新疆寒冷地區(qū)腐木中產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與低溫產(chǎn)酶特性

馮欣欣，李鳳蘭，徐永清，李 磊，賀付蒙，馮艷忠，袁 強(qiáng)，*，劉 娣，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

農(nóng)作物秸稈富含纖維素，它是一種具有巨大開發(fā)潛力的可再生生物資源，東北地區(qū)作為我國(guó)的重要農(nóng)作物種植區(qū)之一，每年會(huì)形成大量的農(nóng)作物秸稈，受到低溫的影響，秸稈的酵解在自然條件下無(wú)法實(shí)現(xiàn)，秸稈不能正常還田，造成秸稈資源的巨大浪費(fèi)[1]。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能夠降解秸稈纖維素的微生物有200種以上[2]，產(chǎn)纖維素酶的微生物在真菌、細(xì)菌和放線菌等都有分布[3]。研究發(fā)現(xiàn)，能夠分泌纖維素酶的細(xì)菌包括纖維桿菌屬(Cellulomonas)和梭菌屬(Clostridium)等[4]；能夠分泌纖維素酶的真菌包括木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)等[4-7]；能夠分泌纖維素酶的放線菌包括纖維放線菌(Acidothermuscellulolyticus)[8]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[9]。高寒等極端環(huán)境中也存在產(chǎn)纖維素酶的微生物，如黃玉蘭等[10]從若爾蓋高寒地區(qū)篩選到了耐低溫的高效產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，在5 ℃時(shí)仍能保持56%的酶活性；王繼蓮等[11]從自東帕米爾高原布倫口湖群濕地中分離到一株高酶活低溫纖維素酶產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，10 ℃低溫條件下保持繁殖能力，在20 ℃，pH 7.0條件下發(fā)酵72 h，酶活性達(dá)到最大值28.7 U·mL-1。我國(guó)秸稈的綜合利用主要包括秸稈還田、秸稈造紙、秸稈發(fā)電等[12]。采用微生物發(fā)酵降解的方法，其降解還田有利于土壤有機(jī)質(zhì)的提高，增加土壤肥力，施加秸稈腐熟劑可以使秸稈腐解速度加快、使秸稈中的養(yǎng)分釋放到土壤中，增加土壤有益微生物的數(shù)量，改善土壤理化性質(zhì)[13-15]，還能有效降低秸稈直接還田給農(nóng)作物帶來(lái)的危害[16]。因此，通過篩選出在低溫下具有較強(qiáng)纖維素降解能力的菌種，對(duì)秸稈進(jìn)行生物酵解，實(shí)現(xiàn)對(duì)秸稈的合理利用并進(jìn)行秸稈的生物發(fā)酵，具有重要的前景和研究?jī)r(jià)值。

阿勒泰地區(qū)，位于新疆北部，冬季漫長(zhǎng)且寒冷，年均氣溫0.2～4 ℃，1981—2017年平均氣溫為4.9 ℃，年極端最低溫度最低是2001年，為-41.7 ℃，因此，新疆阿勒泰地區(qū)獨(dú)特的氣候條件可能蘊(yùn)藏著豐富的低溫微生物[17]。以新疆阿勒泰地區(qū)寒冷地區(qū)(冬季最低溫度可以達(dá)到-45 ℃)腐爛的云杉樹干為試驗(yàn)材料，篩選低溫條件下產(chǎn)纖維素酶的高效菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定；探討這些菌株的耐冷性及產(chǎn)纖維素酶的影響因素，并進(jìn)行酵解試驗(yàn)，確定其分解秸稈的能力，通過以上研究為寒地秸稈腐熟菌劑的菌種篩選及秸稈腐熟技術(shù)應(yīng)用提供實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新疆阿勒泰地區(qū)最高峰海拔在4 000 m以上，冬季最低溫度可達(dá)-45 ℃。本研究以新疆阿勒泰地區(qū)海拔2 300 m的腐爛云杉樹樹干為材料(圖1)，進(jìn)行低溫腐熟菌篩選。秸稈采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。

圖1 腐爛的云杉樹樹干Fig.1 Rotten trunk of spruce trees

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 新疆寒冷地帶腐爛云杉樹樹干中菌株的分離、初篩

菌株的分離。將樣品采用梯度稀釋分離法依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度樣品溶液。將樣品溶液均勻涂布至整個(gè)平板，觀察各梯度菌株生長(zhǎng)狀況，進(jìn)行分離純化，得到單菌落。

菌株的初篩。采用不同溫度對(duì)富集分離的菌株進(jìn)行初篩，分別在4、10、15、25和37 ℃培養(yǎng)所分離的菌株，觀察菌株生長(zhǎng)情況，篩選出能在低溫條件下正常生長(zhǎng)的菌株。

