鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在紫杉醇引起的外周神經(jīng)病理性疼痛中的分子作用

張書力 李少軍 袁峰 馮丹

(武漢市第一醫(yī)院疼痛科，湖北 武漢 430022)

我國的癌癥發(fā)病率和死亡率一直在上升，自2010年以來，癌癥已成為我國主要死因和一個重大公共衛(wèi)生問題，這將極大地增加醫(yī)療和社會負擔。2018年我國將有380萬余新發(fā)癌癥病例，雖然免疫治療在癌癥治療方面產(chǎn)生了巨大影響，但事實是，只有不到1/4的患者能從免疫療法中獲益〔1〕。傳統(tǒng)化療仍舊是主要的治療方式。然而化療期間會出現(xiàn)各種不同程度的副作用，諸如惡心嘔吐、口干舌燥、食欲缺乏、手腳麻木、毛發(fā)脫落、血細胞減少等，導致患者生存質(zhì)量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中止治療〔2 3〕?；熞鸬纳窠?jīng)病變是紫杉醇(PTX)和許多其他抗癌藥物包括鉑類化療藥物(順鉑、卡鉑、奧沙利鉑)、蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)、免疫調(diào)節(jié)劑(沙利度胺)、環(huán)氧酮(伊沙白酮)和長春花生物堿(長春新堿和長春堿)的一種非常常見且嚴重的副作用〔4〕。常見的神經(jīng)病癥狀包括手和(或)腳麻木、刺痛或感覺功能受損、對機械和寒冷刺激過敏、手指笨拙、周圍肌肉無力或行走困難〔5〕。研究顯示化療后第1個月檢測到的周圍神經(jīng)病變患病率為68%，3個月為60%，6個月或更長時間為30%〔6〕。多達40%～90%接受神經(jīng)毒性化療的患者會發(fā)展成周圍神經(jīng)病變，這可能導致患者生活質(zhì)量的下降〔3〕。隨著高效化學治療方法的不斷產(chǎn)生和癌癥患者存活率的提高，目前更多人開始關(guān)注患者的生活質(zhì)量和不良反應(yīng)的管理。因此PTX導致的周圍神經(jīng)病變是目前亟待解決的重要臨床問題。突觸后致密體中的主要成分鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ在神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放及神經(jīng)突觸的神經(jīng)傳導中有重要的生物學作用〔7,8〕，研究顯示應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑可顯著緩解神經(jīng)疼痛模型中C57/BL小鼠的痛覺過敏〔9〕，對于 CaMKⅡ是否在PTX引起的外周神經(jīng)病理性疼痛中有一定的作用目前尚無相關(guān)研究，本研究旨在探究CaMKⅡ在PTX誘導的神經(jīng)病理性疼痛模型中的表達及其在神經(jīng)病理性疼痛中的分子作用。

1 材料和方法

1.1實驗材料 PTX購自凱素(貨號#H20180650)，四合一痛覺測試系統(tǒng)購自法國bioseb(規(guī)格#2889)。CaMKⅡ抑制劑KN-62購自selleck生物有限公司(貨號#H39425)。C57/BL小鼠血漿白細胞介素(IL)-1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號#RD-IL-35295)和腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測試劑盒(貨號#RD-TNF-33958)均購自R&D公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司(貨號#A1145-1)。CaMKⅡ抗體購買自R&D公司(貨號為#MAB7280-SP)。JNK抗體(貨號#12382)、p-JNK(貨號#12379)抗體、c-Jun抗體(貨號#10374)、p-c-Jun(貨號#10372)抗體及P65抗體(貨號#3840)均購自CST。Tubulin抗體購自proteintech公司(貨號# a2219)。

