八月瓜籽營養(yǎng)成分及對(duì)毛木耳菌絲生長的影響

鐘娟，梁光焰，汪建文，胡華林，孫超

1. 貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院（貴陽 550018）；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)，省部共建藥物植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽 550014）；3. 貴州科學(xué)院（貴陽 550001）

八月瓜（Akebia trifoliata）學(xué)名三葉木通，又稱羊開口、八月炸、野香蕉等，分布于海拔300～2100 m，氣候溫和濕潤的山林地帶，在我國貴州、云南、四川、湖南等地都有生長，其中以貴州銅仁、云南昭通、四川雅安、湖南張家界居多[1]。八月瓜是一種營養(yǎng)豐富食藥兩用水果，富含礦物元素、三萜類皂苷、維生素C、氨基酸、甾醇、有機(jī)酸、可溶性糖等[2-5]，素有“保健果王”之稱。八月瓜中藥名為預(yù)知子，具有抗菌消炎、活血止痛、抗腫瘤、抗抑郁等功能[6-8]。

八月瓜肉質(zhì)鮮嫩、甘甜可口，但其種籽較多，平均含籽約200顆/果。對(duì)八月瓜籽的脂肪酸、氨基酸成分及抗氧化、抗腫瘤活性等已開展研究。周瑜等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同種源預(yù)知子籽油的脂肪酸組成及含量存在差異。歐陽玉祝等[10]用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）測定八月瓜籽油脂肪酸組成與含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要為油酸（40.93%）和棕櫚酸（30.08%）。謝小霞等[11]和彭滌非等[12]在研究長江流域地區(qū)預(yù)知子籽油的脂肪酸組成時(shí)發(fā)現(xiàn)預(yù)知子籽油具備開發(fā)成新的營養(yǎng)保健油的潛力。史卿等[13]從八月瓜籽中獲得含17種氨基酸的蛋白質(zhì)。歐陽玉祝等[10]比較八月瓜籽油與VE、異VC-Na、BHT和芝麻油的自由基清除能力，結(jié)果表明八月瓜籽油的還原能力、H2O2和超氧陰離子自由基清除能力最強(qiáng)。Lu等[14]和任紅艷等[15]研究表明八月瓜提取物對(duì)抑制肝癌細(xì)胞增長具有顯著功效，尤其是八月瓜籽。然而，針對(duì)黔產(chǎn)八月瓜籽的營養(yǎng)成分、化學(xué)組成等鮮有報(bào)道，特別是，還未見八月瓜籽油在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

毛木耳營養(yǎng)豐富，味美可口，具有抗癌、清肺、益氣、止痛活血等功效。因此，試驗(yàn)以黔中引種八月瓜籽為原料，采用超聲提取法提取籽油，全自動(dòng)氨基酸分析儀測定游離氨基酸的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，GC-MS法測定揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成，進(jìn)而探究八月瓜籽油及其揮發(fā)性成分對(duì)毛木耳菌絲生長的影響，以期為八月瓜籽油的應(yīng)用拓寬領(lǐng)域，進(jìn)而為八月瓜籽資源的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

八月瓜籽（龍里縣恒遠(yuǎn)生態(tài)農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社）；毛木耳菌種（貴州省生物研究所）；棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（上海麥克林生化科技有限公司）；PDA培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液、檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液的氫氧化鋰再生液（德國Sykam公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HP6890/5975C型GC-MS聯(lián)用儀（Agilent）；HP-5MS型彈性石英毛細(xì)管柱（Agilent）；S433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，LCAK 06/Na型陽離子分析（Sykam）；AG 285型十萬分之一天平（Mettler Toledo）；Millipore-0026型超純水（Millipore）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Eyela）；微量移液槍（Sartorius）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；DL SB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 八月瓜籽油的制備

參照楊輝等[16]的八月瓜籽油超聲提取法而稍作修改。準(zhǔn)確稱取15.00 g干燥八月瓜籽粉末于250 mL錐形瓶中，加入料液比1∶11（g/mL）的石油醚為提取溶劑，在超聲功率60%，溫度60 ℃下超聲50 min，超聲提取3次，每次間隔30 min，抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后得八月瓜籽油，按式（1）計(jì)算出油率，試驗(yàn)3次取出油率平均值為42.39%。

式中：y為出油率，%；m1為樣品中油質(zhì)量，g；m2為八月瓜籽粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 八月瓜籽油的甲酯化

參考?xì)W陽玉祝等[17]所述甲酯化法進(jìn)行。將0.5 g籽油置于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL濃硫酸-甲醇溶液（1∶99，V/V），在水浴鍋上70 ℃加熱回流60 min后，加入10 mL正己烷和20 mL蒸餾水，搖勻靜置，取上清液，添加無水硫酸鈉干燥，即得待用。

