基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究蝦青素防治乳腺癌的分子機(jī)制

張 楠，曹曉東，朱 浩，楊冬冬，趙晨宇，王學(xué)梅，張子英

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 分子病理實驗室 慢性病分子流行病實驗室，呼和浩特 010110)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性死于惡性腫瘤的主要原因[1]。近年來，我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升且年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅女性的生命安全和生活質(zhì)量[2]。研究表明乳腺癌主要與內(nèi)分泌、生育、飲食、電離輻射、基因突變及遺傳等多因素相關(guān)[3-4]。目前手術(shù)是治療乳腺癌最有效的手段；對已經(jīng)轉(zhuǎn)移的或中晚期乳腺癌患者，化療仍然是重要標(biāo)準(zhǔn)治療手段，但耐藥性及副作用制約其臨床應(yīng)用[5]。因此，迫切需要開發(fā)預(yù)防和治療乳腺癌作用強、毒副作用低的天然化合物。

蝦青素(astaxanthin, ASX)是葉黃素中的一類脂溶性類胡蘿卜素，具有抗炎和氧化應(yīng)激的特性，并有抗癌、抗衰老的作用[6]。迄今為止，還沒有動物和人類因食用ASX產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)的報道。因此，ASX在營養(yǎng)保健食品、食品添加劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等多個領(lǐng)域均具有廣闊的市場前景。ASX可抑制n-甲基-n-亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)的大鼠乳腺腫瘤[7]。ASX抑制多種不同類型腫瘤的生長，并負(fù)性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞活力，抑制乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移能提高腫瘤患者的生存率。ASX能減弱MDA-MB-231 (三陰性乳腺癌)的遷移能力，減弱乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及各大相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息[10]，可系統(tǒng)地探究“藥物-靶點-疾病-通路”之間的相互作用，為整體研究藥物的藥效、毒性等作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為新藥開發(fā)提供了新的思路[11]，并增加了篩選靶向藥物的成功率[12]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以構(gòu)建藥物-多基因-多靶點-乳腺癌模式。因此，為系統(tǒng)探究ASX抗乳腺癌作用，特進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，旨在揭示ASX與乳腺癌的相互關(guān)系，闡明ASX對乳腺癌的抑制機(jī)制，為臨床上更有效的開發(fā)、利用ASX防治乳腺癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 蝦青素成分靶點的分析

利用PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，輸入Astaxanthin查找ASX 3D 結(jié)構(gòu)；再通過STITCH(http：//stitch.embl.de/)、Pharm mapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharm mapper/)和BATMAN-TCM(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of TCM)(http：//bionet.ncpsb. org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫，識別ASX有效成分的潛在靶點。利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫時設(shè)置Target Prediction的Score cutoff值為20，Target Analysie的AdjustedP-value值為0.05。

1.2 乳腺癌靶點的獲取

乳腺癌的靶點通過TTD(Therapeutic Target Database)(http：//db.idrblab.org/ttd/)和OMIM(http：//www.omim.org/)等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞breastcancer進(jìn)行篩查，整合所有靶點并去除重復(fù)項，得到乳腺癌的疾病作用靶點。

1.3 蝦青素成分靶點與乳腺癌疾病靶點互作

將預(yù)測到ASX的有效成分靶點和乳腺癌的預(yù)測靶點進(jìn)行匹配，并通過Cytoscape 3.7.1軟件，根據(jù)成分與靶點關(guān)聯(lián)的程度、匹配的程度繪制對應(yīng)藥成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。所獲取的潛在靶點導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用在線數(shù)據(jù)庫String(https：//string-db.org)中，在Organism欄中選擇Homosapiens，限定物種為人源，挖掘出核心調(diào)控靶點?；诖藰?gòu)建ASX靶點與乳腺癌靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)。

