短鏈脂肪酸酯生物合成研究進(jìn)展

陸家聲，章曉宇，蔣羽佳，章文明，信豐學(xué)，姜 岷

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京 211816)

短鏈脂肪酸酯在食品和化學(xué)工業(yè)中都有廣泛應(yīng)用，預(yù)計到2022年，短鏈脂肪酸酯的全球市場將超過20億美元[1]。乙酸乙酯、丁酸丁酯等是GB2760—86規(guī)定允許使用的食用香料，在食品領(lǐng)域具有廣泛的用途[2-3]，同時也廣泛用于化妝品和香精中[4-6]。各種短鏈脂肪酸酯由于其生物降解性和低毒性而被用作工業(yè)溶劑，或者用作增塑劑和聚合物添加劑；可用作潤滑劑、涂料；還可用來替代燃料或生物柴油。例如：丁酸丁酯，其辛烷值為97.3，高于EN228(歐洲汽油標(biāo)準(zhǔn))中規(guī)定的最低值95，并且與汽油、航空煤油和柴油等具有良好的兼容性和相似的理化性質(zhì)，在低溫下仍具有良好的燃燒性能，使其成為潛在的航空燃料成分[7]。

短鏈脂肪酸酯天然存在于蔬菜、水果和漿果中，然而其天然含量低，提取成本昂貴。目前短鏈脂肪酸酯的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)是以酸和醇為原料，濃硫酸為催化劑，通過酯化反應(yīng)在高溫和高壓下合成(圖1)。該工藝雖然技術(shù)成熟、產(chǎn)品收率高，但存在副反應(yīng)多、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重、“三廢”排放量大等弊端[8]。為克服上述問題，研究人員開發(fā)了通過使用固定化脂肪酶的酶法工藝，在常溫、標(biāo)準(zhǔn)大氣壓和溫和pH條件下，通過脂肪酶催化醇和酸進(jìn)行酯化合成酯。這種酶促反應(yīng)通常具有高特異性和效率，副產(chǎn)物少，下游回收成本低等優(yōu)點[8-9]，但是其合成收率較低、底物和酶成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。因此迫切需要開發(fā)新型生產(chǎn)工藝，以實現(xiàn)短鏈脂肪酸酯的高效合成。

圖1 短鏈脂肪酸酯的合成途徑Figure 1 Synthesis pathways of short chain fatty acid esters

隨著合成生物學(xué)和發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展，利用生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯已引起廣泛關(guān)注。生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯以可再生的生物質(zhì)為原料，具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品純度高、過程綠色環(huán)保等優(yōu)勢；且生物發(fā)酵合成的短鏈脂肪酸酯更受消費(fèi)者青睞，其價格要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)合成的短鏈脂肪酸酯，因此，在食用香精和日化香料等領(lǐng)域具有更廣泛的市場。目前，微生物發(fā)酵合成短鏈脂肪酸酯仍處于實驗室水平，但近年來，國內(nèi)外研究人員已開展生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯的工作，基于合成機(jī)制可分為4類(圖2)，研究較為深入的是基于醇?；D(zhuǎn)移酶和酯酶催化合成短鏈脂肪酸酯。本文介紹國內(nèi)外生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯，特別是丁酸丁酯的最新研究進(jìn)展，指出目前所面臨的問題和挑戰(zhàn)，展望未來的研究方向。

(a)基于醇?；D(zhuǎn)移酶;(b)基于酯酶;(c)基于半縮醛脫氫酶;(d)基于Baeyer-Villiger單加氧酶。圖2 短鏈脂肪酸酯的生物合成途徑Figure 2 Biosynthesis of short chain fatty acid esters

1 短鏈脂肪酸酯的生物合成機(jī)制

微生物合成短鏈脂肪酸酯過程中的酶促途徑分別涉及：醇?；D(zhuǎn)移酶(AATs)、酯酶(esterases)、半縮醛脫氫酶(HADH)和Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMOs)。醇?；D(zhuǎn)移酶和酯酶催化的反應(yīng)是氧化還原中性的，而BVMOs和HADH分別需要NAD(P)H或NAD(P)。

