基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探析四妙散對于滑膜炎治療的潛在作用機制

王俊峰，關(guān)雪峰，楊永菊，張宇鵬，王 群

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

滑膜炎是指滑膜組織受到急性創(chuàng)傷或慢性勞損等刺激引起的無菌性炎癥，在臨床中患者多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動障礙等癥狀［1］。據(jù)統(tǒng)計，在我國滑膜炎的發(fā)病率很高約為7. 6%［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學對于滑膜炎治療主要采取口服非甾體抗炎藥及關(guān)節(jié)腔穿刺抽液治療，雖短時療效較好，但病因未除，仍會反復(fù)發(fā)作遷延不愈，嚴重影響患者日常生活［3］。傳統(tǒng)醫(yī)學中認為滑膜炎的發(fā)病是由于本體氣血虧虛，復(fù)感風寒濕之邪，致使邪氣入里化熱，流注于關(guān)節(jié)而引發(fā)的，其中濕熱內(nèi)蘊是本病發(fā)病的根本，治法應(yīng)以清熱利濕為主［4］。

四妙散首載于清代張秉成的《成方便讀》，具有清熱利濕，舒筋壯骨的功效，方由蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁四味藥物組成，蒼術(shù)寒涼苦燥以除濕邪之來源；黃柏辛苦而溫走下焦以除肝腎之濕熱；薏苡仁入陽明胃經(jīng)祛濕熱而利筋骨；牛膝補肝腎兼領(lǐng)諸藥之力以直入下焦，四藥合用對于濕熱下注的疾病治療效果顯著［5］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)的主要活性成分為倍半萜類、烯炔類、三萜及甾體類等化合物，具有抗炎、抗病毒等作用，尤以對類風濕性關(guān)節(jié)炎的療效顯著［6］；黃柏的主要化學成分為生物堿、黃酮類、甾醇類化合物，可以抗氧化、抑制細胞免疫反應(yīng)［7］；而牛膝主要為甾酮類、皂苷類和多糖類化合物，具有促進軟骨修復(fù)，抗脂質(zhì)過氧化等作用［8］；薏苡仁主要活性成分包括酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內(nèi)酰胺類等，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫的作用［9］。近來有研究表明四妙散可以通過抑制家兔血清中IL-1β 和TNF-α 的表達，達到治療創(chuàng)傷性滑膜炎的作用［10］。在探究四妙散對滑膜炎的治療效果中，劉晗等［11］研究發(fā)現(xiàn)四妙散不僅可以明顯降低滑膜炎患者外周血中炎性因子的表達水平，還可以降低致痛介質(zhì)前列腺素及NO、5-羥色胺的表達水平，證實了四妙散具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛效果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于大數(shù)據(jù)時代背景下的新興研究方法，基于系統(tǒng)生物學理論，通過利用多種網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和計算機軟件，構(gòu)建“中藥-基因-疾病”的關(guān)系網(wǎng)，為中藥復(fù)方潛在活性成分與作用靶點的研究提供指導(dǎo)［12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探究四妙散對于滑膜炎治療的潛在作用機制，以期對四妙散的臨床應(yīng)用及滑膜炎疾病的臨床研究提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 關(guān)鍵活性成分收集

以“蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁”為關(guān)鍵詞在TCMSP 系統(tǒng)（http：//Lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中查找以上四味藥物的組成成分及藥物所含化學成分信息。按照口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）篩選牛膝關(guān)鍵活性成分?？诜锢枚仁侵钢苿┲兴幬锉晃者M入人體循環(huán)的速度和成度，藥物相似度是指化合物與已知藥物的相似性，這兩者對于判斷藥物的活性成分具有重要意義，本研究根據(jù)以往研究，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 作為篩選藥物關(guān)鍵活性化合物的標準。

1.2 構(gòu)建四妙散化學成分-靶點基因-滑膜炎疾病的網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁化學成分的蛋白作用靶點，采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）查 詢 蛋 白 所 對 應(yīng) 的 基因，進行歸納總結(jié)，得到四妙散關(guān)鍵活性化合物基因。同 時 借 助Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫，以“synovitis”為關(guān)鍵詞檢索出與滑膜炎疾病相關(guān)的基因。并將得到的四妙散關(guān)鍵活性化合物基因和滑膜炎疾病基因結(jié)果輸入在線韋恩圖平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得交集基因和韋恩圖，并利用Cytoscape 軟件構(gòu)建可視化圖片。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI 網(wǎng)絡(luò)為蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其可以反映蛋白之間相互作用關(guān)系。將四妙散與滑膜炎疾病共同作用靶點基因?qū)雜tring 軟件中（https：//string-db.org/），物種選擇Homo sapiens，隱藏游離蛋白，并下載PPI 蛋白互作關(guān)系圖，篩選前30 個PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因，繪制柱狀圖。