1.2外周神經(jīng)病理性疼痛C57/BL小鼠模型 8～10周齡C57/BL/BL-6JC57/BL小鼠購自上海捷思杰動物有限公司，C57/BL小鼠平均體重為140～160 g,C57/BL小鼠飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，溫度22～24℃，濕度65%～75%，12 h光暗循環(huán)，自由進食和飲水。利用PTX腹腔注射模擬神經(jīng)病理性疼痛模型。24只C57/BL小鼠隨機分為對照組(NC組)和低劑量PTX處理組(L-PTX組)、中劑量PTX處理組(N-PTX組)和高劑量PTX處理組(H-PTX組)。PTX由醫(yī)院腫瘤科提供，PTX以5 mg/ml溶解在生理鹽水中。L-PTX組以1 mg/kg，1次/d腹腔注射，N-PTX組以3 mg/kg，1次/d腹腔注射，H-PTX組以6 mg/kg,1次/d腹腔注射，連續(xù)注射7 d模擬神經(jīng)病理性疼痛模型，NC組接受同等劑量的生理鹽水，每天均檢測C57/BL小鼠的機械疼痛反應(yīng)閾值。在實施動物實驗過程中，嚴格遵守動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.3機械刺激誘發(fā)抬腿實驗 運用機械刺激觀察C57/BL小鼠的抬腿反應(yīng)評估C57/BL小鼠的疼痛反應(yīng)閾值，通過一系列校準過的不同重量的纖毛壓力作用于C57/BL小鼠腳掌，觀察C57/BL小鼠的縮爪反應(yīng)，把引起縮爪反應(yīng)的纖毛壓力作為C57/BL小鼠的機械拉伸閾值所代表的疼痛反應(yīng)閾值。該實驗應(yīng)該在絕對安靜的環(huán)境中，C57/BL小鼠在測試前1 h單籠放置，防止由于C57/BL小鼠間相互打架導致結(jié)果偏移。當C57/BL小鼠靜止，用4只爪子站立時，按照順序逐漸增加纖毛重量〔(0.4,0.6,1.0,1.4,2.0,4.0)g〕，將絲狀物垂直于左后爪足底表面，施加足夠的力量使絲狀物彎曲成“S”形，彎曲時間為3 s，快速收回或舔舐爪子被認為是陽性反應(yīng)，連續(xù)刺激5次，如果C57/BL小鼠>3次發(fā)生縮爪反應(yīng)則為陽性，以C57/BL小鼠發(fā)生縮爪反應(yīng)的最低纖毛壓力作為C57/BL小鼠疼痛反應(yīng)的閾值(PWT)。

1.4熱板反應(yīng)實驗 使用足底測試儀評估C57/BL小鼠足部的熱敏感性。每只C57/BL小鼠都被放置在1個倒置的透明塑料籠子里面的薄玻璃平臺上，在開始測試前至少適應(yīng)30 min。在室溫下，后爪與1/4厚玻璃接觸，在后爪足底表面施加熱輻射刺激，利用光電敏感裝置自動測量足爪退縮反應(yīng)的潛伏期。熱強度設(shè)置為50℃，左后爪和右后爪之間交替測定爪子退出潛伏期，快速的后爪從熱光中縮回的動作被認為是陽性反應(yīng)，統(tǒng)計C57/BL小鼠足爪退縮反應(yīng)的潛伏期，評估C57/BL小鼠足部的熱敏感性。

1.5疼痛模型中相關(guān)分子表達 連續(xù)注射7 d PTX后，第8天用戊巴比妥深度麻醉C57/BL小鼠，經(jīng)心臟穿刺抽取適量(約500 μl)血液，然后心臟注射0.9%肝素鹽水(5 μl/g)使之肝素化，然后經(jīng)椎管高壓注射0.1%磷酸緩沖液取出整個脊髓，取脊髓膨大節(jié)段(L4～L6)，Western印跡檢測相關(guān)分子的表達。心臟穿刺所得血液4℃ 1 000 r/min離心獲得血清用于后續(xù)檢測。

1.6應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑處理C57/BL小鼠 為了進一步的分析CaMKⅡ在PTX引起的外周神經(jīng)病理性疼痛中的作用，應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑KN-62處理C57/BL小鼠。24只C57/BL小鼠隨機分為NC組和PTX組，PTX組以1 mg/(kg·d) 腹腔注射，連續(xù)注射7 d制造C57/BL小鼠疼痛模型。NC組接受同等劑量的生理鹽水。然后每組隨機分為2個亞組(n=6)，分別接受KN-62(5 mg/kg)處理，NC組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。CaMKⅡ抑制劑處理C57/BL小鼠12 h及36 h后評估C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值和C57/BL小鼠熱板反應(yīng)，方法同1.4取出血清和脊髓進行相關(guān)分子檢測。

1.7檢測C57/BL小鼠血液中驗證相關(guān)因子的表達 利用C57/BL小鼠血漿IL-1和TNF-α ELISA檢測試劑盒檢測C57/BL小鼠血清中炎癥因子的水平，所有的樣品采用復(fù)孔檢測，減少操作導致的誤差。操作根據(jù)試劑盒說明進行。

1.8LDH活性檢測 利用C57/BL小鼠血漿LDH活性檢測試劑盒檢測C57/BL小鼠血清中LDH的水平，所有的樣品采用復(fù)孔檢測，減少操作導致的誤差。操作根據(jù)試劑盒說明進行。

1.9Western印跡 用RIPA裂解脊髓膨大節(jié)段(L4～L6)，組織破碎儀震蕩，12 000 r/min離心20 min，去上清進行蛋白濃度測定，再用6倍上樣緩沖液制樣。上樣90 V恒壓電泳，然后以400 mA恒流將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后，在含5%BSA的TBST中的響應(yīng)一抗體4℃過夜，二抗室溫結(jié)合2 h，加入顯影液曝光顯影,分析目的蛋白相對表達量。

