一種高活性乙烯合成酶的鑒定和性質研究

蘇賓賓，張佟佟，劉海萍

(1. 天津科技大學 生物工程學院，天津300457；2. 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 化學生物學中心，天津300308)

乙烯，作為全世界最重要的工業(yè)化學品之一，是各種塑料、橡膠、紡織品以及化學品等工業(yè)制品的基本原料，具有巨大的經(jīng)濟價值[1-2]。現(xiàn)階段，乙烯主要是通過石油裂解工藝獲得。然而，在石油化工生產乙烯的同時，消耗了大量不可再生的化石能源并且排放出二氧化碳、二氧化硫、硫化銨等廢氣污染物，造成了嚴重的環(huán)境污染問題[3]。因此，開發(fā)乙烯生物合成途徑成為合成生物學研究的熱點。

微生物如丁香假單胞菌[4-6](Pseudomonassyringae)和指狀青霉[7](Penicilliumdigitatum)具備乙烯合成途徑，該途徑是以α-酮戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)和精氨酸(L-Arg)為底物，經(jīng)乙烯合成酶(Ethylene forming enzyme，EFE)催化生成乙烯。同時，該反應還會生成1-吡咯啉-5羧酸鹽(1-pyrroline-5-carboxylate, P5C)。這種乙烯合成途徑對微生物沒有毒害作用，而且比植物途徑[8-9]更簡單。因此，在乙烯生物合成途徑的工業(yè)化生產應用中，微生物來源的乙烯合成酶潛力巨大。

目前，活性最高、研究最多的乙烯合成酶僅來源于Pseudomonassyringaepv.phaseolicolaPK2[10-11](PsEFE，Kudzu strain)，在將該種屬efe基因引入藍藻[12-14]表達體系中后，通過改進啟動子、轉錄因子、優(yōu)化代謝通路、優(yōu)化表達條件等方式使得乙烯產量有所提高[15-16]，但由于酶本身催化活性限制，產率較低，無法達到工業(yè)化生產要求。此外，PsEFE在酶促反應過程中表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，這成為它在未來工業(yè)化應用中的負面因素[17]。因此，需要深入挖掘催化活性更高、催化性能更好的乙烯合成酶并對其酶學性質進行分析研究[18]。

本研究對不同微生物中乙烯合成酶(EFE)同源基因的篩選，實現(xiàn)了6種不同種屬來源efe基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的異源表達，通過金屬離子螯合親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析3種純化方法制備得到了高純度EFE目的蛋白，并且利用氣相色譜法與茚三酮顯色法測定了各個種屬EFE純酶比酶活。成功獲得了一種Neofusicoccumparvum(NpEFE)來源的高活性乙烯合成酶。通過選用不同pH緩沖液確定了高活性NpEFE催化反應最適pH條件，并對其底物動力學參數(shù)做了研究分析。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

根據(jù)EFE的基因進化樹，除Pseudomonassyringaepv.phaseolicolaPK2(PsEFE)外，另選取5個不同種屬來源的efe同源基因(表 1)，委托GenScript公司合成。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)購自北京全式金公司。

1.2 主要試劑

PCR試劑、T4 DNA連接酶、DNA Marker、限制性內切酶NdeI、XhoI以及蛋白Marker均購自Takara公司。質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；其他試劑購自北京索萊寶科技有限公司。HisTrap HP組氨酸標記親和層析柱、HiTrapTMQ HP和SuperdexTM200 pg分子篩層析柱購自GE healthare公司。

1.3 重組質粒構建

以GenScript公司合成的基因為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的基因片段,所用引物由中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所合成(表 2)。純化PCR產物并經(jīng)NdeI、XhoI限制性內切酶酶切后構建到pET28a載體上，將構建好的重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，次日挑取陽性轉化子培養(yǎng)并提取質粒委托金唯智基因公司測序。

表2 pET28a載體系列重組質粒所用引物Table 2 The primers of pET28a series recombinant plasmids

1.4 EFE的表達和純化

將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，選取陽性轉化子接種至1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖瓶培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時添加0.5 mmol/L IPTG，16 ℃、200 r/min過夜誘導表達。

離心收集菌體并用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl)重懸菌體，使用高壓均質儀破碎細胞，高速離心獲取上清液后依次使用HisTrap HP組氨酸標記親和層析柱、HiTrapTMQ HP陰離子交換柱以及SuperdexTM200 pg分子篩層析柱純化目的蛋白并進行SDS電泳檢測，收集含高純度乙烯合成酶的目的蛋白組分，濃縮到10 mg/mL后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 EFE酶活測定

