有機(jī)酸對銅綠微囊藻生長及光合色素的影響

侯新星, 田如男

(南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037)

水華是由于淡水湖泊、池塘等水體中氮、磷等營養(yǎng)鹽含量過多而造成水體富營養(yǎng)化引起水體中真核藻類和藍(lán)藻快速繁殖，造成耗盡氧氣供應(yīng)的現(xiàn)象[1]，水華嚴(yán)重影響水體生態(tài)，造成水體發(fā)臭、漁業(yè)減產(chǎn)[2]。我國的太湖、巢湖、滇池等淡水湖泊在夏秋季節(jié)經(jīng)常暴發(fā)水華[3-5]，其中銅綠微囊藻(Microcysticaeruginosa)為水華常見優(yōu)勢種[6]。物理、化學(xué)和生物技術(shù)都被用于治理水華暴發(fā)，包括機(jī)械打撈、超聲波處理、化學(xué)藥品沉降等方式[7]，但都存在成本代價(jià)高、破壞周圍生態(tài)環(huán)境、造成二次污染等缺點(diǎn)，而利用植物天然化感物質(zhì)抑藻效果好、無二次污染，是最具前景的控藻方式。

穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)、苦草(Vallisnerianatans)、黃菖蒲(Irispseudacorus)、蘆葦(Phragmitescommunis)[8-11]等植物體內(nèi)化感物質(zhì)均對水華藻類生長有顯著抑制作用，化感物質(zhì)破壞藻類捕光系統(tǒng)、抑制光合電子傳遞并影響光合作用相關(guān)基因表達(dá)[12]；化感物質(zhì)影響藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，破壞膜完整性[13]；多酚類化感物質(zhì)引起藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧，引起細(xì)胞死亡[14]；另外，化感物質(zhì)作用下，藻類呼吸作用受抑制[15]、基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受到影響[16]。本課題組前期研究表明水生植物梭魚草(Pontederiacordata)的種植水與其根狀莖有機(jī)提取物均對銅綠微囊藻生長有強(qiáng)烈抑制作用[17]，并從梭魚草根狀莖中提取到多種有機(jī)酸類化感物質(zhì)，其中丁二酸、香草酸與肉桂酸對銅綠微囊藻抑制作用較強(qiáng)。本研究選取丁二酸、香草酸與肉桂酸這3種有機(jī)酸作用于水華常見優(yōu)勢種銅綠微囊藻，探究丁二酸、香草酸與肉桂酸對銅綠微囊藻生長及光合色素的抑制效應(yīng)的差異，以期為日后選取有機(jī)酸類化感物質(zhì)抑藻提供理論基礎(chǔ)，并從光合色素的角度揭示有機(jī)酸抑藻機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

選用的銅綠微囊藻(編號(hào)FACHB-905)，購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，采用BG-11培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度(3 000±200)Lx，光暗比(12 h/12 h)，溫度為(25±1)℃。培養(yǎng)期間每日定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2次，同時(shí)隨機(jī)調(diào)換錐形瓶的位置，培養(yǎng)至對數(shù)生長期作為供試藻種。丁二酸、香草酸及肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 有機(jī)酸母液的配制

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別稱取0.5、1.0、1.5和2 g的丁二酸、香草酸與肉桂酸，溶解于10 mL二甲亞砜，分別配成50、100、150和200 mg/mL的母液，4 ℃下避光保存。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻在超凈工作臺(tái)上接種到培養(yǎng)瓶，加入BG-11培養(yǎng)基與有機(jī)酸母液。培養(yǎng)體系中總體積為100 mL，取各濃度的有機(jī)酸母液40 μL，對照組加40 μL的二甲亞砜，使體系中有機(jī)酸濃度分別為0、20、40、60和80 mg/L，初始藻密度為6.75×105cells/mL。每處理重復(fù)3次。

接種當(dāng)日設(shè)為第0天，自接種開始每日同一時(shí)間測定藻密度至第8天，試驗(yàn)的第0、2、4、6和第8天的同一時(shí)間取樣測定藻葉綠素a含量及藻膽蛋白含量，試驗(yàn)操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.3 指標(biāo)測定

