HPLC法快速測(cè)定保健食品中14種非法添加物

彭小東，李紅洲，談曉君，肖超，曹天順

貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院（貴陽(yáng) 550014）

隨著社會(huì)發(fā)展，工作、生活節(jié)奏加快，壓力變大，失眠多夢(mèng)、焦慮不安正成為困擾人們的常見問題[1]。因此，純植物或純中藥成分的安神類健康產(chǎn)品受到消費(fèi)者歡迎，隨著市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，一些不法分子利用西藥成分（化學(xué)成分）見效快、功能強(qiáng)的特點(diǎn)，將其添加至保健食品中，以此夸大產(chǎn)品的功效，提高產(chǎn)品銷量，謀取非法利益。臨床常用的巴比妥等鎮(zhèn)靜藥物，雖具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜催眠作用，但長(zhǎng)期服用，會(huì)使人產(chǎn)生不良反應(yīng)甚至是毒副作用。這種不法行為嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康，同時(shí)也對(duì)保健食品的聲譽(yù)產(chǎn)生不良影響，阻礙保健食品行業(yè)的健康發(fā)展[2-4]。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局出臺(tái)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目的批準(zhǔn)件[5]及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，針對(duì)保健食品中非法添加化學(xué)成分的檢測(cè)方法主要有理化分析[6]、薄層色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-11]、氣質(zhì)聯(lián)用法[12-13]及液質(zhì)聯(lián)用法[14-18]等，其中，高效液相色譜法因其分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，是目前最常用的檢測(cè)方法。此外，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前有關(guān)安神類中成藥和保健食品中的非法添加物的篩查方法報(bào)道較少，存在分析時(shí)間過長(zhǎng)、檢測(cè)成分不多等問題。因此，試驗(yàn)以14種非法添加物（巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮、馬來酸咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、奧沙西泮、勞拉西泮、地西泮和氯氮卓）為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法，建立一種同時(shí)測(cè)定安神類保健品中14種非法添加的化學(xué)成分快速檢測(cè)方法，為政府部門加強(qiáng)食品質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯氮卓（CAS 58-25-3）、馬來酸咪達(dá)唑侖（CAS 59467-94-6）、硝西泮（CAS：146-22-5）、艾司唑侖（CAS 29975-16-4）、奧沙西泮（CAS 604-75-1）、阿普唑侖（CAS 28981-97-7）、勞拉西泮（CAS 846-49-1）、氯硝西泮（CAS 1622-61-3）、三唑侖（CAS 28911-01-5）、地西泮（CAS 439-14-5）、苯巴比妥（CAS 50-06-6）、司可巴比妥（CAS 76-73-3）、異戊巴比妥（CAS 57-43-2）標(biāo)準(zhǔn)品：SIGMA-ALDRICH公司，標(biāo)準(zhǔn)品均為液體，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL，純度大于98.0%；巴比妥（CAS 57-44-3）：International Laboratory USA，固體，純度大于98.0%。

色譜柱，Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm×2.7 μm，美國(guó)安捷倫公司）。

模擬陽(yáng)性樣品（取褪黑素維生素B6膠囊，加入適量上述14種標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻，靜置過夜后，作為模擬陽(yáng)性樣品）。

甲醇、乙腈色譜純（德國(guó)Merck公司）；乙酸、甲醇分析純（國(guó)藥集團(tuán)）；試驗(yàn)用水為經(jīng)超純水儀（英國(guó)ELGA）處理的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient 1260 II高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；電子天平（梅特勒，感量0.0001 g）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；混勻振蕩器（Heidolph公司）；移液器（德國(guó)普蘭德公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取0.0100 g巴比妥固體標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶解后，定容至刻度，制得1.0 mg/mL巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取0.25 mL 14種標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度1.0 mg/mL）于5 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，搖勻，配制成50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃貯藏。臨用前，用色譜甲醇配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃貯藏。

1.3.2 色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相條件：參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件及相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]的流動(dòng)相體系，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)樣量5 μL，流速2.0 mL/min。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：采用紫外檢測(cè)器，全波長(zhǎng)掃描，光譜波長(zhǎng)范圍190～400 nm。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 檢出限、定量限及線性關(guān)系的考察

取50 μg/mL的14種非法添加物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液，用甲醇稀釋成濃度梯度2，5，10，20和50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各組分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍基線噪聲（3）所對(duì)應(yīng)的濃度作為測(cè)定方法的檢出限（SLOD）濃度、10倍基線噪聲（S/N=10）對(duì)應(yīng)的濃度作為定量限（SLOQ）濃度，計(jì)算14種非法添加物的檢出限和定量限。

11 劉譯：...and that their understanding of the Way is similar.[4]38

1.3.3.2 精密度和穩(wěn)定性

取6個(gè)平行空白樣品（未檢出上述非法化學(xué)添加物），加入14種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使每個(gè)空白樣品最終加標(biāo)濃度為10 mg/kg，按照1.3.4的方法進(jìn)行前處理，上機(jī)，測(cè)定峰面積和保留時(shí)間，并在0，2，4，8和24 h各進(jìn)樣1次，記錄不同時(shí)間點(diǎn)14種非法添加物的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）。

1.3.3.3 方法回收率

取某鎮(zhèn)靜安神類膠囊（陰性樣品），并向其中添加低、中、高3個(gè)水平濃度的14種非法化學(xué)添加物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組3個(gè)平行，計(jì)算各成分的回收率。