EFE酶活力單位(U)是指在特定反應條件下每分鐘催化生成1 nmol產物(乙烯或P5C)所需的酶量。酶比活力是指每毫克酶蛋白具有的酶活力(U/mg蛋白)。

1.5.1 氣相色譜法測定乙烯合成活性

檢測反應體系[7]為1 mL，組成成分為40 mmol/L Hepes pH 7.5，0.4 mmol/L L-ascorbic acid，0.5 mmol/L 2-OG, 0.5 mmol/LL-Arg, 0.2 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2，10 μg/mL EFE蛋白。室溫密閉反應3 min后，使用氣密針抽取1 mL氣體手動上樣檢測。所用氣相色譜儀是Agilent 7890B，色譜柱為HP-Plot Q柱，規(guī)格為30 m×530 μm×40 μm，氫焰離子檢測器，柱箱溫度為32 ℃±1 ℃。依據(jù)乙烯濃度標準曲線定量所檢測到的乙烯生成量。所有實驗進行3次平行實驗，最后結果為3次實驗的平均值。

根據(jù)乙烯濃度標準曲線，將乙烯吸收峰面積換算成乙烯生成量。乙烯合成比活力為乙烯的量(nmol)/[3 min×蛋白量(0.01 mg)]。

1.5.2 茚三酮顯色法測定P5C合成活性

P5C可由茚三酮顯色法進行測定[19-20]，反應體系與測定乙烯產量體系相同。加入HCl終止反應，然后加入250 μL茚三酮，100 °C水浴15 min，室溫冷卻，離心棄除上清液，保留紅色沉淀，加入50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0以及1 mL 47.5%乙醇后重懸均勻，在UV620nm條件下檢測吸光值，確定P5C產量,計算P5C合成活性。

1.6 NpEFE酶學性質表征

選用檸檬酸鈉(pH 4.0、4.5、5.0和5.5)、MES(pH 6.0、6.5)、HEPES(pH 7.0、7.5和8.0)、Tris-HCl(pH 8.5和9.0)不同pH緩沖液測定NpEFE的乙烯合成酶酶活力，確定酶催化反應最適pH條件。酶活測定方法和比活力計算方法與上述乙烯合成酶活性測定方法相同。

測定NpEFE穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)時，保持α-酮戊二酸和精氨酸兩種底物中的一種底物濃度恒定在500 μmol/L,而改變另外一種底物濃度(0～640 μmol/L)，其余測活體系組成成分與氣相色譜測活反應體系相同。根據(jù)已經(jīng)建立的乙烯標準曲線定量乙烯產量，利用Graphpad Prism 7.0軟件中的底物抑制動力學模型對初速度數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 EFE蛋白的表達純化與酶活測定

將各種efe基因構建到pET28a載體后提取質粒，測序得到質粒序列，經(jīng)比對，與設計序列完全一致。在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實現(xiàn)了PsEFE、RsEFE、NpEFE、PdEFE、CpEFE以及NcEFE的異源表達并獲得可溶性蛋白。將純化后的上述6種蛋白進行SDS-PAGE檢測，結果顯示(圖1)，每種EFE蛋白純度高并且蛋白分子質量與其理論值一致，產量均為10 mg左右。

圖1 各個種屬EFE的SDS-PAGE檢測分析Figure 1 SDS-PAGE analysis of EFEs

用氣相色譜法測定上述6種乙烯合成酶催化產生的乙烯產量并計算比活力，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)(表3)，NpEFE酶活性明顯高于PsEFE，為6種乙烯合成酶中活性最高的酶，因此，選擇NpEFE作后續(xù)酶學性質研究。

表3 不同種屬EFE酶的乙烯合成活性Table 3 The ethylene forming activities of different EFEs

2.2NpEFE酶學性質表征

2.2.1NpEFE催化反應最適pH條件

在pH 4.0～5.5條件下，NpEFE活性受到抑制，酶比活力為零。隨著pH值升高，酶比活力逐步提高。在pH 7.5時，NpEFE酶比活力達到最高，為(730.7±56.9) U/mg。當pH值繼續(xù)升高，酶比活力逐步降低，在pH 9.0時，NpEFE仍有活性，但酶比活力僅為最高狀態(tài)時的40%(圖 2)。因此，NpEFE催化反應最適pH值為7.5。

圖2 pH值對NpEFE催化活性的影響Figure 2 Effects of pH values on the enzymatic activity of NpEFE

