連作方式對蕨麻根際土壤真菌群落結構的影響

王雅瓊，劉吉宏，李軍喬，白世俊

(1. 青海民族大學 生態(tài)環(huán)境與資源學院, 西寧 810007； 2.青海省生物技術與分析測試重點實驗室-青藏高原蕨麻研究中心, 西寧 810007； 3. 西寧市氣象局, 西寧 810016)

蕨麻(PotentillaanserinaL.)是多年生草本植物，屬于薔薇科(Rosacrae)委陵菜屬(Potentilla)。在高原地區(qū)生長的蕨麻，其地下根系膨大，富含淀粉、蛋白質、多糖、總黃酮等營養(yǎng)物質和有效成分[1]，因具有抗缺氧、保肝護肝、降低血脂及膽固醇、提高機體免疫力、抑制病菌等作用，在《晶珠本草》《四部醫(yī)典》中均有記載，民間常將其作為食品、保健品和藏藥使用[2]。蕨麻作為青海省的特色農(nóng)產(chǎn)品，為青海省農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟的發(fā)展創(chuàng)造了條件，但對野生蕨麻的無序采挖對自然環(huán)境產(chǎn)生了很大的破壞?；诖?，本課題組先后培育了3個人工栽培新品種。在長期的人工種植條件下，蕨麻的產(chǎn)量和品質有所下降，由于土壤健康對植物的高效優(yōu)質生產(chǎn)至關重要，為了尋找蕨麻連作的影響因素，本課題組展開了對根際土壤的研究。

根際是指植物根系周圍的特殊土壤，作為土壤水分和養(yǎng)分進入植物根系的門戶，是受根系自身的生命活動影響最直接、最強烈的區(qū)域[3]。植物的生長和產(chǎn)量與根際土壤營養(yǎng)狀況和微生物群落結構等因素密切相關。其中，根際真菌對植物產(chǎn)生強烈影響，腐生真菌產(chǎn)生的胞外酶能夠分解和調動植物凋落物[4]，外生菌根真菌能夠與植物共生[5]，叢枝菌根真菌通過改變土壤營養(yǎng)物質濃度促進植物養(yǎng)分獲取[6]，病原菌通過造成植物病害使植物種群數(shù)量發(fā)生改變[7]。植物對根際真菌也會產(chǎn)生調節(jié)作用，例如，根對水分、營養(yǎng)物質的富集和根部的脫落物給真菌群落創(chuàng)造的特殊生境[4]。

本研究以青藏高原蕨麻研究中心審定的作物新品種“青海蕨麻2號”為試驗對象，測定蕨麻根際土壤的養(yǎng)分含量和真菌多樣性，探討蕨麻生長和環(huán)境條件對真菌群落結構的影響，以期為蕨麻人工高產(chǎn)栽培中健康土壤的構建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)概況

采樣區(qū)位于青海省湟源縣日月鄉(xiāng)(36°31′30″ N～36°32′40″ N，101°7′51″ E～101°10′24″ E)，該區(qū)屬大陸性高原溫帶半干旱氣候，四季分明，晝夜溫差大，2018年年均氣溫4.8 ℃，年降水量515.4 mm。采樣地設在“青海蕨麻2號”試驗種植區(qū)，3個不同實驗區(qū)的種植年限分別為連作1年、4年和8年。2018年4月進行播種，所有肥料作底肥一次施入，不追肥。

1.2 樣品采集

蕨麻利用塊根進行無性繁殖，分別在蕨麻萌芽期、開花期、塊根膨大期和塊根收獲期進行4次采樣。采樣方法為隨機采樣法，在同一生長周期的不同實驗區(qū)里分別隨機設置3個樣方，每個樣方內選擇長勢一致的蕨麻5株，利用抖土法取樣，5個土樣混合均勻后代表一個樣品，3個樣方采集的樣品代表3個生物學重復。將采集的樣品用滅菌自封袋密封置于冰盒中帶回實驗室，去除雜質，過2 mm篩后平均分為兩份，一份自然風干用于土壤養(yǎng)分測定，另一份置于-80 ℃冰箱儲存，用于真菌群落分析[8]。采用國標方法測定土壤中全氮、全磷、全鉀、速效氮、有效磷和速效鉀含量。