1.3.3 游離氨基酸的測定

供試品溶液制備：分別稱取3.00 g去油前后八月瓜籽粉末置100 mL量瓶中，加入濃度為0.02 mol/L鹽酸30 mL，攪拌15 min，靜置20 min，按4000 r/min離心10 min，上清液置于100 mL量瓶中，殘?jiān)?5 mL水?dāng)嚢?min，離心，重復(fù)2次，合并上清液定容于100 mL，過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，即得。

色譜條件：色譜柱為LCAK07/Li型標(biāo)準(zhǔn)分析陽離子型交換樹脂；雙通道檢測波長，其中440 nm通道檢測脯氨酸，570 nm通道檢測其他所有氨基酸；輸液泵壓力范圍0～4.2 MPa；洗脫泵流速0.45 mL/min，茚三酮衍生泵流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；分離柱溫度37 ℃，反應(yīng)器溫度130 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、梯度洗脫條件等可參照文獻(xiàn)[18]。記錄各色譜峰面積，計(jì)算八月瓜籽油各游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 GC-MS分析

采用GC-MS法分析八月瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成。

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI型彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 μm×250 μm）。柱溫于48 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至206 ℃，以10 ℃/min升至310 ℃，運(yùn)行58 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為氦氣（99.999%），載氣流量1.0 mL/min，按分流比20∶1進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間4.0 min。

MS條件：離子源為EI源，溫度230 ℃；電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，倍增器電壓1482 V，發(fā)射電流34.6 μA，質(zhì)量范圍29～500 amu。

甲酯化八月瓜籽油樣品用正己烷稀釋，取1 μL溶液進(jìn)樣。各峰與標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫Nist05和Wiley275比對(duì)，確定其揮發(fā)性物質(zhì)的組成，用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組成成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 生物活性評(píng)價(jià)

1.3.5.1 供試藥劑溶液配備

將八月瓜籽油及其主要揮發(fā)性成分溶于無菌水中，加入與藥劑等體積的吐溫-80配制成“母液”，根據(jù)各藥劑的試驗(yàn)需求進(jìn)一步稀釋。試驗(yàn)使用藥劑質(zhì)量濃度范圍分別為0.2000～0.0125μg/mL（液體）和1.000～0.0625 μg/mL（固體）。

1.3.5.2 菌種的活化

選取無污染的毛木耳菌種于超凈工作臺(tái)中接種菌絲至含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置于相對(duì)濕度60%～65%、溫度24±51 ℃，光周期L∶D=12 h∶12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次，待菌絲即將長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)終止培養(yǎng)，備用。

1.3.5.3 含藥PDA培養(yǎng)基的制備

待PDA培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃時(shí)，用移液槍于超凈工作臺(tái)中吸取一定量的1.3.5.1溶液，加入培養(yǎng)基中，搖勻后直接倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)藥劑5個(gè)濃度，每皿20 mL，靜置冷卻，備用。

1.3.5.4 生物活性測定

選取生長均一、正圓形的菌落，用打孔器在超凈工作臺(tái)中沿邊緣順序打成直徑r為7 mm的菌碟，用接種環(huán)挑取菌碟接入1.3.5.3所述培養(yǎng)基中央，重復(fù)3次，對(duì)照為加入吐溫-80無菌水的PDA培養(yǎng)基。倒置于24±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察菌絲生長情況，并采用十字垂直交叉法通過游標(biāo)卡尺測定菌落直徑R，待任何一組菌絲生長到接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)即終止培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

菌絲純生長量、菌絲抑制率和生長速率按式（2）計(jì)算。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行處理，并運(yùn)用LSD法對(duì)各處理及對(duì)照進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸分析

八月瓜籽去油前后各游離氨基酸檢測數(shù)據(jù)見表1。未去油八月瓜籽中含有氨基酸27種，其中γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是精氨酸；總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（T）為0.1802%，其中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（E）為0.0562%，E/T比值達(dá)31.19%；人體必需氨基酸達(dá)8種，早產(chǎn)兒必需氨基酸4種，分別為精氨酸、?；撬?、胱氨酸、酪氨酸；小兒生長發(fā)育期間的必需氨基酸1種，即組氨酸。

表1 八月瓜籽去油前后游離氨基酸檢測結(jié)果

去油后八月瓜籽中含有氨基酸28種，其中γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是精氨酸；T為0.4737%，高于八月瓜果皮和果肉[4]，其中E為0.1264%，E/T比值達(dá)26.68%；與去油前八月瓜籽中人體必需氨基酸、早產(chǎn)兒必需氨基酸和小兒生長發(fā)育期間的必需氨基酸種類完全一致，具有巨大資源再利用價(jià)值。

表2為八月瓜籽中味覺氨基酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測結(jié)果。由表2可知，未去油八月瓜籽中甜味氨基酸[19]質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0390%，其中丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.0258%；藥用氨基酸[20]質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0895%，其中精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.0299%；鮮味氨基酸[21]質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0625%，芳香味氨基酸[22]質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0189%。去油后八月瓜籽中甜味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0843%，其中丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.0499%；藥用氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1947%，與八月瓜果皮基本一致[4]，其中精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.0589%；鮮味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1395%，芳香味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0310%。