藻密度采取血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，取藻液于相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，每個(gè)計(jì)數(shù)3次，取平均值。有機(jī)酸對銅綠微囊藻抑制率的計(jì)算公式為：IR=(1-Nt/Mt)×100%，式中：IR為抑制率；Nt為第t天處理組的藻密度；Mt為第t天對照組的藻密度。IR若為正值表示抑制藻生長，負(fù)值表示促進(jìn)藻生長。

葉綠素a含量測定參照超聲波輔助熱乙醇提取法[18]，按照以下公式計(jì)算葉綠素a含量：

其中：E665a=OD665a-OD750a，E750b=OD665b-OD750b；v為提取液體積；V為樣品體積。

藻膽蛋白含量測定參照Padgett等[19]的方法，并根據(jù)以下公式計(jì)算藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)與藻紅蛋白(PE)的含量：

藻藍(lán)蛋白(PC，mg/mL)=

(OD620-0.7×OD650)/7.38

別藻藍(lán)蛋白(APC，mg/mL)=

(OD650-0.19×OD620)/5.65

藻紅蛋白(PE，mg/mL)=

[OD565-2.8(PC) -1.34(APC)]/1.27

MPC=Ctreatment，PC/Ccontrol，PC×100%

MAPC=Ctreatment，APC/Ccontrol，APC×100%

MPE=Ctreatment，PE/Ccontrol，PE×100%

式中，Ctreatment為處理組不同藻膽蛋白含量，Ccontrol為對照組不同藻膽蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel與SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁二酸、香草酸及肉桂酸對藻生長的影響

由表1中主效應(yīng)對銅綠微囊藻抑制率的多重比較結(jié)果可看出，3種有機(jī)酸對銅綠微囊藻生長抑制作用排序?yàn)槿夤鹚?丁二酸>香草酸，并且隨著有機(jī)酸處理濃度與處理時(shí)間的增加，抑制作用加強(qiáng)。

表1 有機(jī)酸種類、處理時(shí)間及處理濃度主效應(yīng)對藻抑制率的多重比較Table 1 Multiple comparison of the main effects of organic acid species，treatment time and treatment concentration on algae inhibition rate

由圖1中交互效應(yīng)對銅綠微囊藻抑制率的影響可看出，除低濃度(20 mg/L)丁二酸僅在實(shí)驗(yàn)初期表現(xiàn)為抑藻外，40、60和80 mg/L丁二酸均具有較強(qiáng)的抑藻效果，至第8天，其抑制率分別為51.38%、46.43%和98.63%。香草酸對銅綠微囊藻的抑制效果最差，抑制率均不超過50%。肉桂酸對銅綠微囊藻的抑制效果最強(qiáng)，且隨著處理時(shí)間的延長，抑制作用增強(qiáng)，至第8天，20、40、60和80 mg/L肉桂酸對藻抑制率分別為66.76%、86.26%、92.86%和96.70%。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。圖1 處理濃度和時(shí)間交互效應(yīng)對銅綠微囊藻抑制率的影響Figure 1 The interactive effect of treatment concentration and time on the inhibition rate of Microcystis aeruginosa

2.2 丁二酸、香草酸及肉桂酸對藻葉綠素a含量的影響

由表2中主效應(yīng)對銅綠微囊藻葉綠素a含量影響的多重比較結(jié)果可看出，有機(jī)酸作用下，葉綠素a 含量大小排序?yàn)槿夤鹚?丁二酸>香草酸，各處理組的葉綠素a含量均低于對照組，且有機(jī)酸濃度越高，葉綠素a含量越低。

表2 有機(jī)酸種類、處理時(shí)間及處理濃度主效應(yīng)對藻葉綠素a含量的多重比較

由圖2交互效應(yīng)結(jié)果可看出，試驗(yàn)前期葉綠素a含量與對照組均無顯著差異(P>0.05)，隨著處理時(shí)間的延長，除20 mg/L丁二酸處理組藻葉綠素a含量增加，40、60和80 mg/L丁二酸處理組的葉綠素a含量始終顯著低于對照組(P<0.05)，且最高濃度(80 mg/L)處理組在試驗(yàn)后期葉綠素a含量過低而檢測不出。試驗(yàn)后期香草酸與肉桂酸處理組的葉綠素a含量均顯著低于對照組，且濃度越高，葉綠素a含量越低。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。圖2 處理濃度與時(shí)間交互效應(yīng)對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Figure 2 The effect of the interaction between treatment concentration and time on chlorophyll a content of Microcystis aeruginosa