1.4 相關(guān)信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用R 語言的Bioconductor 生物學數(shù)據(jù)包進行基因GO 功能和KEGG 通路富集分析，根據(jù)統(tǒng)計學意義，設(shè)置P值為0.05，Q值為0.05 進行GO 生物學富集分析和KEGG 通路富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot 柱狀圖和氣泡圖，最后分析結(jié)果討論四妙散對于滑膜炎的治療機制。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫按照OB≥30%，DL≥0.18 的標準進行篩選，得到四妙散的活性化合物75個，其中蒼術(shù)9 個，黃柏37 個，牛膝20 個，薏苡仁20個，剔除重復(fù)化合物共得到64 個關(guān)鍵活性化合物，包括巴馬汀、原藜蘆堿、四氫小檗堿等成分。選取前20 個活性化合物，按照OB 值的由大到小排序，見表1。

表1 四妙散前20 個關(guān)鍵活性化合物成分Tab 1 Top 20 key active compounds of Simiao powder

2.2 四妙散活性化合物靶點與滑膜炎疾病靶點交集基因

通 過Genecards、OMIM 和DisGeNET 等 數(shù) 據(jù)庫搜索與滑膜炎相關(guān)的靶點基因共884 個，將四妙散與滑膜炎的靶點基因?qū)隕xcel 中獲得四妙散-滑膜炎的共同靶點，利用在線韋恩圖平臺繪制韋恩圖，記錄共同靶點所對應(yīng)的滑膜炎關(guān)鍵化合物，剔除無關(guān)化合物。最終得到與四妙散-滑膜炎相關(guān)的關(guān)鍵化學成分37 種，四妙散-滑膜炎的共同靶點71個。見圖1。

圖1 四妙散-滑膜炎交集基因韋恩圖Fig 1 Venny diagram of Simiaosan-synovitis intersection genes

2.3 藥物-疾病靶點可視網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將2.2 中獲得的交集基因和37 種關(guān)鍵化合物導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建藥物-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共110 個節(jié)點（71 個基因，37 個關(guān)鍵化合物，1個疾病名稱，1 個藥物名稱），其中紫色三角表明37種關(guān)鍵化合物成分，活性化合物包括甾體類、黃酮類等化學種類。藍色菱形代表71 個交集基因。在上述網(wǎng)絡(luò)中，每一個節(jié)點的度值表示藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點之間相連的路線的條數(shù)。節(jié)點的度數(shù)越大代表其越有可能成為網(wǎng)絡(luò)中的中樞節(jié)點。從化學成分來看，度數(shù)排名在前四的為：槲皮素（quercetin）56）、山 奈 酚（kaempferol）（23）、漢 黃 芩 素（wogonin）（21）、黃芩素（baicalein）（15）。從靶點的角 度，度 數(shù) 前 四 的 分 別 為PTGS2、PTGS1、AR、PGR，其分別可以與28、21、16、15 個化合物發(fā)生作用。在根據(jù)以上的網(wǎng)絡(luò)的拓撲學性質(zhì)進行分析中，可以發(fā)現(xiàn)四妙散的關(guān)鍵的化合物可以對多個靶點具有調(diào)控作用，這種調(diào)控作用體現(xiàn)了藥物靶點的多樣性及生物網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同性。見圖2 及表2。

表2 四妙散治療滑膜炎交集基因Tab 2 Intersection genes of Simiao powder in treatment of synovitis

圖2 四妙散-滑膜炎可視化網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Simiaosan-synovitis visualization network

2.4 蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPICN）的構(gòu)建與篩選

將2.2 中獲得71 個交集基因輸入string 軟件中得到圖3，其中節(jié)點代表相關(guān)蛋白，每條邊代表蛋白與蛋白相互作用關(guān)系，邊數(shù)越多的蛋白表明其是核心蛋白的可能性越大，選取排名靠前的30 個蛋白構(gòu)建柱狀圖如圖4，前30 個蛋白名稱分別為：JUN、AKT1、MAPK1、RELA、FOS、IL6、MAPK14、ESR1、VEGFA、EGFR、CXCL8、IL1B、MAPK8、MYC、STAT1、CASP8、CCND1、PRKCA、BCL2、BCL2L1、CASP3、CCL2、EGF、IL2、IFNG、NFKBIA、CXCL2、FN1、IL10、NOS3。這些蛋白對于滑膜炎的治療起著關(guān)鍵的作用。

