中藥多糖含量測定方法研究?

萬曉瑩， 劉振麗， 宋志前， 彭詩濤， 梁東蕊， 寧張弛， 王 淳

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700)

中藥復(fù)方中每味中藥的質(zhì)量都與其臨床療效密切相關(guān)[1]。中藥的質(zhì)量控制包括有效成分或活性成分的定性鑒別、指紋圖譜和含量測定。中藥有效成分的含量高低是評價中藥質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。多糖是很多常用中藥如靈芝、云芝、玉竹、昆布、枸杞子、金櫻子、鐵皮石槲、海藻和黃精等[4]的主要有效成分，具有抗疲勞[2]、降血糖[3]和抗炎[4]等多種藥理作用。因此，在《中華人民共和國藥典》中，多糖是這些中藥質(zhì)量評價的指標(biāo)。選取適當(dāng)?shù)亩嗵呛繙y定方法，對于科學(xué)評價以多糖為指標(biāo)的中藥質(zhì)量，具有重要的實際應(yīng)用價值。

由于多糖分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏發(fā)光基因，其含量測定方法的建立難度較大?！吨腥A人民共和國藥典》2020版均采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法進(jìn)行測定[5]。該方法以葡萄糖等單糖為對照品，簡便可行，但其準(zhǔn)確度常受待測多糖單糖組成的影響[6]。另有采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法和氣相色譜(gas chromatography, GC)法測定多糖酸水解后單糖的含量[7，8]，但酸水解條件對測量結(jié)果影響很大。上述方法均以單糖為指標(biāo)計算多糖含量，不能對多糖的級分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效分析，可能會影響多糖含量測定的準(zhǔn)確性。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)法和近紅外光譜(near-infrared reflectance, NIR)法等可測定多糖結(jié)構(gòu)的分析手段，也已用于中藥多糖的含量測定。本文歸納了目前中藥多糖含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)，從多糖的直接含量測定和多糖水解后單糖的含量測定兩方面進(jìn)行總結(jié)，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 多糖的直接含量測定

多糖的直接含量測定是指以單糖或多糖為對照品直接測出多糖的含量，目前常用的方法主要有紫外-可見分光光度(uv-visible spectrophotometer, UV-Vis)法、高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)、近紅外光譜法(near-infrared reflectance, NIR)和碘量法。

1.1 UV-Vis法

該方法是利用多糖在濃酸的作用下水解成單糖，經(jīng)脫水縮合形成糖醛衍生物，再與相應(yīng)的顯色劑結(jié)合顯色，通過測定顯色后的吸光度值大小來計算總糖含量的一種定量方法。常用的顯色方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸-硫酸法(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)等?！吨腥A人民共和國藥典》2020版收載測定多糖的中藥，除云芝多糖采用間接碘量法外，其他玉竹等8味中藥和斛葉干浸膏的多糖含量均采用UV-Vis法測定。表1對該方法測定多糖含量的主要相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了歸納總結(jié)。

表1 UV-Vis法測定多糖含量主要內(nèi)容歸納比較

采用該方法測定多糖含量需選擇一種單糖作為對照品。藥典采用的單糖對照品為葡萄糖和巖藻糖。大部分中藥飲片的多糖含量測定均采用葡萄糖為對照品，如玉竹、金櫻子、枸杞子等。對于海藻、昆布等來自海洋的中藥，因其富含巖藻糖[9]則采用巖藻糖作為對照品。多糖的組成類型可分為均多糖和雜多糖。當(dāng)多糖為均多糖時，采用一種單糖對照品就可以準(zhǔn)確測定多糖含量。而當(dāng)多糖為雜多糖時，按多糖的單糖組成及比例配制的混合單糖作為對照品，測定出的多糖含量才能更準(zhǔn)確。如測定亮菌多糖含量時，應(yīng)首先運用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)-柱前衍生HPLC法，測定其單糖組成及比例為葡萄糖(42.75%)、半乳糖(25.60%)、木糖(9.81%)、甘露糖(9.65%)、阿拉伯糖(6.64%)、巖藻糖(3.94%)。然后再依據(jù)測定結(jié)果配制混合單糖對照品，采用苯酚-硫酸法測定亮菌多糖的含量[10]。