1.2.2 低溫條件下產(chǎn)纖維素酶菌的復(fù)篩

將初篩獲得的可在低溫條件下生長(zhǎng)的菌株接

種在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基上透明圈大小，計(jì)算透明圈與菌株直徑之比，其可反映酶濃度的相對(duì)高低[18]。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶菌的鑒定

將復(fù)篩得到的真菌菌株分別接種于PD培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，待菌絲長(zhǎng)出后，觀察菌落及菌斑的形狀和外觀，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲及分生孢子形態(tài)。菌株 DNA 提取采用專用的基因組DNA提取試劑盒。DNA提取成功后，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并檢測(cè)純度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠谜婢b定的ITS序列通用引物ITS1/ITS4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序獲得的序列輸入GenBank中，利用BLAST比對(duì)，進(jìn)行序列同源性分析，并采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)真菌的種屬進(jìn)行分子鑒定。

1.2.4 產(chǎn)纖維素酶菌的耐冷性鑒定

將前期篩選和鑒定后獲得的低溫產(chǎn)纖維素酶的真菌接種于PDA培養(yǎng)基，記錄菌株在4、10、15、20、25、30和35 ℃的培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況，確定篩選的菌株的耐冷性。

1.2.5 產(chǎn)纖維素菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，依次對(duì)培養(yǎng)基氮源(蛋白胨、酵母膏、硫酸銨和尿素)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、培養(yǎng)基初始pH(4、5、6、7、8、9、10)、溫度(10、15、20、25、30、35、40 ℃)及培養(yǎng)時(shí)間(3、6、9、12、15、18 d)進(jìn)行優(yōu)化，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)7 d時(shí)，測(cè)定纖維素酶活性，確定最佳因素且后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)均在前一單因素實(shí)驗(yàn)的較優(yōu)結(jié)果上進(jìn)行。

纖維素酶(CMC)活性測(cè)定。先制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的0.1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于干凈的試管中，用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL，再加入DNS顯色液1.5 mL，沸水浴10 min后冷卻，并用蒸餾水定容至15 mL，混勻后540 nm下測(cè)定其吸光值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)制作曲線并建立回歸方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程是y=1.189 2x-0.058 4，R2=0.996 7。由回歸方程得出，吸光度和葡萄糖含量之間相關(guān)性良好。

CMC活性測(cè)定采用DNS法，將1.8 mL 1% CMC溶液置于干凈的試管中50 ℃水浴預(yù)熱5 min，加入0.2 mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)反應(yīng)酶液50 ℃反應(yīng)30 min，然后立即加入2 mL DNS試劑，置于沸水浴中顯色10 min，冷卻后用蒸餾水定容至15 mL，混勻后在540 nm處比色測(cè)定吸光度。在上述反應(yīng)條件下，1 min反應(yīng)水解生產(chǎn)1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活性單位(U·mL-1)。

1.2.6 低溫產(chǎn)纖維素菌酵解試驗(yàn)

秸稈培養(yǎng)基酵解試驗(yàn)。先將所取的秸稈剪成2 cm小段后用水浸泡過夜后烘干，稱取5 g秸稈段放入到250 mL三角瓶中，加入(NH4)2SO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g，每瓶加5 mmol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)15 mL。每瓶分別加入各菌株2 mL的菌懸液，用不接菌的作為對(duì)照組，混勻后置于20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置3組重復(fù)，10 d測(cè)定降解率(D)。用無(wú)菌蒸餾水洗去菌體和孢子，過濾，將剩余物置于105 ℃烘箱中烘干至恒重，用電子天平稱量未被降解的秸稈質(zhì)量記為m1(g)，發(fā)酵前的質(zhì)量記為m0(g)，則降解率D(%)=(m0-m1)/m0×100。

秸稈小盆酵解試驗(yàn)。將玉米秸稈、水稻秸稈和大豆秸稈分別剪成2 cm左右的秸稈段，裝入小盆中，用無(wú)菌水浸泡1 d后，加入所篩選出的低溫產(chǎn)纖維素酶菌株，分別等體積添加到各小盆中，每組設(shè)置3組重復(fù)，放到20 ℃環(huán)境中，保持水分充足，每天進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其降解率，計(jì)算方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果均采用Microsoft Excel錄入，并作圖。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別相應(yīng)的采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的篩選