2.3 丁二酸、香草酸及肉桂酸對藻膽蛋白相對含量的影響

由表3中主效應(yīng)對銅綠微囊藻藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)及藻紅蛋白(PE)相對含量的多重比較結(jié)果可看出，PC、APC及PE相對含量均為肉桂酸>香草酸>丁二酸，隨著處理時(shí)間的延長，藻膽蛋白相對含量均比第0天降低，且藻膽蛋白相對含量第4天達(dá)到最低，除20 mg/L有機(jī)酸處理組外，40 mg/L及以上處理的藻膽蛋白相對含量隨著處理濃度的增加而降低。

表3 有機(jī)酸種類、處理時(shí)間及處理濃度主效應(yīng)對藻膽蛋白相對含量的多重比較Table 3 Multiple comparison of the relative content of phycobiliproteinwith the main effect of organic acid species，treatment timeand treatment concentration

由圖3交互效應(yīng)對PC相對含量的影響可看出，丁二酸與香草酸處理下，除低濃度處理組的PC相對含量在試驗(yàn)初期高于對照外，隨著處理時(shí)間的延長，各濃度處理的PC相對含量均低于對照組。肉桂酸處理下，第2天PC含量均較對照組減少，而試驗(yàn)后期各處理組的PC相對含量增加，至第8天，20、40、60和80 mg/L肉桂酸處理組的PC相對含量分別為188.07%、188.2%、134.87%和50.95%。

由圖4中交互效應(yīng)對銅綠微囊藻APC相對含量的多重比較結(jié)果可看出，丁二酸與香草酸處理下，APC相對含量變化趨勢與PC類似，除試驗(yàn)初期外，其余處理組的APC含量在試驗(yàn)期間均比對照低。肉桂酸作用下，試驗(yàn)前期處理組APC相對含量均比對照組低，而試驗(yàn)后期低濃度處理組APC相對含量比對照組高，僅80 mg/L處理組的APC相對含量比對照組低。第8天時(shí)，20、40、60和80 mg/L肉桂酸處理組的APC相對含量分別為250.23%、238.67%、166.37%和58.99%。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。圖3 處理濃度與時(shí)間交互效應(yīng)對藻藍(lán)蛋白(PC)相對含量的影響Figure 3 The effect of the interaction between treatment concentration and time on relative content of phycocyanin (PC)

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。圖4 處理濃度與時(shí)間交互效應(yīng)對別藻藍(lán)蛋白(APC)相對含量的影響Figure 4 The effect of the interaction between treatment concentration and time on the relative content of allophycocyanin (APC)

由圖5中交互效應(yīng)對銅綠微囊藻PE相對含量的多重比較結(jié)果可看出，除第2天時(shí)20 mg/L丁二酸處理組PE相對含量高于對照，試驗(yàn)后期各處理組的PE相對含量均下降，至第8天，20、40、60和80 mg/L丁二酸處理組的PE相對含量為61.72%、6.41%、13.56%和13.50%。僅高濃度香草酸處理組的PE相對含量低于對照，低濃度處理組與對照差異不顯著。試驗(yàn)后期僅最高濃度肉桂酸處理的PE相對含量低于對照。

(a)丁二酸;(b)香草酸;(c)肉桂酸。圖5 處理濃度與時(shí)間交互效應(yīng)對藻紅蛋白(PE)相對含量的影響Figure 5 The effect of the interaction between treatment concentration and time on the relative content of phycoerythrin (PE)

3 討論

丁二酸、香草酸與肉桂酸對銅綠微囊藻生長均有抑制作用，且隨著處理濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)。目前從植物體內(nèi)提取化感物質(zhì)應(yīng)用到抑制藻類的研究很多，0.1 mg/L外來入侵植物互花米草凋落物浸提液對中肋骨條藻的抑制率達(dá)到69.2%，其主要化感物質(zhì)成分為十六烷酸、亞油酸和油酸[20]；苦草種植水不同溶劑洗脫的各組分對銅綠微囊藻具不同程度的抑制作用[21]；Nakai等[22]檢測出穗花狐尾藻釋放到水中的4種酚酸，分別為鞣花酸、沒食子酸、焦性沒食子酸以及兒茶素，均對銅綠微囊藻生長具抑制作用，且沒食子酸和焦性沒食子酸抑制作用強(qiáng)于鞣花酸和兒茶素。本試驗(yàn)中，丁二酸、香草酸與肉桂酸對銅綠微囊藻的最大抑制率達(dá)到98.63%、48.06%和96.70%，具有較大應(yīng)用前景。

