上海市售牡蠣中諾如病毒的污染及基因型和流行趨勢分析

賈添慧，王永杰,2，楊明樹，時(shí)沙沙，董 蕾，喻勇新,2

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 水產(chǎn)品質(zhì)量安全貯藏保鮮風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae),諾如病毒屬(Norovirus)。目前，NoV分為10個(gè)基因群(GI-GX)，其中，GI和GII型是最常見的人諾如病毒[1-2]。在2006—2016年間，中國發(fā)生超過132起NoV的暴發(fā)(8 133起案例)，其中99.9%的案例都是由GI和GII型NoV引起，造成了醫(yī)療資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)的損失[3-5]。

NoV相關(guān)的急性腸胃炎暴發(fā)通常與被NoV污染的牡蠣有關(guān)[6]。相關(guān)研究表明，幾乎所有的GI型和大部分GII型NoV的基因型在牡蠣中檢出[7]。食用受NoV污染的牡蠣具有感染NoV的風(fēng)險(xiǎn)，并可能導(dǎo)致NoV在人群中暴發(fā)[8]。Meghnath等[9]在研究兩起NoV相關(guān)的急性腸胃炎疫情(共449例)中發(fā)現(xiàn)，疫情都與食用受NoV污染的牡蠣有關(guān)。

本研究采用巢式RT-PCR法對上海市售牡蠣進(jìn)行人諾如病毒(GI和GII型)污染狀況的定期監(jiān)測，旨在分析上海市售牡蠣中NoV的基因型和流行病學(xué)趨勢，以期對市售牡蠣的食用安全評估和食源性NoV的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：GK3016)購自上海捷瑞生物工程有限公司；RNA穩(wěn)定和儲(chǔ)存溶液RNAlater購自上海翊瑞生物科技有限公司；一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(貨號(hào)：RR055A)、PremixTaq(RR901A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Top10感受態(tài)細(xì)胞，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG)，氨芐青霉素和PCR產(chǎn)物回收試劑盒(DP209)，100 bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司；LB固體和液體培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；T載體PCR產(chǎn)物連接試劑盒(B522214)，GI和GII型NoV的巢式RT-PCR通用型引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司(序列見表1)。

表1 巢式RT-PCR的引物組合Table 1 Primers combination used in the of nested RT-PCR

1.1.2 樣品采集及預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)所用太平洋牡蠣(Crassostreagigas)是由實(shí)驗(yàn)室在上海市蘆潮港海鮮市場隨機(jī)采集得到(長10～12 cm、寬6～8 cm)。2017年10月到2019年10月期間，每月2次采樣，當(dāng)首次樣品陽性檢出率高于80%時(shí)視為暴發(fā)期，將增加采樣次數(shù)進(jìn)行跟蹤分析，共采集牡蠣樣品633份，詳細(xì)信息如表2所示。解剖采集牡蠣的消化腺組織并分裝成50～100 mg每管，經(jīng)RNA保護(hù)劑處理后凍于-80 ℃冰箱。

表2 樣品信息Table 2 Information of samples

1.1.3 主要儀器

AC2-4S1-CN生物安全柜、ACB-4A1超凈工作臺(tái)購自新加坡藝思高科技有限公司(ESCO)；FastPre-24MP組織均質(zhì)器購自MP Biomedicals(美國)；5331PCR儀、5382000074恒溫混勻金屬浴、5702R臺(tái)式低溫離心機(jī)購自艾本德中國有限公司(Eppendorf)；PowerPac HC電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)和凝膠成像分析儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 樣品RNA的提取

牡蠣中總RNA的提?。喝∫还苣迪犗俳M織用MP組織均質(zhì)器打成勻漿，參照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明書中的步驟提取牡蠣消化腺的總RNA，并將其分裝于3個(gè)RNase-free的小管中，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.2.2 巢式RT-PCR反應(yīng)

巢式RT-PCR反應(yīng)分為RT-PCR和第二輪PCR兩步，按試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行。RT-PCR反應(yīng)體系共25 μL，含2×1 Buffer 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 8.5 μL，模板1 μL。

反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。

將第一輪產(chǎn)物稀釋10倍作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，第二輪PCR反應(yīng)體系共25 μL，含PCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1 μL。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min加poly-A尾，以便后續(xù)的TA連接和測序。兩輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(GI: 168 bp; GII:344 bp)。