1.4 GO基因功能富集分析和KEGG通路富集分析

將ASX抑制乳腺癌的潛在作用靶點導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用在線數(shù)據(jù)庫String(https：//string-db.org/)中，選擇Homosapiens，限定物種為人源，在基因本體論(Gene On-tology，GO)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中進(jìn)行通路分析，并下載各分析的TSV 格式文件。通過多功能生物信息分析平臺Omicshare(http：//www.omicshare.com/tools/index.php/)對ASX抑制乳腺癌的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能以及關(guān)鍵通路進(jìn)行篩選與數(shù)據(jù)可視化處理。

1.5 細(xì)胞實驗驗證

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌4T1 細(xì)胞，以含7% FBS，100 U/mL青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。每3 d 換液1 次，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL進(jìn)行實驗。

1.5.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

制備乳腺癌4T1細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以每孔1×104接種于96孔板，設(shè)置不同濃度的ASX實驗組，空白對照組(加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基)，同時每組設(shè)5個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，細(xì)胞貼壁后吸除原培養(yǎng)液，實驗組分別加入100 μL不同濃度的ASX，空白對照組加入100 μL不含藥物的培養(yǎng)基。同時使用3塊96孔板進(jìn)行上述步驟，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48和72 h。加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，避光孵育4 h，吸凈每孔液體，加入150 μL DMSO，避光低速震蕩10 min，檢測各孔OD490的吸光值。計算公式：抑制率=(對照組OD值-藥物組OD值)/對照組OD值×100%。

1.5.3 Western Blot檢測p-AKT和PI3K表達(dá)水平

PBS洗凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加300 μL 的蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白；用BCA 試劑盒測蛋白濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白上樣量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分離蛋白質(zhì)(60 μg)，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，一抗孵育PVDF膜4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色后進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

Western Blot條帶采用image J軟件分析，GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素成分靶點的獲得

利用STITCH、Pharm mapper和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫共獲得ASX潛在靶點53個。

2.2 乳腺癌靶點的獲取

以“breast cancer”為關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫中搜尋到靶點，整合所有靶點并去除重復(fù)項后共得到218個潛在的疾病作用靶點(圖1)。

圖1 蝦青素-乳腺癌交互作用Figure 1 Interaction for astaxanthin-breast cancer

2.3 蝦青素抑制乳腺癌靶點的網(wǎng)絡(luò)互作分析

將ASX靶點與乳腺癌靶點進(jìn)行比對，共獲取交集靶點21個，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名(表1)。

表1 蝦青素抑制乳腺癌主要靶點信息Table 1 Potential target information for astaxanthin in the inhibition of breast cancer

采用jvenn繪制ASX-乳腺癌交集基因圖(圖2)。

圖2 蝦青素-乳腺癌交集基因韋恩圖Figure 2 Venn diagram for the targets of astaxanthin-breast cancer

把以上21個潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并下載TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化處理，節(jié)點的顏色和大小反映網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點連接度(Degree)的大小，再基于Cytoscape平臺內(nèi)置的“NetworkAnalyer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到所有靶點的節(jié)點連接度(Degree值)、節(jié)點緊密度(Closeness值)和節(jié)點介度(Betweenness值)等相關(guān)信息，將Degree排名前3的靶點ADIPOQ(B-cell lymphoma-2BCL2)、BECNI(NF-kappa-B essential modulator)和PGR(progesterone receptor)作為ASX抑制乳腺癌的關(guān)鍵作用靶點(圖3)。

圖3 ASX抗乳腺癌的靶蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Figure 3 Network interaction diagram for the target proteins of breast cancer for the treatment of ASX

2.4 GO基因功能富集分析及KEGG通路富集分析

在GO分析中，篩選錯誤率(false discovery rate，F(xiàn)DR)值<0.05的生物過程，包括：參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控、低氧反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、甾體激素介導(dǎo)、RNA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄起始等生物進(jìn)程(biology process)，其中WNT4參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并與ANXA1、AR、ANXA1和ADIPOQ調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生長發(fā)育；涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞及胞外成分的改變等細(xì)胞組分(cellular component)，其中S100A9廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)外，CXCL2、TGFB2和MMP2主要分布在細(xì)胞外液；與甾體激素受體活性、DNA特異性序列結(jié)合、鋅離子結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、載體結(jié)合活性、受體活性、DNA和蛋白結(jié)合、RNA聚合酶的調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合位點、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能(molecular function)相關(guān)，其中PGR與甾體激素受體活性有關(guān)，MMP2與鋅離子結(jié)合活性有關(guān)(圖4)。