1.1 醇?；D(zhuǎn)移酶

醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AATs)可以在細(xì)胞內(nèi)催化醇與?；鵆oA縮合反應(yīng)生成短鏈脂肪酸酯[10]，包括乙酸丁酯、丁酸丁酯等[圖2(a)]。各種醇酰基轉(zhuǎn)移酶在酵母和水果中被發(fā)現(xiàn)(包括草莓、香蕉、甜瓜和蘋果)[11-12]。醇?；D(zhuǎn)移酶與蠟合酶/二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(WS/DGA)的區(qū)別在于底物偏好相對較短的碳長度[13]?；诖?，AATs常被用于生產(chǎn)短鏈酯的合成，而WS/DGA則多被用于生產(chǎn)長鏈酯如生物柴油等的合成[14-16]。

(a) 通過醇酰基轉(zhuǎn)移酶體內(nèi)合成酯; (b) 通過脂肪酶體外合成酯。圖3 體內(nèi)/體外合成短鏈脂肪酸酯的代謝途徑Figure 3 Metabolic pathways for esters synthesis in vivo and in vitro

在野生型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，醇?；D(zhuǎn)移酶ATF1和ATF2分別由基因ATF1和ATF2編碼，它們主要參與釀酒酵母中乙酸酯的形成[11,17-18]。有研究證實，在工程大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株中，ATF1對C4醇和乙酰CoA的底物偏好優(yōu)于C6醇和乙酰CoA[19]，但ATF2的底物偏好尚未詳細(xì)定義。在其他酵母菌株中也發(fā)現(xiàn)了ATF1和ATF2的同系物，包括卡爾斯伯格酵母(S.carlsbergensis)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)[20-21]。微生物AATs屬于兩個結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的蛋白質(zhì)家族[22]。一種是乙酰轉(zhuǎn)移酶1 (ATF1)、乙酰轉(zhuǎn)移酶2 (ATF2)和?；D(zhuǎn)移酶A (ATFA)，它們具有O-?；D(zhuǎn)移酶的一些特征，其中包含保守的HXXXD和DFGWG基序，HXXXD基序參與?；D(zhuǎn)移。第二種AATs由乙醇己?；D(zhuǎn)移酶1 (Eht1)和乙酯生物合成1 (Eeb1)的旁系同源物以及最近發(fā)現(xiàn)的乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶1 (Eat1)組成[23]。另外，還從水果中發(fā)現(xiàn)多種醇?；D(zhuǎn)移酶，如草莓(SAAT和FaAAT2)、香蕉(BanAAT)、甜瓜(MAAT)和蘋果(AAAT)等。這些水果中的醇?；D(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物特異性，范圍從C1醇到C10醇或更高級的醇。

1.2 酯酶

酯酶包括脂肪酶，是一種普遍存在的酶。與催化醇與?；鵆oA酯化的醇?；D(zhuǎn)移酶相反，脂肪酶催化醇與酸的酯化[圖2(b)]，在有機(jī)相中產(chǎn)生酯[24]。因此，在脂肪酶介導(dǎo)的酯的生產(chǎn)過程中，醇和酸被用作前體。脂肪酶與酸反應(yīng)生成脂肪酶-酸復(fù)合物，然后該復(fù)合物異構(gòu)化形成?；久钢虚g體。在下一步中，?；久覆东@醇產(chǎn)生另一個復(fù)合物，該復(fù)合物異構(gòu)化形成酯-脂肪酶復(fù)合物，最終酯從綜合體中釋放出來。另外，脂肪酶還可以通過其α/β-水解酶活性催化脂肪酸酯(包括三酰甘油)的水解[25-26]。

