兩種微生物與藍(lán)莓根腐病菌在根表的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系研究

陳志遠(yuǎn)， 劉艷妮， 高 琪， 郭 媛

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 漢中 723000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

藍(lán)莓屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)小漿果類果樹(shù)[1-2]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，頗受人們的歡迎[3]。近年隨著藍(lán)莓種植面積逐年擴(kuò)大，其病害也日趨嚴(yán)重，由真菌引起的藍(lán)莓病害多達(dá)幾十種，其中根腐病是真菌病害之一[4]，嚴(yán)重影響藍(lán)莓生長(zhǎng)，危害藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。鐮刀菌(Fusarium)作為一種世界性分布的土傳病原真菌[5]，是引起藍(lán)莓根腐病的主要病原菌，其寄主廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，可侵染多種植物引起根腐病，如橡膠樹(shù)、紫花苜蓿及獼猴桃等[5]。鐮刀菌侵入藍(lán)莓根系后，釋放真菌毒素進(jìn)而引發(fā)藍(lán)莓根系組織細(xì)胞壞死、腐爛，根系如有傷口會(huì)加速其侵染過(guò)程[7]。癥狀首先在須根上出現(xiàn)，毛細(xì)根先發(fā)生壞死斑，隨后逐漸向上蔓延，病株根部腐爛變成褐色，莖部出現(xiàn)紅棕色病斑，直到整個(gè)植株枯萎，葉片掉光，最后死亡[8]。開(kāi)發(fā)和研究防治藍(lán)莓鐮刀菌根腐病的生防制劑對(duì)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

目前鐮刀菌根腐病的防治措施主要以化學(xué)防治為主，然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑不僅會(huì)破壞土壤環(huán)境[9]，還將導(dǎo)致藍(lán)莓的經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。利用微生物防治鐮刀菌根腐病具有綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)點(diǎn)[10]，正受到政府機(jī)關(guān)、廣大果農(nóng)和學(xué)者的關(guān)注。根據(jù)生態(tài)位理論[11]，資源豐富的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致生態(tài)位寬度縮小和生態(tài)位專業(yè)化。與土壤和根際相比，根表是根系釋放豐富資源的地方。實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果支持根表微生物繁殖層是病原菌入侵的屏障。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根際環(huán)境中的宿主相關(guān)細(xì)菌群落與病原菌表現(xiàn)出明顯的生態(tài)位重疊，這降低了病原菌入侵成功率，并限制了入侵群落中病原菌的生長(zhǎng)[12]。并且發(fā)現(xiàn)真菌物種之間，以及真菌和細(xì)菌物種之間的根表空間競(jìng)爭(zhēng)[13]。利用生態(tài)位理論可以解釋病原菌入侵根表是微生物生態(tài)位的破壞和重建過(guò)程。EDWARDS等根據(jù)微生物與根系的距離，將與植物相互作用的微生物分為土塊、根際、根表、根內(nèi)4個(gè)區(qū)域，其中根表微生物是植物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是植物抵抗土傳病原菌侵染的第一道防線[12,14]。但是根表微生物與病原菌在根表的相互作用機(jī)理依然所知甚少。

基于此，本文研究以在三葉草根表分離的阿氏芽孢桿菌R-B-01和一種真菌R-F-01為材料，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)真菌R-F-01進(jìn)行鑒定，將阿氏芽孢桿菌R-B-01、真菌R-F-01與禾谷鐮刀菌R-F-02三種微生物接入藍(lán)莓組培苗根表，探究三種微生物在根表的相互作用，為闡明該微生物在藍(lán)莓根表與鐮刀菌的相互作用及機(jī)制提供理論依據(jù)，為防治藍(lán)莓根腐病的生防菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)莓組培苗品種為夏普藍(lán)(Sharpblue)，由陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

供試病原菌：由實(shí)驗(yàn)室盆栽苗中發(fā)現(xiàn)的藍(lán)莓根腐病病株，采集腐爛根系，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存的禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)[15]，內(nèi)部編號(hào)R-F-02。