目前《中華人民共和國藥典》收載的多糖含量測定供試品溶液制備方法基本包括3種，一是中藥經(jīng)水回流提取后取濾液即可，該方法只適用于不含水溶性干擾成分的中藥。目前藥典中云芝、金櫻子多糖均采用該方法測定；二是中藥水回流提取后，水提液經(jīng)醇沉處理得到沉淀，再加水溶解后進(jìn)行測定。該方法可以去除水溶性成分對多糖測定的干擾，但乙醇濃度應(yīng)保證中藥中多糖沉淀完全。如戴平等[11]分別采用65%醇沉、75%醇沉、85%醇沉、95%醇沉工藝對莪術(shù)水提液進(jìn)行處理獲得莪術(shù)多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇沉濃度為75%時莪術(shù)多糖的含量最高，隨著醇沉濃度的增加，莪術(shù)多糖的含量反而降低，表明醇沉濃度過高或過低都不能使多糖沉淀完全，影響多糖的含量。目前藥典中玉竹、靈芝、昆布、鐵皮石斛、海藻多糖均采用該方法測定；三是中藥首先采用乙醚、80%乙醇或丙酮除雜，經(jīng)預(yù)處理后的殘渣再加水回流提取并取濾液測定。對于含有色素、苷類等成分的中藥，采用乙醚等脂溶性溶劑進(jìn)行預(yù)處理可去除色素等脂溶性成分。采用80%乙醇或丙酮等極性溶劑可將苷類成分完全除去，以免硫酸水解時苷類成分中的糖基也被水解，與多糖水解產(chǎn)物一起與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，使得測定結(jié)果偏高。目前藥典中枸杞子、黃精、斛葉干浸膏多糖均采用該方法測定。

多糖含量測定的顯色方法最常用的是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。苯酚-硫酸法可測定甲基化的糖、戊糖和多聚糖，而蒽酮-硫酸法測定的是溶液中全部碳水化合物的總量，所測值一般高于苯酚-硫酸法[12]。測定時具體的顯色條件應(yīng)通過實驗篩選確定。如玉竹多糖與鐵皮石斛多糖均采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定，但玉竹多糖顯色的水浴溫度為40℃，而鐵皮石斛多糖顯色時則是放置于沸水浴中。靈芝、昆布多糖在加入蒽酮-硫酸溶液后室溫放置，而黃精多糖顯色則需置于水浴保溫，因此具體顯色條件應(yīng)在考察后確定。田鳳鳴等[13]采用苯酚-硫酸法測定京大戟多糖的含量，并從苯酚濃度(1%、3%、5%、7%、9%)、硫酸用量(3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL)、反應(yīng)溫度(20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃)、反應(yīng)時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)4個方面對測定條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)苯酚濃度為5%、濃硫酸用量為5 mL，反應(yīng)溫度為100 ℃、反應(yīng)時間為30 min時，苯酚-硫酸法的測定值誤差最小。采用苯酚-硫酸法測定時需注意苯酚易被氧化成醌類物質(zhì)，需在臨用前進(jìn)行重蒸餾，否則會造成吸光度的偏移或吸光值不穩(wěn)，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差、準(zhǔn)確性低。

DNS法主要用于測定還原糖含量，其原理是在堿性或中性的條件下，多糖水解后產(chǎn)生的還原糖能與DNS生成一種棕紅色化合物，該化合物在一定范圍內(nèi)，其吸光度值的大小與還原糖的濃度成線性關(guān)系，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定還原糖的濃度。此外，地衣酚-鹽酸法也是一種測定多糖含量的方法，一般用于測定戊聚糖的含量。

UV-Vis法雖是目前最主要的多糖含量測定方法，但該方法是一種通用型的定量方法，一般只要化合物中含有羰基都能產(chǎn)生顏色反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽性[14]，準(zhǔn)確性低，且不能體現(xiàn)組成多糖的單糖單元的特征，并不能滿足現(xiàn)階段對多糖質(zhì)量評價的要求。

1.2 HPGPC法

采用HPGPC法測定多糖含量一般以多糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。首先建立多糖分子量及分布分析方法，確定其特征色譜峰，再通過超濾等方法分離得到質(zhì)量標(biāo)志物(DOP)作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量。在待測多糖與現(xiàn)有多糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量一致的情況下，也可直接采用魔宇葡甘聚糖、CM-阿拉伯聚糖、木葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定。由于多糖無發(fā)光基團(tuán)，目前常用的檢測器主要是蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light-scattering detector, ELSD)、示差折光檢測器(differential refractive index detector, RID)和多角度激光散射(multi-angle laser light scattering, MALLS)檢測器。Xu J等[15]為評價不同品種和產(chǎn)地石斛質(zhì)量，采用HPGPC-ELSD法確定了多糖分布，并通過超濾法分離得到鐵皮石斛的DOP，進(jìn)一步對不同地區(qū)的石斛多糖進(jìn)行含量測定，顯示石斛質(zhì)量參差不齊。HPGPC-ELSD法不需破壞原有多糖成分的結(jié)構(gòu)就可對中藥中的多糖進(jìn)行定性定量的優(yōu)點，使HPGPC-ELSD法成為一種能快速準(zhǔn)確測定多糖的新方法。