表2 八月瓜籽中味覺氨基酸的組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成

甲酯化八月瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組成的總離子流圖見圖1，化學(xué)組成分析結(jié)果見表3。甲酯化八月瓜籽油中共檢測出8種揮發(fā)性物質(zhì)，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總離子峰的99.58%，其中反亞油酸甲酯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為27.45%，其次是7-十八烯酸甲酯（27.42%），棕櫚酸甲酯、油酸甲酯和硬脂酸甲酯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為21.86%，17.43%和3.75%，這5種揮發(fā)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總離子峰的97.91%，是甲酯化八月瓜籽油中的主要揮發(fā)性物質(zhì)。

表3 揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成分析結(jié)果

圖1 甲酯化八月瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組成的總離子流圖

2.3 4種藥劑對(duì)毛木耳菌絲生長的影響

利用甲酯化八月瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)組成分析結(jié)果，選取相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、市場易得的3種主要揮發(fā)性物質(zhì)和八月瓜籽油對(duì)毛木耳菌絲生長進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)。

2.3.1 4種藥劑對(duì)毛木耳菌絲的抑制作用

由表4可知，在預(yù)設(shè)藥劑濃度范圍內(nèi)，八月瓜籽油（質(zhì)量濃度為0.025～0.100 μL/mL）對(duì)毛木耳菌絲生長有一定的抑制作用，最大抑制率為15.03%，而高或低濃度均對(duì)菌絲生長有促進(jìn)作用，低濃度促進(jìn)率為9.8%，高于高濃度的1.97%；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在預(yù)設(shè)濃度內(nèi)均對(duì)菌絲生長有抑制作用，且硬脂酸甲酯在0.125 μg/mL濃度下有最大抑制率，其值為23.96%；棕櫚酸甲酯在預(yù)設(shè)濃度內(nèi)則體現(xiàn)高濃度促進(jìn)低濃度抑制菌絲生長的作用。

表4 4種藥劑對(duì)毛木耳菌絲的抑制作用

2.3.2 4種藥劑對(duì)毛木耳菌絲生長速率的影響

由表5可知，在預(yù)設(shè)藥劑濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中添加八月瓜籽油對(duì)毛木耳的生長具有一定的抑制作用，與對(duì)照相比，其質(zhì)量濃度為0.100和0.050 μg/mL時(shí)可顯著影響菌絲生長；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在預(yù)設(shè)濃度內(nèi)均可抑制菌絲的生長，其中油酸甲酯各濃度對(duì)菌絲生長影響不顯著，但硬脂酸甲酯0.125 μg/mL質(zhì)量濃度下生長速率最小，其值為4.06±0.07 mm/d，與對(duì)照相比影響顯著；棕櫚酸甲酯在預(yù)設(shè)濃度內(nèi)則表現(xiàn)高濃度促進(jìn)低濃度抑制菌絲的生長，其低濃度生長速率與對(duì)照相比表現(xiàn)出顯著的抑制性。

表5 4種藥劑對(duì)毛木耳菌絲生長速率的影響

3 結(jié)論

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，可通過代謝合成抗體、激素和肌酸等人體必需物質(zhì)；脂肪酸是機(jī)體主要能量來源之一，可幫助人體活動(dòng)補(bǔ)充必要的營養(yǎng)物質(zhì)。八月瓜籽中不飽和脂肪酸含量較高，氨基酸種類豐富、含量較高，尤其是人體必需氨基酸和藥用氨基酸，被廣泛應(yīng)用于在醫(yī)藥、保健品、食品等領(lǐng)域，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。

試驗(yàn)以黔中引種八月瓜籽為原料，采用超聲提取法提取籽油，全自動(dòng)氨基酸分析儀測定游離氨基酸的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，GC-MS法測定揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成，進(jìn)而探究八月瓜籽油及其揮發(fā)性成分對(duì)毛木耳菌絲生長的影響。結(jié)果表明，去油后八月瓜籽含有28種氨基酸，總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（T）為0.4737%，其中8種必需氨基酸總量（E）為0.1264%，E/T比值達(dá)26.68%；鮮味、甜味、芳香味和藥用氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1395%，0.0843%，0.0310%和0.1947%。甲酯化八月瓜籽油共檢測出8種揮發(fā)性物質(zhì)，其中反亞油酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是7-十八烯酸甲酯。4種藥劑中，以棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯對(duì)毛木耳菌絲生長的影響最大，其在0.1250 μg/mL質(zhì)量濃度下，抑制率和生長速率均有最小值，且與對(duì)照相比影響顯著。試驗(yàn)結(jié)果可為八月瓜籽榨油后殘?jiān)Y源再利用、籽油綜合開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。