供試細(xì)菌：采集三葉草根段，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存的阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)[13]，內(nèi)部編號(hào)R-B-01。

三葉草根的采集：2020年6月，在陜西理工大學(xué)校園內(nèi)采集三葉草根段，放入密封袋做好標(biāo)記，無(wú)菌水清洗，放入4 ℃冰箱備用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

體式顯微鏡Mro5c，德國(guó)Leica；電子顯微鏡pure，復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司；高壓滅菌鍋YXQ-Ls-75G，上海申安醫(yī)療儀器器械廠；電子天平TD50002，余姚市金諾天平儀器有限公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F和霉菌培養(yǎng)恒溫箱MJX-150BE，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離純化

根表真菌的分離純化[16]：從采集的三葉草根段上，切取2 cm置于PDA平板上并封口，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。待平板上長(zhǎng)出真菌后，挑取單菌落，接種到新的PDA培養(yǎng)基上，重復(fù)5～6次，得到純化的菌株命名為R-F-01。

1.3.2 菌種的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將真菌R-F-01在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d，出現(xiàn)菌落，觀察菌落形態(tài)特征，測(cè)量菌落直徑。利用顯微鏡觀察菌絲體及其孢子、孢子梗形態(tài)、大小和顏色等特征[17]。

1.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌鑒定通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[18]。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：DNA模板1 μL，上、下游引物(10 p)各1 μL，Super Mix 15 μL，雙蒸水12 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃ 5 min；96 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后由深圳華大基因股份有限公司完成測(cè)序，將獲得的真菌R-F-01測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST與GenBank上已知ITS序列進(jìn)行相似性比較分析[16]，在MEGA 7.0軟件上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制真菌R-F-01的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 懸浮液的制備

1.3.3.1 細(xì)菌懸浮液的制備

無(wú)菌環(huán)境下，用接種環(huán)輕輕挑取細(xì)菌的單菌落，再用無(wú)菌水稀釋，制成1×109CFU /mL濃度的懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3.2 真菌懸浮液的制備

無(wú)菌環(huán)境下，將真菌R-F-01于PDA培養(yǎng)基的平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌接種環(huán)刮取適量孢子，再用無(wú)菌水稀釋，制成1×109CFU /mL濃度的孢子懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3.3 混合菌懸浮液的制備

無(wú)菌環(huán)境下，將以上制備好的阿氏芽孢桿菌R-B-01、真菌R-F-01及禾谷鐮刀菌R-F-02菌液體積比1∶1∶1混合，倒入無(wú)菌離心管中，混勻，制成混合菌液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 微生物侵染藍(lán)莓根系

使用藍(lán)莓組培生根30 d的幼苗，接入1 mL處理液，6個(gè)處理分別為：

(1)無(wú)菌水作為對(duì)照組(根系無(wú)傷口)；

(2)接入阿氏芽孢桿菌R-B-01懸液(根系無(wú)傷口)；

(3)接入棘孢木霉R-F-01懸液(根系無(wú)傷口)；

(4)接入禾谷鐮刀菌R-F-02懸液(根系無(wú)傷口)；

(5)接入禾谷鐮刀菌R-F-02懸液(根系有傷口)；

(6)接入混合菌懸液(根系無(wú)傷口)。

每個(gè)處理重復(fù)3次，完成后于25 ℃恒溫室培養(yǎng)，20 d后觀察藍(lán)莓根系的變化。

1.3.5 藍(lán)莓根系及微生物的形態(tài)學(xué)觀察

1.3.5.1 體式顯微鏡觀察

藍(lán)莓根系樣品接種培養(yǎng)20 d后，分別取6種不同處理的藍(lán)莓根系，于超凈工作臺(tái)上分別用鑷子取出藍(lán)莓根系各3根，放置于干凈培養(yǎng)皿中，于體視顯微鏡下觀察其根系和微生物定殖情況。