1.3.3.4 專屬性試驗(yàn)

取模擬陽(yáng)性樣品及褪黑素維生素B6膠囊（空白樣），按照試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、上機(jī)分析，考察其專屬性。

1.3.4 樣品濃度的測(cè)定

片劑、丸劑等大顆粒固體樣品粉碎后混勻，膠囊取內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱取5.00 g供試樣品于150 mL雞心瓶中，加約30 mL三氯甲烷，超聲處理20 min，放至室溫，減壓濃縮至近干，準(zhǔn)確加入5 mL色譜甲醇，渦旋溶解后，過0.22 μm有機(jī)膜，待上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相采用等度洗脫方法，分析時(shí)間過長(zhǎng)，不利于常規(guī)分析，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（編號(hào)2009024）中的液相方法采用的就是等度洗脫法，14種化合物的分析時(shí)間大于60 min；采用乙腈（B）-體積分?jǐn)?shù)0.2%乙酸（A）的流動(dòng)相體系，進(jìn)行梯度洗脫（見表1），在此梯度程序下，各組分的峰形較好，分離度符合分析要求，分析時(shí)間短（15 min），這也可能是與使用粒徑更小的色譜柱有關(guān)，使得各組分得到更好的分離效果，并且乙酸溶液可促進(jìn)電離，提高離子化效率，有利于后期進(jìn)行質(zhì)譜分析方法的開發(fā)，因此確定采用該流動(dòng)相體系。

表1 梯度洗脫程序

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm處為巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮的最大吸收波長(zhǎng)，220 nm處為馬來酸咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖的最大吸收波長(zhǎng)，230 nm處為奧沙西泮、勞拉西泮、地西泮的最大吸收波長(zhǎng)，246 nm處為氯氮卓的最大吸收波長(zhǎng)，比較14種化合物在上述幾個(gè)波長(zhǎng)的檢測(cè)靈敏度后，綜合考慮檢測(cè)靈敏度及效率值（無需切換波長(zhǎng)），方便定量，選用210 nm波長(zhǎng)作為14種化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 檢出限、定量限及線性關(guān)系的考察

采用1.3.3.1的方法對(duì)該方法的檢出限、定量限及線性關(guān)系進(jìn)行考察，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，在2～50 μg/mL范圍內(nèi)，14種非法添加物的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9990，方法的檢出限為0.06～0.6 mg/kg，定量限為0.2～1.8 mg/kg，說明該試驗(yàn)方法靈敏度好，準(zhǔn)確度高。

表2 14種非法添加物質(zhì)的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.4 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密度和穩(wěn)定性：按照1.3.3.2方法進(jìn)行處理和計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 14種非法添加物的精密度和穩(wěn)定性

由表3可知，6個(gè)平行樣品中14種非法添加物的峰面積SRSD為0.12%～0.37%，保留時(shí)間的SRSD為0.10%～ 0.29%，各組分的峰面積及保留時(shí)間無明顯變化，說明試驗(yàn)方法的精密度良好；24 h內(nèi)14種非法添加物的峰面積的SRSD為0.11%～4.10%，峰面積大小無明顯變化，說明14種非法添加物在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。綜上所述，試驗(yàn)方法重現(xiàn)性好，相對(duì)穩(wěn)定，可用于保健食品中14種非法添加物的檢測(cè)。

2.5 回收率試驗(yàn)

為考察試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和可行性，試驗(yàn)選取某鎮(zhèn)靜安神類膠囊（陰性樣品），并向其中添加低、中、高（2.0，4.0和8.0 mg/kg）3個(gè)水平濃度的14種非法化學(xué)添加物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組3個(gè)平行，計(jì)算各成分的回收率及SRSD，結(jié)果見表4，各成分的平均回收率為80.0%～101.5%，SRSD＜10%，進(jìn)一步說明試驗(yàn)所建立的方法準(zhǔn)確度高、精密度好，滿足多種非法添加物分析的要求。

表4 14種非法化學(xué)添加物質(zhì)的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.6 專屬性試驗(yàn)

取模擬陽(yáng)性樣品及褪黑素維生素B6膠囊（空白樣，圖2），按照試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、上機(jī)分析，色譜圖見圖2～圖4（波長(zhǎng)均為210 nm）。在與14種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（圖1）相同的保留時(shí)間處，模擬樣品（圖3）均檢出光譜特征一致的色譜峰，說明試驗(yàn)方法可以很好地排除保健食品中其他組分的干擾，方法專屬性良好。

圖1 10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖2 褪黑素維生素B6膠囊HPLC色譜圖

圖3 模擬陽(yáng)性樣品HPLC色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用高效液相色譜分析技術(shù)，建立一種同時(shí)檢測(cè)安神類保健食品中14種非法添加物的方法，與發(fā)布的藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[5]相比，試驗(yàn)方法對(duì)各非法添加物的分析進(jìn)行整合，縮短分析時(shí)間，提高分析效率，且該方法的靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用到安神類保健食品中非法添加物的快速篩查，有利于提高基層藥檢機(jī)構(gòu)在打擊安神類保健食品中非法添加化學(xué)成分的工作效率。但試驗(yàn)采用的高效液相色譜法在對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品進(jìn)行分析時(shí)，會(huì)遇到假陽(yáng)性的干擾，因此后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜分析，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定性、定量檢測(cè)。