金納多對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能、海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及炎性因子的影響

孫微 王一帆 張佳月

(深圳市薩米醫(yī)療中心，廣東 深圳 518118)

血管性癡呆主要是各種腦血管因素導(dǎo)致的一種智能損害綜合征，以認(rèn)知功能、記憶功能缺損為主，可伴人格障礙、視空間技能障礙及語(yǔ)言障礙〔1,2〕。血管性癡呆是危害中老年人健康的一種疾病，具有較高發(fā)病率，成為全世界面臨的重大醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題，嚴(yán)重影響人們的生存質(zhì)量〔3,4〕。但目前關(guān)于血管性癡呆具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為其發(fā)病多與機(jī)體海馬區(qū)域神經(jīng)元損傷凋亡、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激等方面有關(guān)，且國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特效的治療血管性癡呆藥物，是醫(yī)學(xué)界研究的難題之一。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的作用，在防治各類腦血管疾病具有巨大優(yōu)勢(shì)和特色〔5,6〕。金納多又為銀杏葉提取注射物片，具有活血化瘀、通路功效，主要用于腦部、周邊和冠狀血流循環(huán)障礙。本研究探討金納多對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能、海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及炎性因子影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(220±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食飲水，控制溫度20～25℃，控制濕度50%～70%，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。金納多(生產(chǎn)廠家：Dr.Willmar-SchwabeGmbH&Co.KG；批準(zhǔn)文號(hào)：注冊(cè)證號(hào)H20140768)。

1.2主要試劑和儀器 主要試劑：兔抗Bcl-2抗體(Santa Cruz公司)，兔抗Bax抗體(Santa Cruz公司)，大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司)。主要儀器：1510型酶標(biāo)儀(廠家：美國(guó)Thermo公司)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(廠家：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，電泳儀(廠家：成都一科儀器設(shè)備有限公司)。

1.3血管性癡呆模型制備 采用3%戊巴比妥鈉注射液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿大鼠頸正中線切口切開(kāi)皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)。以0號(hào)手術(shù)線從血管下穿過(guò)，結(jié)扎右側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎。再對(duì)頸部手術(shù)切口進(jìn)行縫合且腹腔注射10萬(wàn)U青霉素注射液，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。3 d后將頸部手術(shù)線拆除，結(jié)扎大鼠左側(cè)頸動(dòng)脈且進(jìn)行縫合。以跨域平臺(tái)時(shí)間限制延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)限制少于正常大鼠，反應(yīng)遲鈍，精神變差為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)大鼠死亡，均造模成功。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 隨機(jī)分為正常組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只。正常組和模型組給予等劑量生理鹽水尾靜脈注射，1次d；實(shí)驗(yàn)組給予金納多10 mg/(kg·d)尾靜脈注射，1次/d。各組連續(xù)2 w。

1.5海馬組織形態(tài)學(xué) 取大鼠海馬組織，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，具體操作流程包括組織固定→脫水→透明→浸蠟→石蠟包埋→切片、撈片、展片→脫蠟→染色，觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.6認(rèn)知功能評(píng)價(jià) 認(rèn)知功能采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和敞箱實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：分為4個(gè)象限，將2 cm的浸沒(méi)式逃生平臺(tái)放置在與側(cè)壁和池中心等距的一個(gè)象限中間。以大鼠訓(xùn)練找到平臺(tái)，記錄所需時(shí)間，每只大鼠每日4次實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d。獲取逃避潛伏期和經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)。(2)敞箱實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入敞箱正中，其中垂直活動(dòng)得分為大鼠雙足離開(kāi)底面直立次數(shù)，而水平活動(dòng)得分為大鼠三足跨入鄰格的次數(shù)，測(cè)定5 min內(nèi)大鼠垂直活動(dòng)得分和水平活動(dòng)得分。

1.7Western印跡測(cè)定神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 麻醉大鼠，冰上操作迅速分離海馬，根據(jù)組織與蛋白提取劑1∶10(g/ml)比例稀釋，裂解組織。于4℃低溫條件下離心15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，將含目的蛋白的一抗Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)孵育于4℃下過(guò)夜。采用1×TBST溶液漂洗，再于耦聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000)放置室溫下作用2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，內(nèi)參選擇β-actin，蛋白相對(duì)量表示為目的蛋白條帶的平均吸光度值與β-actin的平均吸光度值的比值。