1.3.5.2 電子顯微鏡觀察

藍(lán)莓根系樣品接種培養(yǎng)20 d后，于超凈工作臺(tái)上用鑷子分別取6種不同處理的藍(lán)莓根系各3根，放置于干凈培養(yǎng)皿中[19]。將直徑為12 mm雙面碳導(dǎo)電膠片粘貼在釘型樣品臺(tái)上，而后將樣品均勻得覆蓋在膠片表面，用鑷子將釘型樣品臺(tái)夾起放于電鏡標(biāo)準(zhǔn)樣品杯中，旋轉(zhuǎn)樣品杯，動(dòng)力除塵器吹幾次除去灰塵后放置于電鏡載物臺(tái)，調(diào)節(jié)最佳視野和放大倍數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.6 生防菌株抑制率的測(cè)定

采用平板對(duì)峙法測(cè)定阿氏芽孢桿菌R-B-01與真菌R-F-01對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02的抑菌活性，對(duì)照組為只在平板中心接種禾谷鐮刀菌R-F-02。每組重復(fù)4次。25 ℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量相對(duì)拮抗菌方向禾谷鐮刀菌R-F-02生長(zhǎng)的直徑和抑菌帶寬度，計(jì)算抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉草根表真菌R-F-01的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

從三葉草根表分離一種真菌R-F-01，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃條件下培養(yǎng)，菌落開(kāi)始時(shí)為白色，致密，圓形，隨后從中央產(chǎn)生綠色孢子向四周擴(kuò)展，菌絲生長(zhǎng)速度較快，從淺綠、黃綠色至最后全部菌落變?yōu)榫G色(圖1(a))。菌落周圍有白色菌絲的生長(zhǎng)帶，纖細(xì)，寬度為1.5～2.4 μm。產(chǎn)生分生孢子，分生孢子梗垂直對(duì)稱分枝且數(shù)量較多；分生孢子單生或簇生，圓形、球形至卵形，呈綠色，大小為(2.5～4.5) μm×(2～4.0) μm(圖1(b))。綜合以上特征，初步分析真菌R-F-01為木霉菌(Trichoderma)。

(a)PDA培養(yǎng)基菌落正面 (b)分生孢子和分生孢子梗圖1 真菌R-F-01菌落的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

將待測(cè)真菌R-F-01進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)并提交至GenBank進(jìn)行序列一致性比較。結(jié)果顯示，供試真菌R-F-01的ITS序列(GenBank登錄號(hào)：MW391565)與Trichodermaasperellum有較高的同源性，相似度高達(dá)100%。對(duì)真菌R-F-01的ITS序列使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明其與Trichodermaasperellum進(jìn)化距離最近(圖2)。因此，根據(jù)真菌的菌落生長(zhǎng)形態(tài)和分生孢子特征，結(jié)合ITS序列進(jìn)化分析結(jié)果，鑒定該菌為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。

圖2 真菌R-F-01的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

2.2 3種微生物在藍(lán)莓根周圍的相互作用

為探究阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01與禾谷鐮刀菌R-F-02在藍(lán)莓根周圍的相互作用，分別以單獨(dú)或混合方式將3種微生物接入組培苗根系表面，培養(yǎng)20 d后觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(圖3A)根系健康、顏色透明、植株生長(zhǎng)旺盛；與對(duì)照組相比，單獨(dú)接入阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷鐮刀菌R-F-02(無(wú)傷口)后，根系表面有菌落附著及根系顏色加深，植株葉片泛黃(圖3B—D)，而在有傷口的根系中接入禾谷鐮刀菌R-F-02后，根系變黑、干枯腐爛，植株部分被菌絲包裹并枯萎(圖3E)。將3種菌混合接入后，混合菌斑整體變小，集中附著于根系周圍，植株生長(zhǎng)健康(圖3F)。以上結(jié)果表明，阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01在藍(lán)莓根系周圍對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02有明顯的抑制作用。