圖3 四妙散-滑膜炎蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Core network of interaction between Simiaosan-synovitis proteins

圖4 核心蛋白柱狀圖Fig 4 Core protein histogram

2.5 生物學（GO）富集分析結(jié)果

GO 富集分析結(jié)果共得到90 條GO 生物學富集過程，按照富集基因數(shù)目排名，排名靠前的主要為：細胞因子受體結(jié)合（CASP3/CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/STAT1/TNF/VEG -FA），受 體 配 體 活 性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/EGF/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），細胞因子活性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性（AR/ESR1/FOS/HIF1A/JUN/MYC/NFATC1/NR1I2/NR3C1/PGR/STAT1/TP53） ，生長因子受體結(jié)合（EGF/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/VEGFA），前20 位GO 生物學過程富集分析，見圖5。通過GO 生物學富集可以看出四妙散通過多種生物學調(diào)控達到治療滑膜炎的效果。

圖5 四妙散活性成分治療滑膜炎關(guān)鍵靶點的GO 生物學過程富集分析barplot 柱狀圖Fig 5 Barplot histogram of GO biological process enrichment analysis of key targets of Simiao powder in treatment of synovitis

2.6 靶點通路分析（KEGG）

通過KEGG 得到四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點基因主要富集在142 條通路（P＜0.05），提取前20個信號通路繪制barplot 柱狀圖和氣泡圖，見圖6、7。在142 條信號通路中與滑膜炎關(guān)系密切的有32 條信號通路，根據(jù)P值由小到大的排序繪制表3，表中涉及IL-17 信號通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號、Toll 樣受體信號通路等多種信號通路。這表明四妙散治療滑膜炎涉及不同信號通路的調(diào)控，且信號通路相互關(guān)聯(lián)，這體現(xiàn)了信號通路的協(xié)同發(fā)揮作用。

圖6 四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點富集信號通路barplot 柱狀圖Fig 6 Barplot histogram of signal pathway of key target enrichment of Simiao powder in treatment of synovitis

圖7 四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點富集信號通路氣泡圖Fig 7 Bubble chart of signal pathway enriched by key target of Simiao powder in treatment of synovitis

表3 四妙散與滑膜炎相關(guān)信號通路Tab 3 Signal pathways of Simiao powder and synovitis

3 討論

滑膜炎在傳統(tǒng)醫(yī)學中歸屬于“骨痹”“筋傷”等范疇?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗分兄赋觯骸皾駸岵蝗?，大筋軟短，小筋弛長，軟短為拘，弛長為痿”。《素問·至真要大論》中也提到：“諸脹腫大，皆屬于熱；……諸病胕腫，疼酸驚駭，皆屬于火。”［13，14］。本病病機在于濕熱閉阻，治法以清熱利濕，舒筋通絡(luò)為主，現(xiàn)代醫(yī)學認為滑膜組織中大量炎性細胞浸潤及滑膜細胞過度增殖是滑膜炎的主要病理特征，滑膜炎的發(fā)病也常常與骨性關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)等疾病關(guān)系密切［15］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討四妙散對于滑膜炎治療的潛在作用機制，通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到四妙散關(guān)鍵化學成分64 個，參與調(diào)節(jié)四妙散-滑膜炎相關(guān)的關(guān)鍵化學成分37 個，且度數(shù)在前四位的槲皮素、山奈酚、漢黃芩素和黃芩素均為黃酮類化合物。現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有具有良好的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛作用，可以對骨關(guān)節(jié)損傷類疾病具有良好的治療效果［16］。從靶點角度來看，排名靠前的為PTGS2（COX-2）和PTGS1（COX-1），二者均為前列腺素生成的主要限速酶。王鳳龍等［17］研究證實滑膜炎患者滑膜細胞培養(yǎng)的上清液中存在前列腺素過度表達情況，且通過藥物抑制前列腺素的表達，可以明顯改善滑膜細胞的炎性狀態(tài)［18］。AR 為雄激素受體，在網(wǎng)絡(luò)中共與16 個活性成分有關(guān)，現(xiàn)代研究表明，在炎癥期間低水平的雄激素會促使芳香化酶合成，芳香化酶會誘導(dǎo)雄激素轉(zhuǎn)換成雌激素，進而激活滑膜成纖維細胞，加重滑膜增生［19］。PGR 為孕激素受體，至少與15 個活性成分相關(guān)，以上四者均為四妙散的靶標核心。通過可視化網(wǎng)絡(luò)可見四妙散是通過多途徑多靶點發(fā)揮作用，并具有多種潛在作用機制。

