為流動相，在此條件下仲丁靈的保留時間約為5.4 min。

2.2 方法的線性關系和基質(zhì)效應

結果 (表2) 顯示，在0.002～0.5 mg/L內(nèi)，不同基質(zhì)中，仲丁靈的質(zhì)量濃度與響應值有良好的線性關系。

表2 仲丁靈在人參中的線性方程及基質(zhì)效應Table 2 Linear equations and matrix effects of butralin in ginseng

仲丁靈在鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的Me值均大于1.2，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，為保證分析方法的準確性，采用基制匹配標準溶液校正樣品，結果表明可以達到殘留分析檢測的要求[22]。

2.3 方法的準確度和精密度

結果 (表3) 表明：仲丁靈在鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的平均回收率分別為98%～108%、93%～98%、94%～106%和95%～107%，相對標準偏差分別為1.4%～2.5%、0.6%～6.2%、1.2%～2.5%和0.80%～5.7%。仲丁靈的定量限 (LOQ) 為0.01 mg/kg。其準確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留定量分析的要求[22]。

表3 仲丁靈在人參及人參土壤中的添加回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and RSDs of butralin in ginseng and ginseng soil

2.4 仲丁靈在人參中的消解動態(tài)

2019年在吉林省白山市和遼寧省桓仁縣的田間消解動態(tài)結果顯示，48%仲丁靈乳油在人參中的消解動態(tài)均符合一級反應動力學方程 (圖2)。由表4可知，施藥后隨著采收間隔期的延長，仲丁靈在人參土壤及人參植株中的殘留量均逐漸降低。施藥60 d后，白山試驗點人參土壤樣品中仲丁靈的殘留量為0.32 mg/kg，消解率達到了87.3%；遼寧省桓仁試驗點人參土壤樣品中仲丁靈殘留量為0.29 mg/kg，消解率達到78.6%。仲丁靈在吉林白山和遼寧桓仁的人參土壤樣品中半衰期分別為12.63 d和 18.91 d，表明仲丁靈在人參土壤中降解較快，屬于易降解農(nóng)藥 (t1/2< 30 d)。

表4 仲丁靈在人參植株及人參土壤中的消解動態(tài)Table 4 Dissipation dynamics of butralin in ginseng plant and ginseng soil

施藥60 d后，白山試驗點人參植株樣品中仲丁靈的殘留量為0.36 mg/kg，消解率達到了88.7%；遼寧桓仁試驗點人參植株樣品中仲丁靈的殘留量為0.28 mg/kg，消解率達到了88.7%。仲丁靈在吉林白山和遼寧桓仁的人參植株樣品中半衰期分別為11.80 d和 10.81 d。

徐月明等報道仲丁靈在土壤中的半衰期為9.04～11.17 d[27]，李義強等報道仲丁靈在煙葉中的半衰期為5.2～12.2 d[28]，本研究中仲丁靈在人參植株中的半衰期與其結果相近，但在人參土壤中的半衰期卻相對較長，可能的原因是：一方面人參植株本身的生長發(fā)育狀況和理化特性對仲丁靈的降解有一定的影響；另一方面，不同的氣候條件、土壤中微生物的種類與數(shù)量、有機質(zhì)的含量影響農(nóng)藥在土壤中降解[29]，也使得處于不同地理位置的試驗點的半衰期有一定差異。

2.5 仲丁靈在人參中的最終殘留量

2019年在吉林省延吉市、白山市、撫松縣和遼寧省桓仁縣進行的1年4地的最終殘留試驗結果 (表5) 表明，48%仲丁靈乳油在人參出苗前，以制劑量3 750 g/hm2(有效成分1 800 g/hm2) 施藥1次，仲丁靈在鮮人參中的最終殘留量為

表5 仲丁靈在人參及人參土壤中的最終殘留量Table 5 Terminal residues of butralin in ginseng and ginseng soil

3 結論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定鮮人參、干人參、人參植株及人參土壤中仲丁靈殘留的分析方法。研究了仲丁靈在人參中的消解動態(tài)和最終殘留量。該方法采用NH2固相萃取柱凈化，鮮人參、干人參在0.01、0.05和0.5 mg/kg，人參植株和人參土壤在0.01、0.05、0.5和10 mg/kg添加水平下，仲丁靈的回收率為93%～108%，相對標準偏差為0.6%～6.2%，滿足農(nóng)藥殘留分析檢測的要求。

2019年仲丁靈在人參中的消解動態(tài)和最終殘留試驗結果表明，仲丁靈在人參及其土壤中的半衰期為10.81～18.91 d，屬于易降解農(nóng)藥 (t1/2<30 d)。收獲期仲丁靈在鮮人參中的最終殘留量為