A：對(duì)照組； B：接入阿氏芽孢桿菌R-B-01； C：接入棘孢木霉R-F-01；D：接入禾谷鐮刀菌R-F-02(無(wú)傷口)； E：接入禾谷鐮刀菌R-F-02(有傷口)； F：接入混合菌；細(xì)實(shí)箭頭為阿氏芽孢桿菌R-B-01，粗實(shí)箭頭為棘孢木霉R-F-01，虛線箭頭為禾谷鐮刀菌R-F-02圖3 3種微生物接入20 d后在藍(lán)莓根系的定殖情況

A1、A2：對(duì)照組；B1、B2：接入阿氏芽孢桿菌R-B-01；C1、C2：接入棘孢木霉R-F-01；D1、D2：接入禾谷鐮刀菌R-F-02(無(wú)傷口)；E1、E2：接入禾谷鐮刀菌R-F-02(有傷口)；F1、F2：接入混合菌；細(xì)實(shí)箭頭為阿氏芽孢桿菌R-B-01，粗實(shí)箭頭為棘孢木霉R-F-01，虛線箭頭為禾谷鐮刀菌R-F-02圖4 體式顯微鏡觀察藍(lán)莓根系

2.3 體視顯微鏡分析3種微生物在藍(lán)莓根表的相互作用

為分析3種微生物在藍(lán)莓根表的相互作用，采用體視顯微鏡觀察上述處理組的根系、單菌落及混合菌落的定殖情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組根系顏色較淺、生命力旺盛、無(wú)明顯分枝(圖4A1、A2)。與對(duì)照組相比，單獨(dú)接入阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷鐮刀菌R-F-02(無(wú)傷口)后，根系均產(chǎn)生較多分枝(圖4B1、B2—D1、D2)，其中，接入棘孢木霉R-F-01的根系產(chǎn)生的分枝數(shù)量是最多的。接入阿氏芽孢桿菌R-B-01后，白色菌落密集附著在根表面，根系顏色加深(圖4B1、B2)；接入棘孢木霉R-F-01后，霉菌菌絲包裹根系，孢子生長(zhǎng)旺盛(圖4C1、C2)；接入禾谷鐮刀菌R-F-02后，根系(無(wú)傷口)表面有鐮刀菌菌絲纏繞，顏色變?yōu)榧t色，且有腐爛趨勢(shì)(圖4D1、D2)；在有傷口根系接入禾谷鐮刀菌R-F-02后，發(fā)現(xiàn)菌絲侵入根系，根系明顯變黑、腐爛、干枯，植株死亡(圖4E1、E2)。與接入單菌落相比，接入混合菌(1∶1∶1)后，根系表面有一定的棘孢木霉孢子團(tuán)定殖，禾谷鐮刀菌R-F-02定殖量明顯減少，根系未見(jiàn)發(fā)病且變得強(qiáng)壯(圖4F1、F2)。以上結(jié)果表明，阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01及禾谷鐮刀菌R-F-02都有刺激藍(lán)莓根系分枝的作用，其中棘孢木霉R-F-01刺激作用相對(duì)最強(qiáng)，阿氏芽孢桿菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01在根表對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02有明顯的抑制作用。