PPI 是表明蛋白與蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，研究得到PPI 網(wǎng)絡(luò)中與炎性反應(yīng)蛋白居多，其中JUN、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK14 等均與滑膜細胞的炎性反應(yīng)有關(guān)，據(jù)此推測四妙散主要通過改善滑膜細胞的炎性狀態(tài)，達到治療滑膜炎疾病的作用。此外PPI 網(wǎng)絡(luò)也尚與細胞凋亡、微循環(huán)等有著密切的聯(lián)系，這也為探究藥物的作用機制提供了相應(yīng)的參考。

GO 生物學富集過程提示滑膜炎的治療與細胞因子受體結(jié)合和細胞因子活性密切相關(guān)，且主要抑制炎性基因酶活性，完成細胞修復(fù)與再生，這與PPI得到的結(jié)果相吻合。通過KEGG 信號通路富集分析，得到32 條與滑膜炎治療相關(guān)的信號通路，其中包括炎性反應(yīng)、細胞凋亡、微循環(huán)等多方面。（1）炎性反應(yīng)：富集數(shù)目最多的為IL-17 信號通路，Th17細胞主要分泌IL-17，IL-17 是一種促炎細胞因子，主要通過誘導(dǎo)破骨細胞和基質(zhì)金屬蛋白酶生成，加重關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)畸形［20］。TNF 是一種炎性反應(yīng)介質(zhì)，不僅可以誘導(dǎo)前列腺素膠原酶的分泌和滑膜細胞合成加重炎性反應(yīng)過程，還可以與TNFR1受 體 結(jié) 合，激 活NF-κB 與p38 信 號 通 路［21，22］。在 炎性反應(yīng)中，Toll 樣受體信號通路可與NF-κB 信號通路發(fā)生協(xié)同作用，兩者可以共同促使滑膜細胞異常增生［23］。MAPK 信號通路是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶系統(tǒng)，當受到外界刺激后，會激活MAPK 信號通路釋放轉(zhuǎn)錄活化因子，引起MAPK 逐級磷酸化，促使ERK 參與細胞的增值與分化，p38 參與炎性反應(yīng)的表達［24-35］。Wnt 信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖分化的重要通路之一，實驗性阻斷Wnt 信號通路，可以有效降低滑膜細胞中白細胞介素和RANKL 的表達，也有相關(guān)研究表明Wnt 信號通路可以對破骨細胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用［26］。（2）抗氧化損傷：FoxO信號通路可以調(diào)控細胞的增殖和氧化應(yīng)激反應(yīng)。FoxO 具有4 個同源基因，其中與滑膜細胞關(guān)系最為密切的是FoxO3a，俞晨等［27］研究發(fā)現(xiàn)通過藥物促進FoxO3a 的表達，可以有效提高成纖維滑膜細胞的抗氧化應(yīng)激能力。（3）細胞凋亡：主要與JAK-STAT 信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)炎性介質(zhì)IL-6 可以激活該信號通路，誘導(dǎo)STAT3 磷酸化，促使相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，增加滑膜細胞抗性［28］。（4）微循環(huán)：在微循環(huán)中，PI3K-Akt、VEGF 與HIF-1 可 以 表 現(xiàn) 出 協(xié) 同 作 用，PI3K-Akt 通路激活可以促使組織細胞炎性反應(yīng)增強，促使其下游底物mTOR 合成，mTOR 可以作為樞紐，調(diào)節(jié)下游目的基因VEGF、HIF-1 共同參與調(diào)控滑膜中新生血管生成［29］。Apelin 信號通路、脂肪因子及促炎因子等都可以加重骨性關(guān)節(jié)炎，而骨性關(guān)節(jié)炎是導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎的另一誘因［30］。KEGG 信號通路富集中結(jié)果顯示滑膜炎疾病治療與類風濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，這與目前已知的研究是相吻合的。

綜上所述，四妙散主要通過影響炎性反應(yīng)、細胞凋亡、微循環(huán)等途徑干預(yù)滑膜炎。研究通過構(gòu)建“中藥-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)對四妙散的關(guān)鍵活性成分以及靶標進行了預(yù)測，并將研究結(jié)果與已知實驗結(jié)果進行對比，所得結(jié)果真實可靠，為后續(xù)的四妙散的臨床應(yīng)用及滑膜炎相關(guān)疾病基礎(chǔ)與臨床研究提供了數(shù)據(jù)支持。