1.10統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism6.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1PTX處理C57/BL小鼠疼痛反應(yīng)閾值降低 四合一痛覺測試系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，不同濃度PTX處理C57/BL小鼠后，C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值隨著處理時間的增加呈下降趨勢(均P<0.05)，L-PTX組和N-PTX組C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值從誘導的第5天開始顯著低于NC組(P<0.05)。N-PTX組C57/BL小鼠熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期從誘導的第2天開始均顯著低于NC組(P<0.05)。見表1。熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期變化趨勢同機械刺激誘發(fā)抬腿實驗，L-PTX組C57/BL小鼠熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期從誘導的第3天開始顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。N-PTX組C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值從PTX處理的第2天開始顯著低于NC組(P<0.05)。H-PTX組(57/BL小鼠熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期從誘導的第1天開始顯著低于NC組(P<0.05)，見表2。表明PTX處理可顯著降低C57/BL小鼠的疼痛反應(yīng)閾值。為了降低PTX對C57/BL小鼠的藥物毒性作用，本研究選擇了低劑量PTX處理作為模擬神經(jīng)病理性疼痛模型的藥物濃度。

表1 PTX處理后C57/BL小鼠疼痛反應(yīng)閾值比較

表2 PTX處理后C57/BL小鼠足爪退縮反應(yīng)的潛伏期比較

2.2PTX處理C57/BL小鼠脊髓中CaMKⅡ表達增加 Western印跡檢測PTX處理C57/BL小鼠脊髓膨大節(jié)段(L4～L6)中CaMKⅡ激活，見圖1，隨著PTX劑量的增加，CaMKⅡ表達增加，L-PTX組、N-PTX組、H-PTX組較NC組CaMKⅡ表達增加1.47倍(P<0.05)，1.86倍(P<0.01)，2.11倍(P<0.001)。

圖1 PTX處理后C57/BL小鼠脊髓CaMKⅡ的表達

2.3CaMKⅡ抑制劑可增加C57/BL小鼠的疼痛反應(yīng)閾值 四合一痛覺測試系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，PTX處理C57/BL小鼠后，C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值隨著處理時間的增加呈下降趨勢，且從第3天開始的顯著低于NC組(P<0.05)。第7天開始，用KN-62處理后，CaMKⅡ抑制劑KN-62處理C57/BL小鼠12及36 h后PTX+KN-62組C57/BL小鼠機械刺激反應(yīng)閾值顯著高于PTX組(P<0.001)。見表3。CaMKⅡ抑制劑KN-62處理后C57/BL小鼠熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期變化趨勢同機械刺激誘發(fā)抬腿實驗，PTX組C57/BL小鼠熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期從第3天開始顯著低于NC組(P<0.05)。第7天開始，用KN-62處理后，CaMKⅡ抑制劑KN-62處理C57/BL小鼠12及36 h后PTX+KN-62組熱板刺激后爪退縮反應(yīng)的潛伏期顯著高于PTX組(P<0.001)。見表4。

表3 CaMKⅡ抑制劑處理后C57/BL小鼠疼痛反應(yīng)閾值比較

表4 CaMKⅡ抑制劑處理后C57/BL小鼠足爪退縮反應(yīng)的潛伏期比較

2.4CaMKⅡ抑制可降低C57/BL小鼠脊髓炎癥反應(yīng) ELISA結(jié)果顯示PTX誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛C57/BL小鼠模型中血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α水平顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明炎癥性疼痛在PTX誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛中介導一定的作用，同時給予CaMKⅡ抑制劑KN-62后，C57/BL小鼠血清中炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α、LDH水平顯著低于PTX組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表5。

表5 CaMKⅡ抑制劑處理后C57/BL小鼠炎癥因子水平及JNK/c-Jun、P65信號通路相對水平比較

2.5CaMKⅡ可促進JNK/c-Jun以及P65信號通路激活 Western印跡檢測結(jié)果顯示，KN-62可顯著抑制由PTX誘導的CaMKⅡ高表達(P<0.05)。PTX處理后C57/BL小鼠脊髓中JNK/c-Jun信號通路顯著激活，然而給予CaMKⅡ制劑KN-62后，JNK/c-Jun信號通路激活水平下降(P<0.05)，提示JNK/c-Jun信號通路可能在PTX-CaMKⅡ誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮一定的作用。進一步檢測NF-κB/P65信號通路可以發(fā)現(xiàn)，PTX-CaMKⅡ誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛中伴隨P65的激活，而給予CaMKⅡ抑制劑KN-62后，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/P65炎性信號通路下調(diào)。見表5、圖2。