2.4 電子顯微鏡分析3種微生物在藍(lán)莓根表的相互作用

為進(jìn)一步研究3種微生物在藍(lán)莓根表的相互作用，采用電子顯微鏡觀察上述處理組的根系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組根系表面干凈，具有規(guī)則性的起伏波動(dòng)(圖5(A))；接入阿氏芽孢桿菌R-B-01后，阿氏芽孢桿菌R-B-01以菌落團(tuán)的形態(tài)密布在根表，但對(duì)根系無(wú)明顯影響(圖5(B))；接入棘孢木霉R-F-01后，霉菌孢子團(tuán)緊湊分布在根系表面，尤其在根表有皺褶的區(qū)域孢子團(tuán)密集定殖(圖5(C))；接入禾谷鐮刀菌R-F-02后，菌絲成帶狀纏繞在根(無(wú)傷口)表面(圖5(D))，而在有傷口的根系中，帶狀菌絲侵入根系內(nèi)部，根系遭到破壞(圖5(E))。接入混合菌后，根系表面大面積被棘孢木霉R-F-01孢子團(tuán)定殖，且少量禾谷鐮刀菌R-F-02帶狀菌絲也被棘孢木霉R-F-01包裹起來(lái)?？臻g上，棘孢木霉R-F-01占據(jù)了主導(dǎo)地位，禾谷鐮刀菌R-F-02占據(jù)從屬地位，未觀察到阿氏芽孢桿菌R-B-01的菌落團(tuán)(圖5(F))。以上結(jié)果表明，棘孢木霉R-F-01是混合菌中抑制禾谷鐮刀菌R-F-02的主要菌種，且棘孢木霉R-F-01與禾谷鐮刀菌R-F-02在藍(lán)莓根表存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

細(xì)實(shí)箭頭為阿氏芽孢桿菌R-B-01，粗實(shí)箭頭為棘孢木霉R-F-01，虛線箭頭為禾谷鐮刀菌R-F-02圖5 電子顯微鏡觀察藍(lán)莓根系

2.5 生防菌株抑制率測(cè)定

從表1和圖6可知，兩個(gè)處理組的病原菌菌落直徑顯著低于對(duì)照組，對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02均具有明顯抑制效果。其中菌株棘孢木霉R-F-01組抑菌圈最寬(圖6(c))，抑制圈直徑達(dá)到(0.80±0.17) cm。阿氏芽孢桿菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01抑制率分別為91.31%、98.46%。

(a)對(duì)照組 (b)阿氏芽孢桿菌R-B-01 (c)棘孢木霉R-F-01 圖6 生防菌抑制效果

表1 生防菌抑菌作用測(cè)定

3 討論

鐮刀菌是引起藍(lán)莓根腐病的主要病原菌，嚴(yán)重影響藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。生物防治具有高效、無(wú)害、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為植物病害防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究前期發(fā)現(xiàn)三葉草根表微生物在藍(lán)莓根表具有較好的生防作用，而具體機(jī)制并不清楚。因此，從三葉草根表分離并純化該微生物，命名為真菌R-F-01，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為棘孢木霉。許多研究報(bào)道，木霉(Trichoderma)對(duì)鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制作用。黃遠(yuǎn)迪等[20]對(duì)一株從土壤中分離出的棘孢木霉GX004的研究表明，當(dāng)棘孢木霉GX004孢子濃度為1.65×106個(gè)/mL時(shí)，尖孢鐮刀菌幾乎無(wú)法生長(zhǎng)。YU等[21]研究發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉菌(T.koningiopsis)通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧代謝、滲透勢(shì)和根際微生物群落，抑制尖孢鐮刀菌引起的馬尾松幼苗萎蔫。林輝等[22]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T-1、超微粉腐殖質(zhì)及其復(fù)配物(腐殖質(zhì)-T1)均能抑制連作土壤中尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。PIMENTEL等[23]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉在大豆根系對(duì)鐮刀菌的防治率高達(dá)92%，其機(jī)制與真菌寄生和誘導(dǎo)植物防御基因表達(dá)相關(guān)。侯瑞等[24]對(duì)80株藍(lán)莓根際土壤真菌的研究顯示，對(duì)藍(lán)莓根腐病病菌抑制率在50%以上的菌株有22株，抑制率在70%以上的有8株，其中日本曲霉(Aspergillusjaponicas)、棘孢木霉和蓋姆斯木霉(T.gamsii)菌株抑制效果最好，表現(xiàn)出良好的生防應(yīng)用前景。關(guān)于木霉在植物根際對(duì)鐮刀菌的生防作用研究較為廣泛，而在植物根表的作用及機(jī)制尚不明確。