1.3 DNA提取與建庫

使用QIAampPowerFecal DNA試劑盒(QIAGEN，德國)從0.5 g土壤樣品中提取DNA。使用正向引物86F，5′-GTGARTCATCGAATCTTT-3′和反向引物805R，5′-GATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′[9]通過PCR擴增真菌ITS rDNA V2區(qū)。PCR反應體系包括：5 μL 5 × GC緩沖液，0.5 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μLTaqDNA聚合酶，0.5 μL引物(10 pmol/L)和50 ～100 ng模板DNA混合成25 μL體系。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；25個循環(huán),95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃再延伸5 min。使用AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物，去除游離引物和引物二聚體等。使用上述引物擴增PCR純化的產(chǎn)物，其中每個樣品用獨特的八堿基序列條形碼來進行區(qū)分。然后，配置25 μL PCR反應體系包括，5 μL 5 × GC緩沖液，0.75 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μLTaqDNA聚合酶，1.5 μL引物(10 pmol/L)和5 μL純化產(chǎn)物。PCR反應條件為95 ℃預變性3 min，然后8個循環(huán)，反應條件同上。通過AMPure XP磁珠純化擴增產(chǎn)物形成文庫，使用Illumina MiSeq 2500測序平臺完成測序。

1.4 生物信息學和統(tǒng)計分析

采用FLASH將測序得到的雙端序列進行拼接。對目標序列進行質控過濾fastq_quality_filter(-p 90-q 25-Q33FASTX Toolkit 0.0.14)，過濾后的序列與參考數(shù)據(jù)庫USEARCH作比對，去除嵌合體得到優(yōu)化序列。通過隨機減法，根據(jù)樣本的最小值對每個樣本的讀取次數(shù)進行歸一化。根據(jù)97%的序列相似性水平，利用QIIME的Uclust算法進行OTU聚類分析，基于UNITE參考數(shù)據(jù)庫，對每個樣品的OTUs進行物種分類學注釋。基于加權和非加權Unifrac距離矩陣計算樣本的Alpha和Beta多樣性。同時，我們使用線性判別分析(LDA)效應大小(LEfSe)方法來識別群體間豐度差異具有統(tǒng)計學意義的物種[10]。主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)采用CANOCO 5.0軟件進行；皮爾森相關性分析和單因素方差分析采用SPSS 22.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 采樣地土壤養(yǎng)分特征

分析不同種植年限、不同生長周期蕨麻根際土壤的營養(yǎng)狀況，對全氮、全磷、全鉀、速效氮、有效磷和速效鉀進行主成分分析(圖1)。結果表明，PCA1和PCA2共同解釋了總變異的93.82%，可以全面顯示研究區(qū)域土壤營養(yǎng)狀況的分異特征。不同種植年限的土壤營養(yǎng)狀況沿PCA1明顯分開，存在顯著差異，對第1主成分起主要作用的營養(yǎng)物質為全氮，而速效鉀對第2主成分的貢獻較大。

○：連作1年；△：連作4年；□：連作8年。紅色：萌芽期；黃色：開花期；綠色：塊根膨大期；藍色：塊根收獲期。圖1 3個蕨麻種植試驗田土壤營養(yǎng)因素主成分分析Figure 1 Principal component analysis of the nutritional variables measured at the three planting fields of Potentilla anserina L.

2.2 蕨麻根際土壤中真菌的群落結構

通過Illumina測序平臺，蕨麻根際土壤中共獲得1 023 967條序列，各個樣品的序列范圍為27 460～29 626條。按照97%閾值聚類后的OTUs數(shù)目為700個，分屬于5個門，14個綱，31個目，42個科和64個屬。在所有OTUs中，有43%無法注釋到真菌門，5個已知真菌門分別為子囊菌門，擔子菌門，壺菌門，球囊菌門和接合菌門，其中，子囊菌門種類最豐富，有292個OTUs(590 998條序列)，之后依次為51個OTUs(21 500條序列)，7個OTUs(8 809條序列)，26個OTUs(4 012條序列)和23個OTUs(72 654條序列)，見圖2(a)。

