寧春4號×河東烏麥F2∶5家系遺傳圖譜構(gòu)建與籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL分析

王掌軍，姚明明，余慧霞，王彥青，李清峰，劉鳳樓，劉彩霞，張雙喜，張曉崗，劉生祥

(1.寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏農(nóng)林科學院 農(nóng)作物研究所，寧夏 銀川 750002)

小麥(TriticumaestivumL.)是一種適應(yīng)性強、分布廣泛的世界性糧食作物，是全球約35%～40%人口的主食，同時還是最重要的貿(mào)易糧食和國際援助糧食。在中國，小麥是僅次于玉米、水稻的第三大糧食作物。運用分子標記構(gòu)建小麥遺傳圖譜，進行相關(guān)性狀QTL(quantitative trait locus)分析是現(xiàn)代育種的遺傳基礎(chǔ)。1998年，R?der等[1]構(gòu)建了第1張小麥SSR(simple sequence repeats)遺傳圖譜，涵蓋了279個SSR位點；與此同時，Stephenson等[2]公布的SSR遺傳圖譜在R?der的基礎(chǔ)上新增53個位點。此后，國內(nèi)外學者先后利用不同的作圖群體構(gòu)建了多個小麥SSR遺傳圖譜[3-6]，這些遺傳圖譜在QTL位點發(fā)掘、比較作圖、圖位克隆與分子標記輔助選擇育種中發(fā)揮了重要作用。

目前，國內(nèi)已報道的小麥研究依然以產(chǎn)量為主要育種目標，對籽粒品質(zhì)研究重視程度不夠[7]。隨著生活水平的提高，人們對小麥品質(zhì)也提出了更高的要求。蛋白質(zhì)性狀為小麥籽粒品質(zhì)代表性狀，對其貢獻率較大[8-9]。粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間分別是蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量指標，而濕面筋含量與蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量均相關(guān)[10]。全球小麥蛋白質(zhì)含量為10.2%～21.46%，平均為14.35%[11]；美國優(yōu)質(zhì)小麥面筋含量、穩(wěn)定時間要求分別為36%～47%、(12±1.5)min[12]。目前，我國小麥蛋白質(zhì)含量平均值為13.94%，面筋含量為30.40%，穩(wěn)定時間為5.8 min，還不能滿足人們的需求[13]。蛋白質(zhì)含量是小麥營養(yǎng)品質(zhì)最重要的一項指標，蛋白質(zhì)的品質(zhì)由面筋含量、沉降值、流變學特性等加工品質(zhì)決定[14]。為此，我國小麥品質(zhì)改良不僅要提高籽粒的蛋白質(zhì)含量，也要改善和提高小麥加工品質(zhì)[15-16]。國內(nèi)外已有很多關(guān)于小麥蛋白質(zhì)含量與質(zhì)量QTL的研究報道[17-25]，但在育種上有利用價值的品質(zhì)性狀QTL凾有待研究和應(yīng)用，其中可用于分子標記輔助育種的標記更少[26]。隨著國內(nèi)市場對優(yōu)質(zhì)小麥需求的增加，對小麥蛋白質(zhì)數(shù)量與質(zhì)量相關(guān)的QTL研究方面越來越重視。余曼麗等[27]以H307與鄭麥9023創(chuàng)制的310個株系的重組自交系為材料，構(gòu)建了包含133個SSR標記的遺傳連鎖圖譜，其中8個SSR標記在2 a環(huán)境條件下檢測到6個粗蛋白含量QTL，單個QTL可解釋3.64%～12.19%的表型變異；其中，在1BL染色體上檢測到1個新的貢獻率為3.64%的籽粒粗蛋白含量微效QTL，并發(fā)掘了1個緊密連鎖的SSR分子標記gwm81。解樹斌[28]利用泰農(nóng)18×臨麥6號雜交后代184個家系的RIL群體，在構(gòu)建了包括90K SNP、57 500個DArT(diversity arrays technology)和15 000個SNP(single nucleotide polymorphism)標記的高密度遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)上，檢測到33個籽粒蛋白質(zhì)含量QTL，單個QTL可解釋表型變異的6.69%～15.52%，LOD值最大為7.3；24個穩(wěn)定時間QTL，單個QTL可解釋表型變異的3.43%～35.54%，LOD值最大為15.7。郭利建等[29]以西農(nóng)981和陜麥159構(gòu)建的169株F2群體和F2:3家系為材料，把55個SRAP(sequence related amplified polymorphism)和60個SSR標記成功定位到遺傳連鎖圖譜上，同時，利用10個SRAP和9個SSR標記檢測到11個粗蛋白含量QTL，可解釋表型變異的0.69%～2.48%；11個SRAP和10個SSR標記檢測到12個濕面筋含量QTL，可解釋表型變異的0.58%～2.37%；王掌軍等[30]利用在兩親本間具有多態(tài)性的49個SSR標記，對寧春4號與河東烏麥雜交F2代331個單株群體進行分析，3個SSR標記檢測到分別位于1B和5D染色體上的2個蛋白質(zhì)含量QTL，加性效應(yīng)分別為-0.42、0.23，LOD值均為7.60，表型貢獻率均為4%；在1B染色體上檢測到1個濕面筋含量QTL，加性效應(yīng)為-1.62，LOD值為9.40，表型貢獻率為5%。