2.1.1 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的初篩

對(duì)新疆樹木中的微生物進(jìn)行了6次分離和純化，共獲得了21個(gè)菌株。在不同溫度培養(yǎng)條件下，對(duì)分離的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，進(jìn)行低溫產(chǎn)纖維素的初篩(表1)。結(jié)果表明，篩選出的能夠在4 ℃低溫條件下正常生長(zhǎng)的菌株共有10株。其中，細(xì)菌4株，分別命名為F1、F2、D1、D4；真菌6株，分別為P1、P4、N5、T2、T7、T8。

表1 低溫產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩結(jié)果Table 1 Screening results of low temperature cellulase producing strains

2.1.2 低溫產(chǎn)纖維素酶菌株的剛果紅培養(yǎng)基復(fù)篩

對(duì)初篩得到的能在低溫條件下正常生長(zhǎng)的10株菌通過CMC-剛果紅固體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，通過培養(yǎng)基上的透明圈及透明圈直徑大小確定其產(chǎn)纖維素酶能力。結(jié)果表明，只有真菌P1、T2、N5、T8菌株能在剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈(圖2)，透明圈直徑與菌落直徑之比分別為2.54、2.05、1.35、2.32，而其他4株細(xì)菌和2株真菌沒有產(chǎn)生透明圈。

2.2 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的形態(tài)學(xué)觀察

將篩選出的4個(gè)產(chǎn)纖維素真菌P1、T2、N5、T8在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落及菌體顯微形態(tài)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基上都形成單一的真菌菌落。菌株P(guān)1的菌落呈藍(lán)綠色，具輻射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，質(zhì)地絨狀(圖3-A)。菌株T2的菌落呈黃白色，邊緣菌絲體為白色，質(zhì)地絨狀(圖3-B)。菌株N5菌落呈淡黃色和白色，質(zhì)地絨狀(圖3-C)。菌株T8菌落呈白色，質(zhì)地絨狀，邊緣菌絲體呈白色(圖3-D)。各菌體顯微形態(tài)見圖4。

A，P1；B，T2 ；C，N5；D，T8.圖2 產(chǎn)纖維素酶真菌CMC-剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)纖維素菌的透明圈Fig.2 Transparent circle of cellulose producing fungi on CMC-Congo red medium

2.3 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的分子鑒定

通過真菌ITS序列分析，對(duì)篩選獲得的產(chǎn)纖維素菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，其中，真菌菌株P(guān)1、

A，P1；B，T2 ；C，N5；D，T8.圖3 產(chǎn)纖維素真菌的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of the cellulose producing fungi

A，P1；B，T2；C，N5；D，T8.圖4 產(chǎn)纖維素真菌的顯微形態(tài)Fig.4 Microscopic morphology of the cellulose producing fungi

T2、N5、T8擴(kuò)增獲得的ITS序列片段長(zhǎng)度分別為579、626、581和609 bp。

將獲得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖5-圖8所示。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，確定P1為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)，T2、T8為桔綠木霉(Trichodermacitrinoviride)，N5為脈紋孢菌(Neurosporasitophila)，這個(gè)鑒定結(jié)果和前面的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

圖5 菌株P(guān)1基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain P1 based on 18S rDNA sequences homology

圖6 菌株T2基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain T2 based on 18S rDNA sequences homology

圖7 菌株T8基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain T8 based on 18S rDNA sequences homology

圖8 菌株N5基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain N5 based on 18S rDNA sequences homology

2.4 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的耐冷性鑒定

對(duì)篩選獲得的4個(gè)菌株進(jìn)行耐冷性鑒定。將篩選的真菌菌株P(guān)1、T2、T8和N5 接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其菌株生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，4個(gè)菌株在5 ℃時(shí)均可以生長(zhǎng)，耐冷性強(qiáng)。根據(jù)Morita的定義，耐冷微生物具有的特征為在0～5 ℃能夠生長(zhǎng)繁殖，最適生長(zhǎng)溫度在15 ℃以上，最高生長(zhǎng)溫度高于20 ℃。本試驗(yàn)篩選獲得的4個(gè)產(chǎn)纖維素菌株均為耐冷微生物，可以在北方低溫地區(qū)正常生長(zhǎng)。

2.5 低溫產(chǎn)纖維素酶菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 最佳氮源篩選

對(duì)篩選的4個(gè)低溫菌產(chǎn)纖維素酶的最佳氮源進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖9所示，由結(jié)果可以看出，4個(gè)真菌在以蛋白胨和酵母膏為氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)纖維素酶的活性較高，而在添加硫酸銨和尿素作物氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)生纖維素酶的活性較低，差異顯著。綜合比較結(jié)果，適合于4種低溫產(chǎn)纖維素菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)最佳氮源為蛋白胨。

2.5.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.圖9 不同氮源對(duì)4菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of differernt nitrogen fountains on cellulase production of four strains