1.8海馬組織炎性因子測(cè)定 取大鼠腦組織，快速剪取右側(cè)海馬組織，稱重大鼠海馬組織后放置液氮速凍后置入-80℃冰箱保存待測(cè)。取海馬組織加入二羥基苯甲酸，放置于冰浴上超聲勻漿30 s，以15 cm半徑，15 000 r/min低溫離心12 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)比較 模型組海馬區(qū)神經(jīng)元大量死亡、變性，細(xì)胞體積縮小，核固縮、碎裂明顯、深染，胞質(zhì)濃縮呈深紅色染色；實(shí)驗(yàn)組較模型組海馬區(qū)神經(jīng)元變性和死亡明顯減輕，且大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞體縮?。徽＝M海馬區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則，胞核較大，胞質(zhì)豐富。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬組織形態(tài)學(xué)(HE染色，×400)

2.2各組逃避潛伏期和經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期長(zhǎng)于正常組且經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)多于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期短于模型組且經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組逃避潛伏期和經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)

2.3各組大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)積分比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組敞箱實(shí)驗(yàn)積分比較次/min，n=12)

2.4各組大鼠海馬組織Bax和Bcl-2蛋白比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組海馬組織Bax表達(dá)高于正常組，而B(niǎo)cl-2表達(dá)低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組海馬組織Bax表達(dá)低于模型組，而B(niǎo)cl-2表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 各組海馬組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)灰度值比較

圖2 各組海馬組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

2.5各組大鼠海馬組織炎性因子比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組海馬組織陽(yáng)性因子比較

3 討 論

血管性癡呆很大程度上損害了患者身心健康，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量，且給社會(huì)和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)〔7，8〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血管性癡呆發(fā)病多與興奮性氨基酸毒性作用、膽堿能功能障礙、胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度超載及海馬區(qū)域神經(jīng)元損傷凋亡等方面有關(guān)〔9，10〕。目前，臨床上關(guān)于血管性癡呆治療中，西藥主要應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑、抗氧化劑、鈣離子通道阻滯劑及改善血液循環(huán)藥等，但其臨床療效并不十分理想〔11〕。

中醫(yī)學(xué)歷史悠久，對(duì)癡呆最早追溯于《華佗神醫(yī)秘傳》，見(jiàn)于“文癡”“呆病”“健忘”等范疇，認(rèn)為其病機(jī)多為痰瘀內(nèi)阻、氣虛血阻、腎精虧虛、髓海不足、脾氣虧虛及神機(jī)失用等。依據(jù)絡(luò)病學(xué)說(shuō)理論，氣虛依靠腦絡(luò)的滲灌、經(jīng)脈的傳輸對(duì)腦的滋養(yǎng)、充灌功能。金納多主要為中草藥銀杏葉提取物，具有通經(jīng)止痛、活血化瘀等功效〔12，13〕?，F(xiàn)代藥理研究表明，金納多具有調(diào)節(jié)血管活性、抗血小板聚集、抗氧化、清除自由基、抗炎及調(diào)節(jié)血管活性等多種作用；金納多對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少血管緊張素的滲透，改善缺血患者的微循環(huán)及缺血損傷具有很好的保護(hù)作用〔14，15〕。本研究表明，金納多可改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能。

血管性癡呆學(xué)習(xí)能力下降一個(gè)重要原因是因腦缺血時(shí)海馬神經(jīng)元損傷。而其中海馬是人類學(xué)習(xí)功能的重要功能，在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中，Bcl-2家族成員具有重要作用，而其家族成員可分為抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2與促細(xì)胞凋亡基因Bax。Bcl-2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是有效的一種抑制神經(jīng)元壞死和凋亡的因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活和突出的發(fā)生〔16，17〕。本研究表明，金納多可通過(guò)下調(diào)Bax表達(dá)及上調(diào)Bcl-2表達(dá)而抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。

炎性因子表達(dá)貫穿于血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程〔18〕。IL-1β、IL-8和TNF-α表達(dá)與癡呆嚴(yán)重程度關(guān)系緊密。各種炎性細(xì)胞因子生物學(xué)效應(yīng)較為復(fù)雜，同時(shí)具有一定協(xié)同性，且炎性細(xì)胞因子間相互誘生如IL-1β和TNF-α均可誘發(fā)IL-8表達(dá)，從而形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，且能夠通過(guò)激活中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等，增強(qiáng)其吞噬殺傷功能，從而加重局部炎癥反應(yīng)，加重缺血性腦損傷〔19，20〕。本研究表明，金納多可通過(guò)降低IL-1β、IL-8和TNF-α水平而減輕炎性反應(yīng)。

綜上，金納多可改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能，抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及減輕炎性反應(yīng)。