HPGPC-ELSD法雖能提高多糖含量測定的準(zhǔn)確度，但需要分離得到DOP作為對照品，而DOP的選擇和分離往往受限，使HPGPC-ELSD法的使用受到一定的限制。Cheong KL等[7]為解決這一問題，采用基于比折光指數(shù)增量值的HPGPC-MALLS-RID法測定多糖含量，以魔宇葡甘聚糖、CM-阿拉伯聚糖、木葡聚糖、松木多糖、燕麥β-葡聚糖、右旋糖酐(410、270和25 kDa)的混合多糖為對照品，并將測定結(jié)果與苯酚-硫酸法和HPGPC-ELSD法進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，該方法在測定多糖及混合多糖含量時，多糖的組成和比例對結(jié)果的影響明顯小于后2個方法，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。同時該方法成功被用于測定人參屬中藥人參、三七和西洋參多糖及其不同分子量級分的含量，結(jié)果顯示其多糖及多糖分子量級分存在較大差異，該方法有助于改善人參屬中藥多糖的質(zhì)量控制。

1.3 NIR法

NIR法不僅與被測樣品的化學(xué)組分有關(guān)，還受樣品大小、形狀、密度等影響，此外基線的漂移及溫度等條件變化也會影響光譜信號。因此，采用原始的光譜數(shù)據(jù)建立模型的精密度會降低，需用化學(xué)計量學(xué)方法對其進(jìn)行預(yù)處理并將干擾信息和無用信息去除。常用的預(yù)處理方法有savitsky golay (SG)平滑、norris derivative (ND)平滑、一階導(dǎo)數(shù)(first derivative, FD)、二階導(dǎo)數(shù)(second derivative, SD)、多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(standard normal variable, SNV)。Xie Y等[8]采用一種基于近紅外光譜法和化學(xué)計量學(xué)的校準(zhǔn)模型，檢測不同產(chǎn)地香菇樣品中的多糖含量。結(jié)果顯示，該模型的預(yù)測均方根偏差(root mean square error of Prediction, RMSEP)和校正均方根(root mean square error of correction, RMSEP)分別為0.598和0.720，訓(xùn)練集和測試集R2分別達(dá)到0.958、0.925，說明多糖含量的預(yù)測結(jié)果與實際實驗的結(jié)果之間無明顯差異，顯示該模型能夠精確地預(yù)測香菇中香菇多糖的含量。

除以上幾種測定多糖含量方法之外，滴定法也被用于多糖的含量測定，如藥典中云芝多糖的測定采用的是間接碘量法，以硫代硫酸鈉為滴定液，淀粉為指示劑，分別測定總糖與單糖含量，以總糖含量值減去單糖含量值即為多糖含量。但其操作過程較為繁瑣，且滴定速度和搖晃的劇烈程度都會導(dǎo)致測定結(jié)果的誤差，現(xiàn)在一般很少用于多糖含量的測定。

2 多糖水解后單糖的含量測定

該方法是通過將多糖水解后，檢測多糖水解后單糖的含量，以單糖含量之和作為多糖含量。目前常用的方法主要有HPLC法、GC法和離子色譜法(Ion Chromatography, IC)。

2.1 HPLC法

采用HPLC法對多糖進(jìn)行定量測定，是在分析多糖單糖組成的基礎(chǔ)上，以相應(yīng)單糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化，然后測定色譜峰面積并計算各單糖含量。該方法成功的關(guān)鍵在于多糖水解和衍生化條件。多糖水解的方法主要有酸水解法和酶解法，此外還有氧化降解法、超聲降解法和輻射降解法等。常用的衍生化試劑包括PMP、2-氨基吡啶(2-Aminopyridine,2-AP)、對氨基苯甲酸酯、8-萘胺-1,3,6-三磺酸(2-Amino-3,6,8-naphthalenetrisulfonic acid ,ANTS)和苯甲酰氯等。其中最常用的是PMP試劑，因其能同時測定酸性、中性和堿性多糖[16]。劉宇等[17]采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法結(jié)合外標(biāo)一點法，測定了酸棗仁湯多糖水解后所得的甘露糖等4種單糖和半乳糖醛酸等2種糖醛酸的含量。