對(duì)篩選的4個(gè)低溫菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)最佳接種量進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖10所示。由結(jié)果可以看出，接種量的不同會(huì)影響真菌產(chǎn)纖維素酶的活性，隨著接種量的增加，低溫產(chǎn)纖維素酶的活性呈現(xiàn)先急劇上升再緩慢下降的趨勢(shì)，在接種量為3%～9%時(shí)，4個(gè)真菌都具有較高纖維素酶活性，接種量為5%時(shí)，都具有最高的產(chǎn)酶活性，接種量超過5%后，酶活性開始下降。綜合比較結(jié)果，4種低溫菌產(chǎn)纖維素酶的最佳接種量均為5%。

圖10 不同接種量對(duì)4菌株產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of different inoculum on cellulase production of four strains

2.5.3 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖11可知，4種菌株在10～25 ℃時(shí)酶活性逐漸增加，到25 ℃時(shí)酶活性最高，超過25 ℃酶活性開始呈顯著下降，40 ℃時(shí)4個(gè)菌株的產(chǎn)酶活性都降到最低。綜合比較結(jié)果，確定4種低溫菌產(chǎn)纖維素酶的最佳溫度為25 ℃。

圖11 不同溫度對(duì)4菌株產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of different temperature on cellulase production of four strains

2.5.4 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖12可看出，液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基初始pH對(duì)篩選的4個(gè)真菌菌株產(chǎn)纖維素酶活性影響較大。過酸或過堿的環(huán)境纖維素酶活性都很低，4種菌在pH值為3時(shí)，酶活性降到了最低，幾乎無(wú)法檢出纖維素酶活性。培養(yǎng)基初始pH在6～8時(shí)，4種菌株的纖維素酶活性都表現(xiàn)為較高的水平，在初始pH為7時(shí)，纖維素酶活性最高，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH升至8時(shí)，4個(gè)菌的產(chǎn)酶活性都呈下降趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)篩選的低溫產(chǎn)纖維素菌的產(chǎn)酶最佳初始pH為7，中性溶液環(huán)境有利于其產(chǎn)酶。

圖12 不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)4菌株產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effect of initial pH on cellulase production of four strains

2.5.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖13可以看出，4種菌株的產(chǎn)酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)為先呈現(xiàn)快速上升，然后緩慢下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)9 d的時(shí)候，都具有最好的產(chǎn)酶活性，12 d后纖維素酶活性逐漸降低，呈現(xiàn)為顯著性差異，但仍具有較強(qiáng)的酶活。綜合比較結(jié)果，確定4種低溫菌產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間為9 d。

圖13 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)4菌株產(chǎn)酶的影響Fig.13 Effect of incubating time on cellulase production of four strains

2.6 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的秸稈酵解效果

將本試驗(yàn)篩選獲得的4個(gè)低溫產(chǎn)纖維素酶菌接種到玉米秸稈培養(yǎng)基中進(jìn)行秸稈酵解試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，隨著酵解時(shí)間的延長(zhǎng)，4種菌可以有效進(jìn)行玉米秸稈酵解。秸稈小盆酵解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酵解15 d時(shí)，玉米秸稈失重率最大，達(dá)到了40%以上(圖15)。綜上，本試驗(yàn)篩選的4個(gè)低溫產(chǎn)纖維素酶菌對(duì)秸稈具有酵解作用。

圖14 四種真菌菌株酵解玉米秸稈的失重率Fig.14 Weight loss rate of corn straw fermented by four fungal strains

圖15 四種真菌菌株酵解不同秸稈的失重率Fig.15 Weight loss rate of different straws fermented by four fungal strains

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫產(chǎn)纖維素酶菌的篩選

在低溫菌篩選過程中，通過把初篩的菌種接到相適應(yīng)的培養(yǎng)基后，放入到低溫環(huán)境中觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，如果能夠正常生長(zhǎng)，則表明其具有耐低溫的能力[19]。王玢等[20]從黃海的深海海底泥樣中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的海洋細(xì)菌，初步鑒定為革蘭氏陰性桿菌，此菌最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃，最高生長(zhǎng)溫度為40 ℃，但把其放在0 ℃條件下，也能正常生長(zhǎng)，確定其為嗜冷菌。黃玉蘭等[10]從若爾蓋高寒濕地土壤中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株為缺陷短波單胞菌(XW-1)，最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃，15 ℃時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到80%，在5 ℃時(shí)仍然具有較高產(chǎn)酶特性。本實(shí)驗(yàn)選用新疆高寒地區(qū)的腐爛云杉樹干為試驗(yàn)材料，篩選得到產(chǎn)纖維素酶的真菌，這些真菌雖然最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，但是在4 ℃低溫條件下，依然能夠正常生長(zhǎng)，為典型的低溫菌。