針對寧夏小麥綠色優(yōu)質(zhì)高效品種選育存在的短板和產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的瓶頸，本課題組前期對寧夏主栽小麥品種寧春4號和引自山西運城的河東烏麥進行農(nóng)藝與品質(zhì)性狀研究，發(fā)現(xiàn)寧春4號綜合農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀優(yōu)異，而蛋白質(zhì)、濕面筋含量較低；河東烏麥表現(xiàn)為分蘗多、紫粒，蛋白質(zhì)與濕面筋含量較高[31]。本研究以寧春4號與河東烏麥雜交后代的248個F2∶5家系為材料，利用SSR分子標記構(gòu)建小麥遺傳圖譜并進行蛋白質(zhì)性狀QTL分析，旨在為小麥蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量主效QTL精細定位打下基礎(chǔ)，也為關(guān)鍵基因發(fā)掘與分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以籽粒粗蛋白質(zhì)、濕面筋含量和穩(wěn)定時間差異顯著(P<0.05)的寧春4號(♀)與河東烏麥(♂)為親本[31]，二者雜交得到F1代；根據(jù)F2代分離表現(xiàn)選擇248個單株，開花前套袋自交，每代選擇能夠代表本株系的單穗，通過單穗傳獲得F2∶5家系。其中，F(xiàn)3代在云南省元謀縣南繁基地加代繁殖獲得，其余世代均在寧夏大學教學實驗農(nóng)場繁殖獲得(寧夏銀川)。材料種植：單粒點播，每行10粒，行長1.1 m，行寬0.2 m。管理水平同大田。

1.2 小麥籽粒蛋白質(zhì)性狀的測定

用瑞典Perton公司DA7200型近紅外分析儀[32]測定小麥籽粒粗蛋白質(zhì)含量(%)、穩(wěn)定時間(min)和濕面筋含量(%)，每個株系分別收獲、脫粒、保存。取樣本30 g，5次重復，在國家小麥改良中心西北分中心(寧夏銀川)測試。小麥近紅外校準曲線由中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心建模，由國家小麥改良中心西北分中心校正，結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動分析。

1.3 小麥蛋白質(zhì)性狀的分子標記分析

基因組DNA的提取采用SDS(十二烷基磺酸鈉)法[33]。利用定位于普通小麥7個部分同源群上的747個SSR標記，包括Xbarc系列、Xcfa系列、Xcfb系列、Xcfd系列、Xgdm系列、Xgpw系列、Xpsp系列和Xwmc系列，由南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室細胞遺傳所提供標記信息。本研究用能夠在寧春4號與河東烏麥間穩(wěn)定擴增的多態(tài)性SSR標記進行遺傳圖譜構(gòu)建，其中，粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間、濕面筋含量有明確QTL定位結(jié)果的22個標記名稱與序列見表1。以上標記由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和擴增程序參見王掌軍等[34]的方法，擴增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，180 V電泳約1.5 h，銀染后觀察、照相，并統(tǒng)計擴增結(jié)果。

表1 分子標記序列信息Table 1 Information of molecular marker sequences

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013對籽粒蛋白質(zhì)性狀和分子標記擴增結(jié)果進行統(tǒng)計。利用Origin 8.0對各蛋白質(zhì)性狀的頻率分布進行作圖。建立作圖家系的SSR標記數(shù)據(jù)庫：與母本相同的帶型記為B，與父本相同的記為A，雜合帶型記為H，缺失帶型記為-；用QTL IciMapping 3.0軟件分析原始數(shù)據(jù)并劃分連鎖群，計算各標記間的遺傳距離，并利用Mapchart 2.2繪制連鎖遺傳圖譜；將248個F2∶5家系的分子標記結(jié)果與蛋白質(zhì)性狀數(shù)據(jù)相結(jié)合，運用MapManager QTXb 20軟件檢測相關(guān)QTL位點并定位，取概率值P<0.05的LOD值作為判斷QTL存在的閾值；利用Kosambi函數(shù)中單標記回歸分析方法進行QTL分析，QTL命名方法為：q+目標性狀英文大寫字母縮寫+所在染色體，如1A染色體上與粗蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL位點命名為qCPC1A。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧春4號×河東烏麥F2∶5家系遺傳圖譜構(gòu)建