2.2.2NpEFE動力學特征

保持α-酮戊二酸和精氨酸兩種底物中的一種底物濃度恒定在500 μmol/L而改變另外一種底物濃度(0～640 μmol/L)，根據(jù)產物乙烯產量或者P5C產量測定乙烯合成酶在不同底物濃度下的酶活，通過Graphpad Prism 7.0軟件中的動力學模型對初速度數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析(圖3)，計算得出了NpEFE和PsEFE對于兩種底物α-酮戊二酸和精氨酸的動力學參數(shù)(表4)。 利用軟件自帶的方程擬合得到Km和Vmax值，kcat值由Vmax/酶的濃度計算得到。

表4 NpEFE和PsEFE對于底物α-酮戊二酸和精氨酸的動力學參數(shù)Table 4 NpEFE and PsEFE kinetic parameters for the substrates of 2-OG and L-Arg

NpEFE在不同濃度α-酮戊二酸下的乙烯生成活性和不同濃度L-精氨酸下的P5C生成活性均符合經(jīng)典的酶催化反應。因此，在用Graphpad Prism 7.0軟件分析時，采用標準的Michaelis-Menten方程擬合[圖3 (a)和(c)]。在不同L-精氨酸濃度下，NpEFE的乙烯生成反應曲線則表現(xiàn)出較弱的底物抑制作用。因此，采用底物抑制動力學模型對其進行擬合[圖3 (b)]。PsEFE在不同濃度α-酮戊二酸和不同濃度L-精氨酸下的乙烯生成反應曲線都表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，采用底物抑制動力學模型進行擬合[圖3(a)和(b)]。

(a)NpEFE與PsEFE在底物α-酮戊二酸不同濃度下催化生成乙烯的酶活性曲線；(b)NpEFE與PsEFE在底物L-精氨酸不同濃度下催化生成乙烯的酶活性曲線；(c)NpEFE與PsEFE在底物L-精氨酸不同濃度下催化生成P5C的酶活性曲線。圖3 NpEFE與PsEFE的酶活性曲線Figure 3 Enzymatic activity les of NpEFE and PsEFE

3 討論

本研究通過多種微生物乙烯合成酶基因在大腸桿菌中的表達純化和活性測定，發(fā)現(xiàn)來源于藍莓枝枯病菌Neofusicoccumparvum的乙烯合成酶NpEFE具有較高活性，并系統(tǒng)測定了NpEFE的酶學性質，包括其反應動力學參數(shù)以及反應最適pH值。目前已知活性最高的乙烯合成酶是來源于丁香假單胞菌的PsEFE，文獻報道其乙烯合成比酶活為(548±30) U/mg[11,21]。在我們實驗室條件下測定的PsEFE比酶活為(487.2±35.2) U/mg，與文獻報道值相當。相同實驗條件下測定的NpEFE和PsEFE的活性和酶動力學參數(shù)表明NpEFE的活性明顯高于PsEFE。PsEFE對α-酮戊二酸和L-精氨酸均表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，而NpEFE對α-酮戊二酸沒有表現(xiàn)出底物抑制作用，高濃度的L-精氨酸僅略微降低了NpEFE的活性。當?shù)孜餄舛雀哂?00 μmol/L時，NpEFE酶活性要高于PsEFE酶活性。當?shù)孜餄舛冗M一步提高到大于600 μmol/L時，NpEFE酶活性幾乎是PsEFE酶活性的2倍。另一方面，在高濃度底物條件下，NpEFE催化生成副產物P5C的活性與PsEFE幾乎相同，也說明NpEFE產生的副產物比例更低。目前已有很多關于將PsEFE應用到工業(yè)菌株藍藻中產生乙烯的研究并取得了一定進展[13-16]，但乙烯產量仍然偏低，其中乙烯合成酶的活性、底物抑制效應和副產物是重要的制約因素。因此，對未來生物乙烯的工業(yè)化生產而言，來源于Neofusicoccumparvum的NpEFE表現(xiàn)出更加優(yōu)良的酶學性質，具有更大的應用潛力。

目前，已有晶體學研究闡明了α-酮戊二酸和L-精氨酸這兩種底物與PsEFE的結合方式[17，22]。NpEFE與PsEFE氨基酸序列比對一致性結果為52.0%。有趣的是，在兩個種屬的乙烯合成酶中，參與底物結合的殘基都是相同的。因此，可能是其他位置的結構變化，特別是底物進出通道的大小和極性對催化反應速率、底物抑制和正副反應選擇中發(fā)揮了作用。目前有關乙烯合成酶的催化機制只來源于有關PsEFE的研究，且尚有較大爭議[17,22]，底物進出通道也未得到合理的揭示。NpEFE的發(fā)現(xiàn)及其性質鑒定為進一步闡明EFE的作用機制提供了新的研究視角。

致謝：感謝中國科學院工業(yè)生物技術研究所技術支撐中心顧芮萌和張潔在氣相色譜和蛋白純化方面的幫助。