在低溫菌復(fù)篩過程中采用的CMC-剛果紅培養(yǎng)基篩選的方法，該方法是利用剛果紅可以和結(jié)構(gòu)中含有β-1，4-D-吡喃型葡萄糖的多糖發(fā)生反應(yīng)，形成顏色濃郁的多聚糖-剛果紅復(fù)合物，在微生物培養(yǎng)過程，會(huì)分泌纖維素酶分解纖維素，產(chǎn)生葡萄糖，這個(gè)過程會(huì)減少多聚糖-剛果紅復(fù)合物的產(chǎn)生形成透明圈，因此，通過是否產(chǎn)生透明圈，可以初步判定是否有纖維素降解菌的的存在。在本試驗(yàn)中，對(duì)篩選的10株低溫菌進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)接種在剛果紅培養(yǎng)基上后，有的能夠正常生長(zhǎng)，且菌落較大，卻沒有產(chǎn)生降解圈或降解圈太小太暗。只有4株真菌產(chǎn)生了透明圈，表明其可以產(chǎn)生纖維素酶，但是，降解圈的大小只能在一定程度上反映產(chǎn)纖維素的能力，具體產(chǎn)纖維素酶的活性還需要進(jìn)行酶活性測(cè)定。

3.2 低溫產(chǎn)纖維素酶菌最佳產(chǎn)酶條件的篩選

同一株菌株在不同的條件下，其生長(zhǎng)代謝速率和產(chǎn)酶效果不同。2013年穆春雷[21]從秸稈還田土壤中分離出一株在13 ℃低溫環(huán)境下高效分解纖維素的草酸青霉(M11)，該酶最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為20 ℃，在5～20 ℃時(shí)酶活性仍能保持在90%以上。2015年邵娜娜等[22]從內(nèi)蒙古大青溝采集的森林土壤中分離了1株產(chǎn)纖維素酶的耐低溫菌為鏈霉菌屬的放線菌(ND2-1)，該菌株產(chǎn)纖維素酶在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，且酶活性都較高，最適反應(yīng)pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為30 ℃，K+和Cu2+對(duì)酶活性有抑制作用，Mn2+能提高相對(duì)酶活性至166.7%。本實(shí)驗(yàn)選取了培養(yǎng)基氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH和菌株接種量，5個(gè)影響低溫菌產(chǎn)纖維素酶活性的因素，探討了篩選的菌種的產(chǎn)酶條件，表明本實(shí)驗(yàn)篩選的菌種可以在較低的溫度下產(chǎn)纖維素酶，并且受pH值的影響較大，中性條件下更適合其產(chǎn)酶，表明這些菌在應(yīng)用中具有廣泛性。

3.3 低溫菌秸稈酵解分析

秸稈在酵解過程中，通過酶的作用下，秸稈的質(zhì)量會(huì)發(fā)生改變。王元明[23]篩選出兩株高效纖維素降解的放線菌(F1、F2)，研究表明，在50 ℃條件下，采用這些菌單獨(dú)處理秸稈10 d后，其失重率都在20%以上，采用兩株菌混合培養(yǎng)液對(duì)水稻秸稈進(jìn)行降解時(shí)，其失重率可以達(dá)到31.27%。段杰[24]獲得了3株纖維素降解能力比較高的菌株，其中2株為木霉屬，1株為青霉屬。進(jìn)行了菌株酵解試驗(yàn)表明，通過構(gòu)建混合菌系降解秸稈的失重率可以達(dá)到 34.52%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的低溫產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行了秸稈酵解試驗(yàn)，結(jié)果表明，本研究篩選獲得的菌株在低溫條件下都具有酵解秸稈的能力，并且，這些菌株對(duì)玉米秸稈、大豆秸稈和水稻秸稈都具有酵解作用，不同菌株對(duì)秸稈的作用有所差異，對(duì)玉米秸稈酵解效果最好，秸稈失重率都在40%以上，特別是枯綠木霉菌株(T2)對(duì)玉米秸稈的酵解能力最強(qiáng)，達(dá)到了47%以上。這些結(jié)果表明，本研究篩選的低溫菌可以應(yīng)用于纖維素含量較高的秸稈酵解。本實(shí)驗(yàn)只是選擇了3種秸稈材料進(jìn)行酵解試驗(yàn)，因此，還需要進(jìn)一步研究這些菌株對(duì)于其他類型的秸稈的酵解能力及田間的試驗(yàn)效果。