利用在兩親本間具有多態(tài)性的SSR標記構(gòu)建小麥遺傳圖譜，結(jié)果見圖1。197個標記被成功連鎖到小麥21條染色體上，覆蓋染色體總長度為2 342.63 cM，標記間平均遺傳距離為11.89 cM。就每個染色體組來看，組間標記數(shù)分布不平衡：A組標記共66個，占總標記數(shù)33.50%，總長520.65 cM，平均間距7.89 cM；B組標記共80個，占總標記數(shù)40.61%，總長1 168.49 cM，平均間距14.61 cM；D組標記共51個，占總標記數(shù)25.89%，總長653.49 cM，平均間距12.81 cM。就單條染色體而言，3B、2B、1B染色體標記數(shù)覆蓋位居前3位，分別為18、18、17個標記，覆蓋長度分別為282.24、228.77、259.47 cM，平均間距分別為15.68、12.71、15.26 cM；1D染色體覆蓋標記數(shù)最少，為5個標記，長度為88.80 cM，平均間距17.76 cM。A組中2A平均圖距最小，為6.09 cM，最長為7A，長10.32 cM；B組中5B平均圖距最小，為11.05 cM，最長為4B，長17.99 cM；D組中7D平均圖距最小，為5.17 cM，也是所有染色體的最短圖距，最長為2D，長27.36 cM，也是所有染色體的最長平均圖距。

圓形表示粗蛋白質(zhì)含量，三角形表示穩(wěn)定時間，菱形表示濕面筋含量。Circular represented crude protein content， triangle represented stabilization time， and rhombus represented wet gluten content.圖1 小麥遺傳圖譜與蛋白質(zhì)性狀QTL在染色的位置Fig.1 Genetic map and position of QTLs associated with protein traits in wheat chromosomes

2.2 寧春4號×河東烏麥F2∶5家系籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL分析

對寧春4號與河東烏麥雜交248個F2∶5家系籽粒粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間、濕面筋含量進行分析，結(jié)果見圖2：蛋白質(zhì)性狀在F2∶5家系出現(xiàn)較大分離，分布呈連續(xù)正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特點，并且出現(xiàn)了許多具有超親性狀的家系。

圖2 寧春4號與河東烏麥雜交F2∶5家系籽粒蛋白質(zhì)性狀頻率分布Fig.2 Frequency distribution of grain protein traits in F2∶5 pedigrees of Ningchun No.4 × Hedong black wheat

對F2∶5家系蛋白質(zhì)性狀變異性進行分析，結(jié)果見表2。粗蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量的群體平均值介于雙親該性狀之間，穩(wěn)定時間的群體平均值超過高親。其中，粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間、濕面筋含量的超中親比例分別達50.81%、77.82%、50.00%，超高親比例分別達21.77%、59.27%、22.98%。變異系數(shù)表現(xiàn)為穩(wěn)定時間(10.64%)>濕面筋含量(1.29%)>粗蛋白質(zhì)含量(1.04%)。另外，對F2∶5家系蛋白質(zhì)性狀相關(guān)性進行分析，3個指標間均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)排序為粗蛋白質(zhì)含量與濕面筋含量(0.98)>粗蛋白質(zhì)含量與穩(wěn)定時間(0.81)>濕面筋含量與穩(wěn)定時間(0.78)。

表2 寧春4號與河東烏麥雜交F2∶5家系籽粒蛋白質(zhì)性狀變異分析Table 2 Variation analysis of grain protein traits in F2∶5 pedigrees of Ningchun No.4 × Hedong black wheat

