丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀治療老年急性心肌梗死的療效及對NF-κB炎癥信號通路的影響

朱甘霖 王冬莉

(景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

急性心肌梗死(AMI)是心內(nèi)科常見病之一，梗死的發(fā)生常常源于冠狀動脈痙攣及粥樣硬化斑塊阻塞，異常的血脂代謝、炎性損傷性血管和血管內(nèi)皮功能障礙等也是疾病進展的關(guān)鍵因素〔1〕?，F(xiàn)今，臨床上對于AMI的治療普遍以西醫(yī)治療為主，瑞舒伐他汀為新一代他汀藥物，其除具有強效降脂作用外，亦可起到抑炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能及逆轉(zhuǎn)斑塊等功能〔2〕，對疾病歸轉(zhuǎn)具有一定正面價值。中醫(yī)技術(shù)在近些年發(fā)展迅速，在AMI治療中，中醫(yī)技術(shù)能夠與西醫(yī)治療手段進行結(jié)合，療效在一定程度上優(yōu)于傳統(tǒng)治療〔3，4〕。從丹參中能夠提取到一種名為丹參多酚酸鹽的成分，具有抗氧化、清除氧自由基、抗血小板聚集、改善血流變等多種藥效，而這些對于心血管系統(tǒng)具備很好的保護作用〔5〕。目前國內(nèi)就丹參多酚酸鹽聯(lián)合瑞舒伐他汀治療老年AMI鮮有報道，本文展開臨床對照性研究，探究其治療效果及相關(guān)可能的機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取76例老年AMI患者，均于2017年10月至2019年1月收治于景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院。入組需滿足：①符合AMI診斷標準〔6〕，且心電圖表現(xiàn)為ST抬高；②急性起病，且病程在48 h內(nèi)；③美國紐約心臟病協(xié)會(NYHA)分級為Ⅱ～Ⅲ級；④年齡≥60歲；⑤患者知曉研究并自主簽署知情同意。需排除以下患者：①對他汀類、丹參多酚酸鹽有過敏反應(yīng)或伴有某種疾病可能影響藥物吸收；②患者合并急、慢性感染或存在嚴重凝血功能障礙；③短期內(nèi)(<90 d)接受過較大手術(shù)或短期內(nèi)腦血管意外發(fā)生；④患者合并其他較重疾病，如心力衰竭、肝腎功能不全等；⑤合并嚴重免疫系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意，并將納入病例隨機分為研究組(38例)與對照組(38例)。研究組男23例、女15例；年齡60～81歲，平均年齡為(68.06±8.86)歲；病程1～45 h，平均病程為(21.16±5.87)h；NYHA分級：Ⅱ級29例，Ⅲ級9例。對照組男22例、女16例，年齡在60～79歲；平均年齡為(69.11±9.05)歲；病程1～43 h，平均病程為(20.77±5.92)h；NYHA分級：Ⅱ級27例，Ⅲ級11例。兩組基線資料無顯著差異(P>0.05)，可進行后續(xù)研究。

1.2方法 兩組入院后均接受常規(guī)綜合治療，包括低分子肝素鈣注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司；國藥準字：H20000706；規(guī)格：0.4 ml∶4 000 IU)皮下注射(5 000 IU/次，2次/d)、阿司匹林腸溶膠囊(華中藥業(yè)股份有限公司；國藥準字：H42022876；規(guī)格：0.3 g/粒)口服(300 mg/次，1次/d)、注射用尿激酶(廣東健信制藥股份有限公司；國藥準字：H20033051；規(guī)格：2.5×106U)靜滴溶栓(2.5×106U加入200 ml生理鹽水，1次/d)。對照組：在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上，額外給予患者口服瑞舒伐他汀鈣片(南京正大天晴制藥有限公司；國藥準字H20080670；規(guī)格：10 mg/片)，進行輔助治療。劑量為10～40 mg/次，可根據(jù)病情輕重追加。研究組在對照組基礎(chǔ)上，額外給予患者多普賽(丹參多酚酸鹽注射液，上海綠谷制藥有限公司，國藥準字Z20050248；規(guī)格：0.1 g/瓶)200 mg+5%葡萄糖溶液250ml通過靜脈滴注給藥，1次/d。兩組均治療滿2 w。