2.2 GC法

GC法測定多糖中單糖含量的原理與高效液相色譜法相似，也是在獲得多糖單糖組成的基礎(chǔ)上，經(jīng)硅烷化或乙酸酯化處理，使單糖成為易揮發(fā)且對熱穩(wěn)定的衍生物，從而實現(xiàn)對多糖的定量測定。但其使用的范圍比高效液相色譜法窄，僅適宜于測定熱穩(wěn)定且受熱易揮發(fā)的單糖。孫蓮等[18]采用水提醇沉法提取桑枝多糖，三氟乙酸水解多糖，水解產(chǎn)物用鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，GC法測定桑枝多糖的單糖組成及含量。結(jié)果顯示，新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等組成，含量分別為鼠李糖(11.8 mg/mL)、阿拉伯糖(14.4 mg/mL)、木糖(1.6 mg/mL)、甘露糖(1.9 mg/mL)、葡萄糖(22.3 mg/mL)及半乳糖(28.0 mg/mL)。GC法在測定時需注意載氣的流速對各色譜峰分離度的影響，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 IC法

IC法可根據(jù)多糖完全水解后產(chǎn)生的各單糖在堿性環(huán)境中可解離為帶不同負(fù)電荷的陰離子，并利用其與陰離子交換柱保留時間的不同達(dá)到分離，從而實現(xiàn)多糖的含量測定[19]。該方法測定多糖中單糖含量時，無需進(jìn)行衍生化前處理，即可分離測定，此方法靈敏度高、操作簡單、分離度好。趙丹等[20]采用IC法分析了葛根多糖主要由巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和核糖組成，并通過繪制峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出這7種單糖的含量。

3 結(jié)語

多糖普遍存在于中藥中，是中藥有效成分之一。目前中藥多糖含量測定主要分為多糖含量測定和多糖水解后單糖含量測定?！吨腥A人民共和國藥典2020版》第一部中多糖含量測定主要采用UV-Vis法，但存在需要完善之處。首先要注意對照品的選擇。藥典在測定多糖含量時，采用的對照品為單一單糖，當(dāng)多糖組成為均多糖時可以采用單一單糖作對照品。但中藥中的多糖大多為雜多糖，應(yīng)按多糖的單糖組成及比例配制混合單糖作為對照品，測得的多糖含量更準(zhǔn)確；二是供試品溶液制備方法，應(yīng)盡可能地排除影響多糖含量測定的干擾因素。某些中藥采用水回流提取后濾液直接作為供試品溶液，對于含有苷類等成分的中藥，會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用水提醇沉法制備供試品溶液時，乙醇的濃度應(yīng)經(jīng)過考察，以保證所有多糖都完全沉淀。如黃精多糖在藥典中采用80%乙醇沉淀[5]。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPGPC法分析顯示90%乙醇才能將黃精多糖全部完全沉淀。

在多糖定性鑒別和糖譜分析中，實驗條件同樣也需要嚴(yán)格控制。目前，多糖水解后單糖的分析已用于含多糖中藥的定性鑒別和糖譜分析。在進(jìn)行單糖分析時，需注意嚴(yán)格考察多糖的水解條件。如課題組前期發(fā)現(xiàn)，采用文獻(xiàn)方法水解黃精多糖會造成多糖的碳化而影響測定。多糖水解后單糖的測定主要采用HPLC法和GC法，其中GC法的應(yīng)用范圍較窄，僅適合于熱穩(wěn)定且受熱易揮發(fā)的單糖，HPLC法應(yīng)用范圍寬，但樣品前處理步驟繁瑣。除了HPLC法和GC法，IC法測定樣品不需衍生化的特點使其也逐漸應(yīng)用于糖類的含量測定。HPGPC法和NIR法等具有高靈敏度的分析儀器也已用于中藥多糖的含量測定，有效提高了多糖含量結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著精密儀器迅速發(fā)展，中藥多糖含量測定方法逐步完善，但不同分析方法應(yīng)用的條件不同，因此在進(jìn)行多糖含量前應(yīng)加以考察，以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。