2.3 寧春4號×河東烏麥F2∶5家系籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL分析

利用197個SSR標記對F2∶5家系進行檢測，結(jié)果見表3。有22個標記共檢測到36個籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL，涉及1A、2A、3A、5A、7A、1B、2B、6B、1D、2D、3D、4D、5D、6D、7D等15條染色體(圖1)。36個QTL的LOD值最大為14.9，表型貢獻率為3%～6%，加性效應(yīng)為-1.71～1.17。其中，檢測到14個粗蛋白質(zhì)含量QTL，分布在1A、2A、3A、5A、7A、1B、2B、2D、3D、4D、5D、6D、7D染色體上，LOD值最大為14.9，表型貢獻率為4%～6%，加性效應(yīng)為-0.51～0.29；6個穩(wěn)定時間QTL，分布在2A、3A、5D、6D染色體上，LOD值最大為12.2，表型貢獻率為3%～5%，加性效應(yīng)為-1.71～1.17；16個濕面筋含量QTL，分布在1A、3A、5A、7A、1B、2B、6B、1D、2D、3D、4D、5D、6D、7D染色體上，LOD值最大為14，表型貢獻率為3%～5%，加性效應(yīng)為-1.22～0.54。標記Xwmc385(1A)、Xgwm249(2A)、Xwmc410(5A)、XbarcM139(2B)、Xmag1241(2D)、Xgdm8(3D)、Xgpw2220(4D)、Xbarc320(5D)、Xgpw8188(7D)同時檢測到粗蛋白質(zhì)和濕面筋含量QTL，Xbarc177(3A)和Xcfb49(6D)同時檢測到粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間和濕面筋含量QTL，說明這11個標記所在的位點存在蛋白質(zhì)性狀QTL富集區(qū)。

表3 寧春4號與河東烏麥雜交F2∶5家系籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL定位結(jié)果Table 3 QTL location of grain protein traits in F2∶5 pedigrees of Ningchun No.4 × Hedong black wheat

3 結(jié)論與討論

小麥分子遺傳圖譜的構(gòu)建是進行其基因組分析和研究表型變異的基礎(chǔ)之一。作圖親本的選擇關(guān)系到遺傳圖譜的準確性和適用性，親本間遺傳差異是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)，親本間親緣關(guān)系遠，遺傳差異大，較容易獲得數(shù)量豐富的標記位點[35]。本研究所用親本寧春4號是寧夏回族自治區(qū)乃至北方春麥區(qū)一個種植近40 a的小麥品種，它從組合‘阿勃(意大利)/碧玉麥(澳大利亞)//索諾拉64(墨西哥)’的后代中經(jīng)多代選育，表現(xiàn)為春性、大穗、紅粒、千粒重高等特點；河東烏麥是山西省農(nóng)業(yè)科學院用硬粒小麥86243、87W005/T型恢復系7EB87遠緣雜交選育而成，屬于半冬性小麥，具有分蘗力強、紫粒、穗粒數(shù)多、千粒重高、蛋白質(zhì)和面筋含量高等特點[31]。兩親本遺傳基礎(chǔ)均較豐富，在蛋白質(zhì)性狀方面具有明顯差異，這樣雜交后代的高世代群體可有效用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，同時，遺傳圖譜的實效性隨圖譜標記密度的增加而提高。本研究用197個SSR標記構(gòu)建了一張總長度為2 342.63 cM的遺傳圖譜，標記間平均遺傳距離為11.89 cM。今后凾待進一步加密標記(尤其應(yīng)用新型標記)，縮短標記在染色體上的圖距，有助于QTL位點精準識別、比較作圖、分子標記輔助選擇育種等工作。

小麥品質(zhì)優(yōu)劣直接影響到人類的生活水平，培育優(yōu)質(zhì)小麥，增強中國小麥在國際市場中的競爭力刻不容緩。一個小麥品種品質(zhì)的優(yōu)劣是對不同地區(qū)、不同食品而言的，即適合的品種才是優(yōu)質(zhì)品種[36]。有研究表明，以蛋白質(zhì)含量和籽粒硬度作為選擇指標，有利于篩選出高面筋含量、高沉淀值，以及蛋白質(zhì)品質(zhì)和磨粉品質(zhì)優(yōu)良的基因型[37]。蛋白質(zhì)性狀為小麥品質(zhì)代表性狀，不僅影響小麥營養(yǎng)品質(zhì)，也是小麥加工品質(zhì)的基礎(chǔ)，而粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間、濕面筋含量是蛋白質(zhì)性狀重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)性狀在F2∶5家系出現(xiàn)較大分離，為多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳，變異系數(shù)從大到小依次表現(xiàn)為穩(wěn)定時間、濕面筋含量、粗蛋白質(zhì)含量，分別為10.64%、1.29%、1.04%，說明穩(wěn)定時間變異系數(shù)較大；這與前人研究結(jié)果一致[38-40]，一般認為穩(wěn)定時間越長，面粉筋力越強，韌性越好，它與小麥的實用性密切相關(guān)。248個家系中穩(wěn)定時間的遺傳基礎(chǔ)最豐富，可選擇范圍大，且改良空間和育種潛力也較大[41]；濕面筋與粗蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)均較小，符合杭雅文等[42]的研究結(jié)果，而姜朋等[43]與柴永峰等[44]認為，籽粒蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量的變異系數(shù)較大，不同研究結(jié)果的出現(xiàn)推測其主要與材料數(shù)量、栽培條件和測試手段有關(guān)。已有研究表明，粗蛋白質(zhì)含量與濕面筋含量、穩(wěn)定時間呈極顯著或顯著正相關(guān)[39，45-47]，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。另外，還發(fā)現(xiàn)濕面筋含量與穩(wěn)定時間也呈極顯著正相關(guān)。根據(jù)本研究中蛋白質(zhì)性狀間的相關(guān)性，說明這3個性狀對小麥蛋白質(zhì)性狀貢獻較大，在遺傳改良實踐中，建議選擇粗蛋白質(zhì)含量較高的品種以增加蛋白質(zhì)數(shù)量，選擇穩(wěn)定時間較長的品種提高蛋白質(zhì)品質(zhì)，進而促進蛋白質(zhì)數(shù)量和品質(zhì)的提升。