圖2 CaMKⅡ抑制劑處理后C57/BL小鼠脊髓中JNK/c-Jun及P65信號通路蛋白表達

3 討 論

PTX是一種從裸子植物紅豆杉的樹皮分離提純的天然次生代謝產(chǎn)物，作為已發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)秀的天然抗癌藥物，PTX通過阻止癌細胞增殖分裂抑制腫瘤生長，廣泛用于治療各種癌癥,包括卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、膀胱、食道、頭部和頸部,多發(fā)性骨髓瘤等〔10〕。PTX是第1個新型的微管穩(wěn)定藥物可抑制癌細胞的有絲分裂和正常細胞分裂,促進微管蛋白的聚合。雖然PTX治療非常有效，但也存在一些嚴重的不良事件，包括周圍神經(jīng)毒性(42%～70%)、腎毒性(18%～34%)和過敏反應(yīng)(31%～45%)〔11〕，其中對周圍感覺和運動神經(jīng)元產(chǎn)生毒性引起的周圍神經(jīng)病變(CIPN)是PTX的主要不良反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明PTX可誘導C57/BL小鼠的痛覺過敏，刺激C57/BL小鼠的痛覺異常。同時PTX處理后可顯著增加C57/BL小鼠脊髓中CaMKⅡ的蛋白表達水平。Hasegawa等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)壓迫性刺激可誘導小鼠脊髓背根神經(jīng)元中CaMKⅡ的活性增加。上述結(jié)果提示CaMKⅡ可能參與了慢性神經(jīng)性疼痛的發(fā)生，不論是壓迫性神經(jīng)疼痛還是化療藥物引起的化學性神經(jīng)病理性疼痛。

本研究結(jié)果提示抑制CaMKⅡ可改善PTX誘導的神經(jīng)痛覺過敏現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑KN-62可改善四氯化碳誘導的異常性疼痛和痛覺過敏現(xiàn)象，Wang等〔13〕研究結(jié)果亦顯示應(yīng)用去甲腎上腺素可抑制CaMKⅡ的活性增加，進而緩解炎癥性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。上述研究結(jié)果均顯示CaMKⅡ在各種化學刺激包括PTX等誘導的炎癥性疼痛中具有重要的作用。

目前PTX引起的病理生理變化尚未明確，已有的研究顯示包括免疫介導的炎癥損傷、周圍纖維的丟失、脫髓鞘和軸突降解及線粒體功能障礙均參與了周圍神經(jīng)病變的發(fā)生〔14〕。目前周圍神經(jīng)病變的應(yīng)對措施僅是減緩癥狀的藥物，如抗驚厥藥、加巴噴丁、阿片類藥物，但仍然大部分無效，或者預(yù)防性使用神經(jīng)營養(yǎng)藥物如維生素E、阿米佛汀和谷胱甘肽，然而療效欠佳〔15〕。疼痛的基礎(chǔ)在于對有害刺激的痛覺感受，包括有害的化學、熱和機械刺激，然而炎癥會對有害刺激的反應(yīng)增強(痛覺過敏)，或誘導正常的無害刺激(痛覺異常)引起疼痛〔16〕。炎癥可以是全身性的(由創(chuàng)傷、手術(shù)或嚴重感染引起)，也可以是局部性的(由外部損傷引起)〔17〕。雖然炎癥過程引起的疼痛已被揭示，但PTX和炎癥性疼痛的關(guān)系仍有待闡明〔18〕。一旦這些機制被闡明，更多參與炎癥過程的分子可能被確定為PTX誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛的治療靶點，這些藥物可用來解決化療藥物PTX的副作用。本研究結(jié)果提示JNK/c-Jun及NF-κB/P65信號通路可能在PTX-CaMKⅡ誘導的外周神經(jīng)炎癥性疼痛中發(fā)揮一定的作用。Obata等〔19,20〕的研究結(jié)果顯示MAPK信號通路在神經(jīng)根炎癥和機械性異位性疼痛中ERK及JNK的磷酸化水平增加，促進炎性疼痛的發(fā)生。

綜上，CaMKⅡ參與了PTX誘導的痛覺過敏和外周神經(jīng)病理性疼痛，CaMKⅡ通過激活JNK/c-Jun及NF-κB/P65信號通路促進炎性疼痛的發(fā)生。應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑KN-62可改善PTX誘導的處理C57/BL小鼠疼痛反應(yīng)閾值降低，通過抑制JNK/c-Jun以及NF-κB/P65信號通路抑制炎癥反應(yīng)，改善小鼠的痛覺過敏現(xiàn)象。因此CaMKⅡ可以作用PTX誘導的外周神經(jīng)病理性疼痛的靶分子，是研發(fā)改善PTX神經(jīng)毒性的重要目標分子。因此篩選高效特異性的CaMKⅡ抑制劑是降低(或預(yù)防)癌癥藥物引起的神經(jīng)毒性，預(yù)防周圍神經(jīng)病變發(fā)生的一種有前途的方法。