在64個真菌屬中，平均相對豐度大于1%的優(yōu)勢真菌屬有5個[圖2(b)和圖3(a)]，分別是莖點霉屬(Phoma)、光黑殼屬(Preussia)、Cadophora、鐮孢菌屬(Fusarium)和被孢霉屬(Mortierella)；平均相對豐度在0.1%～1%的真菌屬有12個，見圖3(b)。由圖2(b)可知，5個優(yōu)勢屬的豐度在不同種植年限、不同生長階段均存在差異，在連作1年的根際土中鐮孢菌屬占優(yōu)勢，連作4年的根際土中Cadophora和被孢霉屬占優(yōu)勢，連作8年的根際土中被孢霉屬占優(yōu)勢。由此可見，連作能夠改變蕨麻根際土壤真菌的群落結構，優(yōu)勢真菌屬及其豐度均發(fā)生了變化。

每個柱形代表3個生物學重復的平均值。圖2 蕨麻種植試驗田土壤真菌門(a)和優(yōu)勢真菌屬(b)的相對豐度 Figure 2 Relative abundances of the fungal phyla (a) and dominantfungal genera (b)across all samples collected from plantingfields of Potentilla anserina L.

(a)平均相對豐度>1%的真菌屬；(b)平均相對豐度> 0.1%的真菌屬。誤差條顯示每個平均值的標準偏差。圖3 蕨麻種植試驗田土壤真菌屬的平均相對豐度Figure 3 Average relative abundance of fungal genera in across all samples collected from planting fields of Potentilla anserina L.

2.3 蕨麻根際土壤中真菌的α-多樣性

用Good’s coverage，Chao 1和Shannon多樣性指數(shù)來估算和比較蕨麻根際土壤中真菌群落的多樣性。Good’s coverage指數(shù)的變化范圍是99.66%～99.79%，表明測序的結果覆蓋了主要的真菌類群。Shannon和Chao 1指數(shù)的變化范圍分別是3.88～6.55和370.13～521.10。方差分析顯示：蕨麻開花期根際土壤中的真菌多樣性顯著低于其他生長階段(Shannon，P<0.05)；連作4年的土壤真菌豐富度顯著高于其他連作年限(Chao1，P<0.05)，而測序覆蓋度顯著低于其他連作土壤(Good’s coverage，P<0.01)，表明土壤樣品中真菌的均勻度和豐富度均發(fā)生了變化。

2.4 蕨麻根際土壤中真菌的β-多樣性

主坐標分析圖顯示了蕨麻4個生長階段根際真菌OTU組成的差異(圖4)。PC1和PC2解釋貢獻率分別為16.72%和13.87%，不同生長階段的真菌OTU組成沒有顯著差異。然而，對真菌群落進行LEfSe分析觀察發(fā)現(xiàn)，在蕨麻不同生長階段根際土壤中存在具有統(tǒng)計學差異的生物標識物，即組間差異顯著的物種(圖5)。由以上結果可以看出，蕨麻根際真菌群落隨著不同生長階段發(fā)生了改變。

圖4 基于Bray-Curtis距離的主坐標分析圖顯示了蕨麻4個生長階段根際真菌的β-多樣性Figure 4 Principal coordinate analysisplot based on Bray-Curtis distance showing the β-diversity of rhizosphere fungal communities among the four growth stages of Potentilla anserina L.

圖5 利用線性判別分析分值對蕨麻4個生長階段真菌不同分類水平的菌群進行富集(截斷值≥2)Figure 5 Enriched taxa of different fungal level from the four growth stages of Potentilla anserina L. with a linear discriminant analysis score (cut off value ≥2)

2.5 土壤環(huán)境對蕨麻根際土壤真菌群落組成的影響

利用冗余分析了解土壤養(yǎng)分對真菌群落結構的影響，結果(圖6)顯示RDA1和RDA2累計解釋真菌群落結構變異的變量達到29.89%，速效鉀的影響顯著(P< 0.05)，且接合菌門和土壤全鉀呈正相關，子囊菌門與土壤養(yǎng)分關系較小。

圖6 蕨麻根際土壤真菌門與土壤養(yǎng)分的冗余分析Figure 6 Redundancyan alysis of soil fungus phylum and soil nutrient in rhizosphere of Potentilla anserina L.