3種有機(jī)酸的抑藻活性均呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，處理濃度越高，抑藻效果越好。而20 mg/L丁二酸處理對銅綠微囊藻生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用，可能是由于“毒物興奮效應(yīng)”引起。低劑量化感物質(zhì)對微藻的生長刺激作用是普遍現(xiàn)象[23-24]，較低劑量的化感物質(zhì)引起微藻的系列生理響應(yīng)，從而抵抗化感作用。此外，化感物質(zhì)的不同暴露方式也對抑藻效應(yīng)產(chǎn)生影響。研究表明：水生植物釋放的化感物質(zhì)多次低劑量暴露比單次高劑量暴露有更強(qiáng)抑藻效果[25]，這也解釋了常規(guī)毒性試驗(yàn)得到抑藻濃度多在mg/L水平，而實(shí)際水生植物釋放到水中的化感物質(zhì)在μg/L水平，可見自然環(huán)境中水生植物的化感物質(zhì)釋放模式與實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)毒性試驗(yàn)的一次作用模式不同，水生植物通過多種化感物質(zhì)低劑量持續(xù)釋放的模式，從而實(shí)現(xiàn)對藻類的持續(xù)有效脅迫[26]。

藻類依靠光合作用將有機(jī)物固定在體內(nèi)進(jìn)行生長，光合作用是藻類生長過程中最重要的生理過程之一[27]，葉綠素a在光合作用過程中的能量捕獲與傳遞中起著至關(guān)重要的作用[28]。研究表明：粉綠狐尾藻(Myriophyllumaquaticum)[29]與水稻浸提液[30]中的化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的葉綠素a造成破壞，鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)[31]和穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)[32]通過減少光合系統(tǒng)中的藻膽蛋白而對藻類整個(gè)光合系統(tǒng)中的能量捕獲與電子傳遞過程進(jìn)行干擾，化感物質(zhì)抑制葉綠素的合成或/和加速了葉綠素的降解，從而藻膽體被破壞，葉綠素含量降低[33]。

葉綠素a是光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)反應(yīng)中心的重要功能物質(zhì)，藻膽蛋白是位于藻膽體內(nèi)的光合作用重要捕光天線，包括藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)與藻紅蛋白(PE)3種。藻膽蛋白將捕獲的光能傳遞到葉綠素，輔助藻細(xì)胞的光合作用[34]。當(dāng)銅綠微囊藻葉綠素受損、光反應(yīng)效率降低時(shí)，藻膽蛋白作為光反應(yīng)的天線系統(tǒng)可能會(huì)通過調(diào)節(jié)組分比例來適應(yīng)變化[35]。本研究中,在丁二酸、香草酸與肉桂酸作用下，除20 mg/L丁二酸處理組的葉綠素a含量在第8天增加外，其余處理組的葉綠素a含量與對照組相比均有不同程度下降，除20、40和60 mg/L肉桂酸處理組的藻膽蛋白各組分相對含量增加外，其余處理組的PC、APC及PE相對含量在試驗(yàn)后期均有一定程度下降，且PC與APC受損程度比PE更重。

4 結(jié)論

隨著丁二酸、香草酸與肉桂酸濃度的增加，對銅綠微囊藻的抑制作用增強(qiáng)，3種有機(jī)酸抑藻能力從大到小排序?yàn)槿夤鹚?丁二酸>香草酸；在3種有機(jī)酸作用下，銅綠微囊藻葉綠素a含量下降，藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白與藻紅蛋白均受損傷，且藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白比藻紅蛋白損傷程度更重，藻膽蛋白各組分比例相應(yīng)發(fā)生變化。由此，丁二酸、香草酸及肉桂酸的抑藻機(jī)理可能是：有機(jī)酸直接作用于銅綠微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心，導(dǎo)致葉綠素a含量降低，藻膽體內(nèi)的藻膽蛋白各組分受影響，光合系統(tǒng)受到破壞，從而抑制銅綠微囊藻生長。