小麥蛋白質(zhì)性狀為典型的數(shù)量性狀，受多基因控制，分子標記和QTL定位技術(shù)為數(shù)量性狀的分子檢測提供了有效方法。如，Bordes等[48]在小麥15條染色體上關(guān)聯(lián)到14個籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)的分子標記；Reif等[49]在小麥4條染色體上關(guān)聯(lián)到4個籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)的分子標記。目前，小麥籽粒蛋白質(zhì)性狀QTL研究已有許多報道，總結(jié)前人蛋白質(zhì)性狀QTL定位結(jié)果，蛋白質(zhì)含量QTL在除5B和3D之外的19條染色體上都有定位結(jié)果[23，27-30，50-56]，濕面筋含量QTL在2A、2D～6D等染色體上未見報道[29-30，52，57-59]，穩(wěn)定時間QTL主要定位在1A、4A、5A、6A、7A、1B、2B、3B、4B、5B、7B、1D、4D、7D等染色體上[28，60]。本研究定位到的36個蛋白質(zhì)性狀QTL，多數(shù)都已經(jīng)有染色體定位結(jié)果，說明在這些染色體上的確存在控制籽粒蛋白質(zhì)性狀的QTL。除此之外，本研究還在2D(1個)和3D(1個)染色體上檢測到蛋白質(zhì)含量QTL，在2A(1個)、2D(1個)、3D(1個)、4D(1個)、5D(1個)和6D(2個)染色體上檢測到濕面筋含量QTL，在2A(3個)、3A(1個)、5D(1個)和6D(1個)染色體上檢測到穩(wěn)定時間QTL，可能為具有調(diào)控小麥籽粒蛋白質(zhì)性狀新位點，為小麥蛋白質(zhì)性狀QTL的發(fā)掘和定位提供了補充。此外，本研究有9個位于不同染色體的SSR標記均同時關(guān)聯(lián)到粗蛋白質(zhì)和濕面筋含量QTL，2個位于不同染色體的SSR標記分別同時關(guān)聯(lián)到粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間和濕面筋含量QTL，這11個標記為發(fā)掘蛋白質(zhì)性狀QTL富集區(qū)提供了分子檢測手段。值得注意的是，LOD值直接影響QTL的可信度，當LOD值過低時，表示QTL存在的可靠性不高；本研究所用到的軟件對QTL存在統(tǒng)計量的設(shè)置，當LOD值≥12時，表示有可靠的QTL。據(jù)此，結(jié)合本研究結(jié)果與QTL存在的可信度，3A染色體上標記Xbarc177同時檢測到粗蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時間和濕面筋含量QTL，LOD值為12.2～14.9，表型貢獻率為5%～6%；6D染色體上標記Xcfd49也同時檢測到這3個性狀QTL，LOD值為11.4～12.5，表型貢獻率均為5%，今后將重點加強3A和6D這2條染色體蛋白質(zhì)性狀QTL富集區(qū)的研究。雖然關(guān)于蛋白質(zhì)性狀相關(guān)的分子標記和QTL研究很多，但是真正能對小麥遺傳改良發(fā)揮重要作用的標記和QTL還凾待開發(fā)研究與應(yīng)用。在后續(xù)的研究工作中，可以開發(fā)篩選在標記輔助選擇育種中有利用價值的分子標記，特別是功能型標記，對功能明顯、可信度和貢獻率高的QTL進行精細定位，明確其遺傳效應(yīng)方向并應(yīng)用于育種實踐，以滿足寧夏回族自治區(qū)小麥綠色優(yōu)質(zhì)高效品種選育和產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的需求。