1.3觀察指標

1.3.1檢測NF-κB p50、p65 mRNA水平 利用熒光定量PCR法(q-PCR)，首先通過酚氯仿方法在加入Trizol裂解的患者血液中提取總RNA，并進行質(zhì)量檢測，確保OD260/280值合格。接下來將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(此步驟參照試劑盒步驟進行)。設(shè)計合成目的基因引物，并以β-actin為內(nèi)參，同一批cDNA樣品配制q-PCR體系，上機進行擴增循環(huán)，檢測目的基因及內(nèi)參基因的Ct值。程序結(jié)束后分析溶解曲線確保過程正確，計算樣品中目的基因mRNA水平相對表達情況2-ΔΔCt。目的基因引物由Primer軟件設(shè)計，見表1。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3.2檢測NF-κB p50、p65蛋白表達水平 首先利用紅細胞裂解液200 μl對外周血中紅細胞進行裂解，整個過程放于冰上約30 min，以保證裂解完全，裂解后進行離心，3 000 r/min離心10 min，獲得上清即為細胞裂解液。用蛋白質(zhì)定量二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白濃度的測定，確定蛋白樣本上樣量為30 μg/孔，進行Western印跡。目的條帶的分離采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDA-PAGE)，待目的條帶分離完全，結(jié)束電泳并將凝膠的條帶轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，配制10%脫脂奶粉的封閉液，室溫條件下?lián)u床孵育2 h。封閉結(jié)束后，加入一抗抗體稀釋液，4℃過夜孵育。次日，洗凈膜，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵1 h，利用電化學發(fā)光(ECL)掃膜儀進行結(jié)果掃描。同樣以管家基因β-actin為內(nèi)參。采用軟件對條帶進行半定量分析。

1.3.3心肌酶譜指標 采集同一位患者未經(jīng)治療及治療后，空腹狀態(tài)下的外周靜脈血6 ml，在37℃下恒溫水浴30 min，水浴結(jié)束離心3 000 r/min 10 min，將上清液吸出轉(zhuǎn)至-20℃冷凍保存，待集齊標本后測定。指標為血清中肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)及心肌肌鈣蛋白(cTn)I，檢測儀器為日立7080全自動生化分析儀。

1.3.4炎癥反應(yīng)指標 選擇白細胞介素(IL)-8、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α 3種指標，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法對1.3.3中同樣方法制備的血清進行檢測。

1.3.5氧化應(yīng)激指標 超氧化物歧化酶(SOD)檢測應(yīng)用羚胺方法；丙二醛(MDA)測定應(yīng)用硫代巴比妥酸法；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定應(yīng)用比色法，對1.3.3中同樣方法制備的血清進行檢測。

1.3.6療效判定 依據(jù)已有報道〔7〕，對于患者療效進行判定：治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少>80%，心電圖靜息恢復(fù)正常為顯效；治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少50%～80%，心電圖ST 段回升≥0.05 mV，但未達正常水平為好轉(zhuǎn)；治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少<500%，心電圖ST段降低超過0.05 mV為無效?？傆行?顯效+好轉(zhuǎn)。

1.3.7不良反應(yīng) 對兩組不良反應(yīng)發(fā)生率進行統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1比較兩組NF-κB p50、p65 mRNA表達水平和蛋白表達水平 治療前，兩組NF-κB p50、p65 mRNA表達水平和蛋白表達水平，無顯著差異(P>0.05)；治療后，相比于治療前，患者NF-κB p50、p65 mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著降低，且研究組均顯著低于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達水平比較

2.2兩組心肌酶譜指標比較 治療前，CK、CK-MB、cTnI水平在兩組間無顯著差異(P>0.05)；治療后，研究組與對照組CK、CK-MB、cTnI水平均明顯降低，且研究組降低更為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 兩組心肌酶譜指標比較

2.3兩組炎癥反應(yīng)指標比較 兩組治療前血清TNF-α、IL-8、IL-1β水平差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后TNF-α、IL-8、IL-1β水平在兩組中相比于治療前均明顯下降，且研究組下降更為顯著(P<0.01)。見表4。

表4 兩組炎癥反應(yīng)指標比較

2.4兩組氧化應(yīng)激指標比較 兩組治療前氧化應(yīng)激水平相對一致，治療后兩組氧化應(yīng)激情況均顯著改善，SOD、GSH-Px水平均顯著上升；研究組較對照組改善更佳，回升趨勢更顯著(P<0.01)；MDA水平均顯著降低，同樣研究組降低更顯著(P<0.01)。見表5。

表5 兩組氧化應(yīng)激指標比較

2.5兩組臨床療效比較 研究組總有效率明顯高于對照組(P=0.01)。見表6。

表6 兩組臨床療效比較〔n(%),n=38〕

2.6兩組不良心血管事件發(fā)生率比較 隨訪過程中研究組存在1例心律失常，1例血運重建，對照組出現(xiàn)復(fù)發(fā)性心絞痛1例、血運重建3例，研究組不良心血管事件發(fā)生率(5.26%)低于對照組(10.53%)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且都在后續(xù)治療中得到緩解。

3 討 論

大多數(shù)AMI是由急性冠狀動脈狹窄或閉塞引起的，AMI具有迅速發(fā)作，高致殘率等特點。如果不及時治療，很容易并發(fā)心力衰竭，休克甚至猝死，嚴重危及患者生命〔8〕。老年群體發(fā)生AMI預(yù)后情況則更差，死亡率也明顯高于年輕群體〔9〕。