(a)生物過程分析結(jié)果; (b)細(xì)胞組分分析結(jié)果；(c)分子功能分析結(jié)果。圖4 蝦青素抑制乳腺癌的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of related targets of astaxanthin

KEGG富集的ASX抗乳腺癌的前22條通路，主要與免疫相關(guān)的通路有T、B淋巴信號通路、NF-κB、PI3K-AKT、癌癥、Toll相關(guān)的信號通路(圖5)。

圖5 KEGG通路分析結(jié)果Figure 5 KEGG enrichment analysis of related targets of astaxanthin

CD40LG、NOTCH2、MMP2、ANXA1、GCLM、RAD51、ADIPOQ和BECN1富集于PI3K-AKT信號通路，其中PI3K-AKT與T、B淋巴信號通路、NF-κB、Toll相關(guān)的信號通路有關(guān)(圖6)。

圖6 PI3K-AKT信號通路圖(https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway) Figure 6 The signaling pathway of PI3K-AKT

2.5 蝦青素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，分別用ASX(50、150和300 μmol/L)處理乳腺癌4T1細(xì)胞24、48和72 h后發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，150和300 μmol/L的ASX顯著抑制4T1細(xì)胞生長(圖7)。

2.6 蝦青素對p-AKT、PI3K表達(dá)的影響

由結(jié)果可知，ASX作用于乳腺癌4T1細(xì)胞48 h后，與空白組相比，150和300 μmol/L的ASX可顯著降低AKT的磷酸化；300 μmol/L的ASX可顯著降低PI3K的表達(dá)水平(圖8)。

3 討論與結(jié)論

*:P<0.05。圖7 蝦青素對4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Figure 7 Effect of astaxanthin on proliferation of 4T1 breast cancer cells

(a)蝦青素對p-AKT、PI3K蛋白表達(dá)的影響; (b)蝦青素對p-AKT、PI3K蛋白表達(dá)影響的分析結(jié)果。圖8 蝦青素對4T1乳腺癌細(xì)胞p-AKT、PI3K表達(dá)的影響Figure 8 Effect of astaxanthin on p-AKT and PI3K in 4T1breast cancer cells

ASX治療是減少乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的有效方法[6,8-9]，若ASX納入抗癌治療，將有助于控制腫瘤生長，并可能減少放療和化療相關(guān)副作用的影響，ASX抗乳腺癌的作用機(jī)制到底是什么，目前還未見相關(guān)報道。癌癥本身就是一個多基因參與、涉及多種分子機(jī)制的復(fù)雜過程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因其整體性、系統(tǒng)性的特點恰好解決了“藥物-多靶點-多途徑”的問題。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)網(wǎng)頁及軟件，篩選和整理得到ASX 3個關(guān)鍵靶點與抗乳腺癌作用極為密切，包括ADIPOQ、BECNI和PGR。ADIPOQ干預(yù)乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡[13]；BECNI是NF-kappa-B的必需調(diào)節(jié)劑，而NF-kappa-B與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14]；PGR在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[15]。這3個靶點共同參與乳腺癌信號通路，干預(yù)癌細(xì)胞增殖與凋亡，調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的藥物成分-多靶點的特點一致，且ASX抗乳腺癌的作用靶點并非單獨起作用，靶點間存在著相互作用關(guān)系，是一個相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