對蕨麻根際真菌群落多樣性與土壤營養(yǎng)元素進行相關性分析，結果(表1)顯示：土壤全磷、速效氮與Chao 1指數(shù)呈負相關，土壤速效氮、速效磷與Shannon指數(shù)呈負相關，表明較高含量的土壤全磷、速效氮、速效磷會抑制根際土壤真菌豐富度和多樣性，土壤中養(yǎng)分含量是影響根際土壤真菌多樣性的驅動因子之一。

表1 真菌多樣性和環(huán)境因子相關性統(tǒng)計Table 1 Statistical analysis of correlations between environmental factors and fungal diversity

蕨麻根際土壤中平均相對豐度大于0.1%的真菌屬與土壤養(yǎng)分含量進行相關性分析(表2)表明，鏈格孢屬、鐮孢菌屬和微座孢屬與全氮含量正相關；毛殼菌屬、微座孢屬與全磷含量正相關；毛殼菌屬、錐蓋傘屬與速效氮含量正相關；Cadophora與速效鉀含量正相關；小不整球殼屬與全鉀、速效氮、速效磷含量負相關。以上結果表明，真菌屬的變化與土壤中養(yǎng)分含量相關。

表2 環(huán)境因子與真菌屬相關性統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of correlations between environmental factors and fungal genera

3 討論與結論

蕨麻根際土中的真菌群落結構在不同連作年限和不同生長階段均存在變化，子囊菌門占絕對優(yōu)勢[圖2 (a)]，這與番茄[11-12]和馬鈴薯[13]根際真菌的研究結果一致。有研究認為，子囊菌門真菌是一些傳染性疾病的病原體和重要參與者，在本研究中占優(yōu)勢的真菌屬[圖3(a)]對植物的影響已有多項研究，例如，莖點霉屬能夠引起紫花苜蓿的褐色根腐病[14]，鐮孢菌屬能夠造成馬鈴薯[13]和番茄[11]的病害，光黑殼屬能夠產(chǎn)生抗菌活性物質[15]，Cadophora對植物生長有益[16]。

研究中α-多樣性分析結果顯示蕨麻開花期根際真菌多樣性顯著降低(P< 0.05)，并且蕨麻每個生長階段生物標志物都不同(圖5)。這些變化可能與特殊生長階段根系分泌物有關[17]，有研究對比了馬鈴薯在連作、輪作種植時不同生長階段根系的分泌物，發(fā)現(xiàn)其種類和數(shù)量均存在很大差異[18]，而且在構建土壤真菌群落中發(fā)揮重要作用[19]。與本研究結果類似，烤煙生育中后期土壤真菌群落最為豐富[20]，土壤AM真菌的群落結構變化隨著棉花生育期的不同會有短暫的變化[21]，哈密瓜根際真菌群落結構同樣隨生育期發(fā)生改變[22]。

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，微生物多樣性受到栽培技術、作物連作或輪作、植物物種和氣候變化等因素影響，其中連作對微生物有顯著影響。許自成[20]、陳一峰[23]等利用PCR-DGGE技術研究了不同作物根際土壤的真菌群落結構，結果均顯示連作對根際土壤真菌群落有較大影響。劉偉等[24]利用高通量測序技術研究了丹參連作年限對根際土壤真菌的影響，結果顯示連作對真菌群落在界、綱及屬不同分類水平上均有較大影響。以上研究均認為真菌群落結構的變化是導致作物連作障礙的重要原因。本研究利用高通量測序技術檢測到的真菌種類遠遠多于上述研究，并且不同連作年限蕨麻根際真菌群落中5個真菌門[圖2(a)]和5個優(yōu)勢真菌屬[圖2(b)]的豐度明顯不同，表明連作能夠對真菌群落結構產(chǎn)生影響，然而真菌群落的改變是否直接導致蕨麻連作障礙仍需進一步研究。

環(huán)境因子的PCA結果表明，連作1年、4年和8年的土壤樣品分別形成了自己的集群，顯示了土壤養(yǎng)分的獨特差異。蕨麻根際土壤真菌門與土壤養(yǎng)分的冗余分析以及真菌多樣性和真菌屬與環(huán)境因子相關性統(tǒng)計均表明土壤養(yǎng)分含量與真菌群落結構存在相關性。結果表明，無論是生長周期還是連作年限，都明顯改變了蕨麻根際土壤的真菌群落結構。蕨麻根際土壤中有大量致病菌，且鏈格孢屬、莖點霉屬、光黑殼屬、Cadophora、鐮孢菌屬和被孢霉屬等均與土壤營養(yǎng)代謝密切相關。因此，不同連作年限對蕨麻根際土壤真菌群落有較大影響，蕨麻連作后真菌種群結構的變化可能是引發(fā)連作障礙的主要原因之一。