本研究結(jié)果表明，說明治療中加入丹參多酚酸鹽注射液能有效減輕心肌細胞的損傷，降低細胞凋亡，阻滯心功能的不斷變化，綜合提高AMI療效，可能原因為丹參多酚酸鹽注射液能夠一定程度上抗血小板，促進血管的舒張，血管通透性有所增加，從而避免心肌細胞的異常結(jié)構(gòu)，保障了血液和氧氣供應(yīng)心肌，心肌功能則得到保護。

臨床試驗報道〔10〕，在AMI發(fā)生及進展的過程中，NF-κB炎癥信號通路激活，這一病理機制其既能相對穩(wěn)定心臟內(nèi)環(huán)境，又能夠介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答。NF-κB信號通路涉及多個分子，調(diào)控多種生理病理過程，其激活機制也相對復(fù)雜。正常靜息狀態(tài)時，其細胞質(zhì)中存在形式為p50/p65二聚體，其抑制蛋白IκB可與這兩個亞基的同源和(或)異源二聚體上再結(jié)合，形成三聚體，但不具有活性〔11〕。發(fā)生炎癥反應(yīng)時，NF-κB受到炎癥反應(yīng)刺激激活，誘導(dǎo)大量的TNF-α和IL-1β分泌，進而激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物IKKs，IKKs則可以磷酸化靜息狀態(tài)下無活性的p50/p65/IκB三聚體IκB亞基調(diào)節(jié)位點的絲氨酸，為IκB亞基增添泛素化，從而經(jīng)蛋白酶途徑降解，釋放出p50/p65，使二者發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與結(jié)合到相應(yīng)靶基因上的κB位點，進而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。林慶賓等〔12〕研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷病情進展會使得TNF-α、IL-8、IL-1β這3種炎癥細胞因子的表達持續(xù)升高，因此該指標可以有效地反映疾病的嚴重程度。TNF-α和IL-1β在炎癥反應(yīng)發(fā)生時大量分泌，再進一步激活炎性細胞，這種炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)對于遠隔臟器的功能亦具有損傷效果，損傷后再次正反饋激活NF-κB，加劇了細胞內(nèi)膜和基底膜的受損，血管阻力和心臟后負荷隨之增加〔13〕。IL-8被NF-κB的過表達激活和釋放，可以在心臟中誘導(dǎo)中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞積蓄，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生大量蛋白酶，這都對心肌組織有直接損害，從而加重病情〔14〕。以上均表明，AMI患者在這樣的炎性損害中長期循環(huán)，而患有AMI的老年群體，他們除了AMI損傷外，本身患有基礎(chǔ)性、慢性炎性疾病，因此老年人受到NF-κB活化所造成的炎性損害循環(huán)更嚴重，對于老年群體AMI的治療，抑制NF-κB的激活或許是其治療的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀對于減少炎癥反應(yīng)中炎性因子釋放、抑制炎癥反應(yīng)激活的NF-κB信號通路均顯示出良好的作用。

根據(jù)有關(guān)報道〔15〕，炎癥反應(yīng)發(fā)生會使炎性細胞發(fā)生“呼吸爆發(fā)”，在這一過程中釋放了大量的氧自由基，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進氧化，打破了機體氧化與抗氧化作用之間的平衡，損害心肌細胞脂質(zhì)，引起冠脈流量減少，加重病情。本研究結(jié)果表明，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀可抑制機體的氧化應(yīng)激，促使心肌細胞恢復(fù)耗氧/抗氧化平衡。這主要與丹酚酸鹽和瑞舒伐他汀對血液黏度和冠狀動脈血流的改善有關(guān)。 本研究對患者在藥物使用期間的安全性也進行觀察，不良心血管事件在兩組中均有發(fā)生，研究組發(fā)生率略低于對照組，本研究認為這可能與瑞舒伐他汀的長期治療有關(guān)，可能會產(chǎn)生心絞痛，血液循環(huán)重建和其他不良心血管事件，而本研究將丹參多酚酸鹽注射液與瑞舒伐他汀序貫治療后，可在一定程度上減短瑞舒伐他汀治療周期。

綜上所述，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀對于減輕老年AMI患者心肌損傷有顯著效果，藥物作用過程中炎性因子釋放、NF-κB炎癥信號通路活化受到抑制，機體氧化應(yīng)激狀態(tài)有所改善，進而減輕患者心肌損傷。盡管得出有效結(jié)論，但由于有限的病例數(shù)，在樣本的選擇上也存在著一定的偏倚，在后續(xù)的研究中，應(yīng)結(jié)合臨床實際情況，針對改善老年AMI治療方案及療效，探究相關(guān)作用機制，進行長期的、包括更多前瞻性、大樣本、多中心的研究，為優(yōu)化老年AMI臨床治療建立研究基礎(chǔ)。