1.2.3 序列測序

產(chǎn)物經(jīng)處理后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行桑格測序。若測序結(jié)果為雙峰，則需要按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，按照T載體連接試劑盒說明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)單克隆菌液，再次送去測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

本研究采用166條測序獲得的序列進(jìn)行基因分型。測序成功的序列導(dǎo)入到NoV專用基因分型工具NoV-genotyping tool[10](http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)通過系統(tǒng)發(fā)育分析確定基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 時(shí)間分布

2017年10月—2019年10月期間，共檢出140例(140/633)NoV陽性的牡蠣，陽性檢出率為22.1%。從圖1可以看出，陽性檢出率的峰值連續(xù)兩年都出現(xiàn)在11月至次年2月，分別為2018年的1月(50%)、2018年11月(61%)、2018年12月(50%)和2019年2月(30%)，而在其他月份，如3到10月，陽性檢出率通常都在10%及以下。結(jié)果表明，NoV具有很強(qiáng)的冬季季節(jié)性，11月至次年2月是牡蠣中NoV污染的高峰期。Lowther等[8]在研究英國市售牡蠣中的NoV時(shí)也得出相似的結(jié)果。

圖1 共140例諾如病毒陽性牡蠣檢出月份分布Figure 1 The monthly distributions of 140 cases of norovirus contaminated oysters

從年度分布看，2017年10月—2018年9月期間共檢出85例NoV陽性的牡蠣，陽性檢出率為23.8%，占總檢出數(shù)量的60.7%。而2018年10月—2019年10月期間共檢出55例NoV陽性的牡蠣，陽性檢出率為19.9%，占總檢出數(shù)量的39.3%。陽性檢出例數(shù)受補(bǔ)采樣影響，如2018年1月兩次采樣陽性檢出率均超過80%，因此分別展開兩次補(bǔ)采樣，最后該月陽性檢出率穩(wěn)定在50%；2018年11月其中一次采樣陽性檢出率達(dá)100%，因此補(bǔ)采樣一次，該月的陽性檢出率最終穩(wěn)定在61%。采樣基數(shù)越大，陽性檢出率會(huì)更穩(wěn)定。在年度時(shí)間分布上，牡蠣受NoV污染的情況類似，陽性檢出率都在20%的水平。

2.2 基因型分布

2017年10月—2019年10月，從140例(140/633)NoV陽性的牡蠣中共分離得到166條(含26例兩種基因型混合污染)NoV的序列。利用Norovirus genotyping tool結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析對已獲得的166條NoV序列進(jìn)行分型，結(jié)果(圖2)顯示：GI型和GII型分別占50.6%(84/166)和49.4%(82/166)；在GI型中，以GI.3為主，占73.8%，其次是GI.4(25%)和GI.9(1.2%)；在GII型中，數(shù)量較多的為GII.4(36.6%)和GII.3(35.4%)，其次是GII.12(15.9%)、GII.2(7.3%)和GII.17(4.9%)。

圖由序列數(shù)(n=166)生成。圖2 2017年10月—2019年10月從牡蠣分離到的166條諾如病毒序列的基因群和基因型百分比Figure 2 Genogroups and genotypes percentage of 166 sequences of noroviruses isolated from October 2017 to October 2019

圖由基因型的數(shù)目(n=166)生成。圖3 2017年10月—2019年10月諾如病毒基因型的相對豐度Figure 3 Percentage of total norovirus genotypes from October 2017 to October 2019

2017年10月—2019年10月牡蠣源NoV基因型豐度的年度時(shí)間分布。結(jié)果(圖3)表明基因型在這兩年內(nèi)發(fā)生了較大變化。2017年10月—2018年9月以GI型NoV為主，占89.4%，主要為GI.3(67.1%)和GI.4(22.4%)；2018年10月—2019年10月NoV以GII型為主，占90.1%，分別為GII.3 (35.8%)、GII.4 (30.9%)、GII.12 (12.3%)、GII.2 (7.4%)和GII.17 (3.7%)。GII型成為牡蠣中的優(yōu)勢基因型，并且NoV的基因型比上一年同時(shí)期更豐富。