為進(jìn)一步分析ASX抗乳腺癌靶點所涉及的信號通路，本研究對ASX的靶點進(jìn)行了KEGG通路分析。結(jié)果顯示，PI3K/AKT途徑為抑制乳腺癌主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，ASX與乳腺癌交互基因CD40LG、NOTCH2、MMP2、ANXA1、GCLM、RAD51、ADIPOQ和BECN1也均富集于PI3K/AKT信號通路，且PI3K/AKT信號通路與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的多種差異明顯的ASX的作用通路相互作用，因此本研究采用Western Blot方法驗證了ASX對4T1乳腺癌中PI3K/AKT信號通路的影響。由于該通路多與免疫調(diào)控相關(guān)，后期為了驗證PI3K/AKT在乳腺癌中的免疫調(diào)節(jié)作用，常選用具有免疫調(diào)節(jié)功能的BalB/C小鼠建立乳腺癌模型。前期本課題組曾將人癌細(xì)胞系接種于Balb/C小鼠，但未建模成功；而4T1細(xì)胞能成功接種于Balb/C小鼠，所以本研究后期選用該細(xì)胞系作為驗證對象。結(jié)果顯示ASX作用于乳腺癌4T1細(xì)胞后，顯著降低了p-AKT和PI3K的表達(dá)水平，說明ASX可以通過PI3K/AKT調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡及增殖，且本研究也證實ASX可以促進(jìn)4T1乳腺癌細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，多種藥物成分可通過PI3K/AKT信號通路抑制乳腺癌。如金雀異黃酮[16]通過抑制PI3K/AKT信號通路下調(diào)ADIPOQ的表達(dá)進(jìn)而抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長；紅花[17]多糖經(jīng)PI3K/AKT通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435 的凋亡；山慈菇[18]能通過PI3K/AKT 信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。PI3K/AKT信號通路動態(tài)調(diào)控乳腺癌[19]等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，ASX可以顯著降低AKT的磷酸化，進(jìn)而減少ADIPOQ，最終導(dǎo)致腸癌、口腔癌細(xì)胞的凋亡[20]。除PI3K/AKT信號通路外，本研究還發(fā)現(xiàn)了由TNF、Ras等介導(dǎo)的通路與ASX抗乳腺癌相關(guān)。文獻(xiàn)報道ASX可以調(diào)節(jié)TNF信號通路中TNF-α的含量[21]，并下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的IκB-α磷酸化[22]。TNF-α促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[23]，Takuya等[24]發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/ERK參與調(diào)控乳腺癌生長發(fā)育。而體內(nèi)、外數(shù)據(jù)表明，PI3K / AKT和Ras / MEK / ERK具有多個交叉點和反饋回路，影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡[25]。因此，我們選取PI3K/AKT信號通路作為驗證對象。

本研究通過GO富集分析ASX防治乳腺癌的生物過程發(fā)現(xiàn)，ASX的作用靶點ADIPOQ、NOTCH2、ANXA1、RAD51和WNT4參與乳腺癌細(xì)胞的生長增殖調(diào)控；CXCL2、TGFB2和MMP2參與乳腺癌的免疫調(diào)節(jié)作用，并參與調(diào)控癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；NQO1 參與乳腺癌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。由此推斷ASX可通過多靶點相互作用的機(jī)制，干預(yù)PI3K/AKT通路從而實現(xiàn)對乳腺癌的防治作用。且本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，ASX具有抑制乳腺癌4T1細(xì)胞生長的作用，并可以增強免疫低下小鼠的免疫功能。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，快速構(gòu)建出“ASX-靶點-乳腺癌”的網(wǎng)絡(luò)模型，有利于預(yù)測與分析ASX的作用途徑和機(jī)制；并從網(wǎng)絡(luò)分子藥理學(xué)角度為ASX防治乳腺癌提供依據(jù)，并發(fā)現(xiàn)ASX通過PI3K/AKT信號通路多靶點干預(yù)乳腺癌，為臨床上更有效地利用ASX防治乳腺癌提供理論依據(jù)，繼而為防治乳腺癌提供新的指導(dǎo)。