作為生防細(xì)菌，芽孢桿菌(Bacillus)被證明能夠有效抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)[25-27]。LIU等[28]研究顯示，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)通過(guò)促進(jìn)黃瓜根系棉子糖的分泌減少，從而抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)。PALMIERI等[29]利用解淀粉芽孢桿菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)和粘質(zhì)沙雷菌(serratiamarcescens)微生物聯(lián)合體有效控制了鐮刀菌病原體。RUIZ等[30]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌(B.pumilus)可通過(guò)真菌互作、固氮、解磷、解鉀等作用，提高根際的土壤營(yíng)養(yǎng)達(dá)到增強(qiáng)植物抗逆性的作用。目前關(guān)于芽孢桿菌生防作用的研究多集中在植物根際，而在根表的作用及機(jī)制尚不清楚。

本研究將阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01與禾谷鐮刀菌R-F-02三種微生物接入藍(lán)莓根系，并采用體式顯微鏡和電子顯微鏡分析三種微生物在根表的相互作用。結(jié)果表明，阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01在藍(lán)莓根周圍和根表對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02均有明顯的抑制作用，阻止了禾谷鐮刀菌R-F-02對(duì)根系的侵蝕和毒害，且體式顯微鏡分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)3種微生物均具有刺激藍(lán)莓根系分枝的作用，其中以棘孢木霉R-F-01作用效果最強(qiáng)，分析其原因可能是菌株通過(guò)刺激植物根系，影響植物激素水平變化從而促進(jìn)分枝發(fā)育，這需要后續(xù)進(jìn)一步研究。電子顯微鏡分析進(jìn)一步表明，在藍(lán)莓植物根表棘孢木霉R-F-01是混合菌中抑制禾谷鐮刀菌R-F-02的主要菌種，其機(jī)制是通過(guò)空間競(jìng)爭(zhēng)的方式發(fā)揮作用的，這與其他研究報(bào)道的生防菌自身的殺菌活性[31]或刺激植物發(fā)生變化而發(fā)揮抑菌作用[32]的機(jī)制是不同的，而未觀察到阿氏芽孢桿菌R-B-01可能是由于其競(jìng)爭(zhēng)能力相對(duì)較弱導(dǎo)致的，其具體原因需后續(xù)探究。平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中由于微生物空間結(jié)構(gòu)較單一，兩種有益菌對(duì)病原菌產(chǎn)生了拮抗。而在藍(lán)莓根表不同，根表是有皺褶空間的結(jié)構(gòu)，微生物孢子的形態(tài)決定了真菌對(duì)根系的親和力，進(jìn)而決定了優(yōu)勢(shì)真菌在根表的競(jìng)爭(zhēng)力。同樣，棘孢木霉R-F-01利用自身孢子優(yōu)勢(shì)迅速占據(jù)有利位點(diǎn)，縮小了禾谷鐮刀菌R-F-02的生存面積，抑制病原菌生長(zhǎng)。而關(guān)于棘孢木霉R-F-01在藍(lán)莓根表是否對(duì)禾谷鐮刀菌R-F-02產(chǎn)生拮抗作用，需后續(xù)探究。

綜上，本研究從三葉草根表分離并鑒定出一株棘孢木霉R-F-01，并首次揭示阿氏芽孢桿菌R-B-01和棘孢木霉R-F-01可通過(guò)空間競(jìng)爭(zhēng)的方式在藍(lán)莓根表發(fā)揮生防作用，其中棘孢木霉R-F-01的作用效果最好，其田間防治效果和安全性評(píng)價(jià)需要后期的研究和驗(yàn)證。此外，阿氏芽孢桿菌R-B-01、棘孢木霉R-F-01和禾谷鐮刀菌R-F-02刺激根系產(chǎn)生分枝的機(jī)制以及混合菌中阿氏芽孢桿菌R-B-01在根表的競(jìng)爭(zhēng)能力需要深入研究。