2.3 多基因型混合污染

本研究中，共有140例NoV陽性牡蠣檢出，出現(xiàn)了26例多基因型混合污染的情況，占比18.6%。其中，25例為GII.3和GII.4的混合污染、1例為GI.9和GII.3的混合污染(表2)。這26例被多基因型混合污染的牡蠣都檢出于2018年11月至2019年2月。

3 討論

本研究報(bào)告了2017年10月至2019年10月對上海市售的牡蠣中NoV污染情況的監(jiān)測結(jié)果，分析了共140例NoV陽性案例。牡蠣源GI型NoV的優(yōu)勢基因型為GI.3(圖2)。Qin等[3]在分析2006—2016年人中NoV在中國的基因型和流行病學(xué)趨勢時(shí)發(fā)現(xiàn)，GI.3也是人中GI型NoV的流行株；牡蠣源GII型NoV中占比高達(dá)84.2%的GII.4、GII.3、GII.2和GII.17這4個(gè)基因型(圖2)，在人中GII型NoV中占比達(dá)87.8%。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)在此期間上海市人中NoV的流行株為GII.4和GII.17；而在本研究中這兩種基因型在這兩年均在牡蠣中被檢出，說明GII.4和GII.17仍在環(huán)境中循環(huán)，一旦有機(jī)會(huì)，將會(huì)造成人中NoV的暴發(fā)。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn)GI和GII型NoV在人和牡蠣中的情況是不同的，牡蠣中GI型是優(yōu)勢基因型，而人中GII型是優(yōu)勢基因型。本研究發(fā)現(xiàn)2017年10月—2019年10月期間牡蠣源NoV優(yōu)勢基因型發(fā)生了從GI型到GII型的轉(zhuǎn)變(圖3)，2018年10月—2019年10月GII型NoV占比達(dá)90.1%，這與人中NoV基因型分布趨同，因此這很可能是受外因影響，與養(yǎng)殖區(qū)域人的行為活動(dòng)有關(guān)。Pu等[11]在分析日本牡蠣中諾如病毒基因型時(shí)，發(fā)現(xiàn)NoV基因型在人群中的傳播與這些基因型在牡蠣中的檢測之間存在相關(guān)性且有一定的時(shí)間差。Meghnath等[9]的研究表明，人類產(chǎn)生的污水是牡蠣中NoV的污染源。因此，在牡蠣養(yǎng)殖的過程中應(yīng)嚴(yán)格把控水質(zhì)與人的活動(dòng)。

RNA重組是RNA病毒遺傳進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力，也是RNA病毒基因型多樣的原因之一[12]。Yu等[7]的研究發(fā)現(xiàn)3.7%的病毒序列存在基因重組現(xiàn)象，重組頻率相對較高。目前重組NoV已成為繼GII.4后主要的流行毒株[13]。重組菌株往往是多種NoV基因型共同感染一個(gè)宿主的結(jié)果[14]，而多基因型的混合污染為NoV提供交叉混合和基因重組的機(jī)會(huì)。因此，本研究出現(xiàn)的較大比例的混合污染情況需要得到重視。本研究的數(shù)據(jù)表明，牡蠣中多基因型的混合污染和單基因型污染多發(fā)生于11月至次年2月(表2)。在這段時(shí)間食用牡蠣將面臨很大的NoV感染風(fēng)險(xiǎn)。

盡管2018年10月—2019年10月期間牡蠣的陽性檢出率比前一年低，但是2018年10月—2019年10月牡蠣源NoV的基因型多樣性更豐富，且多為在人中占基因型優(yōu)勢的GII型NoV。26例多基因型混合污染的檢出也都發(fā)生在此期間。因此，牡蠣中NoV的污染現(xiàn)狀仍舊十分嚴(yán)峻。

因此，需要采取一些措施來應(yīng)對食源性NoV感染風(fēng)險(xiǎn)。首先，我國需要持續(xù)和有效的監(jiān)測系統(tǒng)，以便制定市售牡蠣食用安全評估；第二，應(yīng)對牡蠣養(yǎng)殖制定詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)對水質(zhì)和養(yǎng)殖區(qū)域人活動(dòng)行為的把控；第三，應(yīng)對學(xué)校、衛(wèi)生保健設(shè)施和社區(qū)加強(qiáng)預(yù)防感染的宣傳，如熟食牡蠣，在NoV污染高峰期內(nèi)盡量少食尤其不生食牡蠣等。