已經(jīng)從各種微生物中鑒定出脂肪酶，包括無色桿菌屬(Achromobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)、南極假絲酵母(C.antarctica)、皺假絲酵母(C.rugosa)等[27-28]。特別是南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)，它是一種眾所周知的酶，能催化各種反應(yīng)，包括香料和香料酯(短鏈酯)、生物二酯(長鏈酯)和改性甘油酯的合成，具有高活性、魯棒性和底物的廣譜可用性。在商業(yè)應(yīng)用中，CALB通常以固定化形式在雙相條件下使用，因為游離酶在含水條件下不穩(wěn)定[29]。諾維信435 (N435)通過界面活化將CALB固定在LEWATIT?VPOC 1600樹脂上，已被廣泛用于各種酯的生物合成，包括丁酸丁酯、辛酸丁酯、棕櫚酸香茅酯和咖啡酸甲酯等。

1.3 半縮醛脫氫酶

半縮醛是由醛和醇的自發(fā)反應(yīng)在體內(nèi)形成的。隨后NAD(P)依賴性的半縮醛脫氫酶催化其形成酯[圖2(c)]。嚴(yán)格意義上這種類型的酶是不存在的，因為HADH反應(yīng)是某些醇脫氫酶的副作用[30]。半縮醛脫氫首次在甲基營養(yǎng)酵母中被觀察到，因為當(dāng)酵母以甲醇或乙醇為碳源生長時，高濃度的甲醛和乙醛分別積累，這對大多數(shù)生物都是有毒的[31]。半縮醛脫氫作用可能是通過半縮醛將醛轉(zhuǎn)化為酯來解毒[32]。在甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)和釀酒酵母(S.cerevisiae)的甲酸甲酯合成中發(fā)現(xiàn)了HADH的活性[33]。半縮醛脫氫可能有助于粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、杰丁塞伯林德納氏酵母(Cyberlindnerajadinii)和馬克思克魯維酵母(K.marxianus)中乙酸乙酯的形成，但這尚未在體內(nèi)得到證實[34]。

1.4 Baeyer-Villiger單加氧酶

Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMOs)是含有黃素的酶，因此需要NAD(P)H作為輔因子。它可以催化氧在醛和酮的C-C鍵之間的插入[圖2(d)]。BVMOs的特征是具有FXGXXXHXXXW(P/D)序列基序，其在生活的所有領(lǐng)域中都有發(fā)現(xiàn)[35]。在自然界中，BVMOs參與次級代謝物的合成或啟用非常規(guī)碳源的利用，如烷烴、酮或環(huán)狀醇。BVMOs催化酮轉(zhuǎn)化為酯，再進(jìn)一步水解為易于代謝的醇和酸。這樣的途徑使戈登氏菌(Gordoniasp.)和維羅納假單胞菌(Pseudomonasveronii)可以分別在丙烷或甲基酮上生長。目前，BVMOs的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用已在其他地方進(jìn)行了廣泛研究[36]。

2 微生物發(fā)酵合成短鏈脂肪酸酯

目前，ATTs在體內(nèi)酯生產(chǎn)的代謝工程領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，因為該反應(yīng)在熱力學(xué)上是有利的(ΔG<0)，并且不需要輸入還原力。ATTs將一種醇和一種酰基CoA轉(zhuǎn)化成酯(圖3)，在這個過程中釋放出游離的CoA。醇和酰基CoA都容易在生物系統(tǒng)中產(chǎn)生，可以作為酯合成的有效前體。

在微生物發(fā)酵過程中(含水條件)，脂肪酶催化酯化反應(yīng)在熱力學(xué)上是不利的(ΔG>0)。因此有研究開始嘗試在發(fā)酵體系中加入有機(jī)萃取劑，實現(xiàn)酯的生產(chǎn)與原位萃取同時進(jìn)行，以此推動反應(yīng)向酯的生產(chǎn)方向進(jìn)行。

目前利用HADH生產(chǎn)酯的代謝工程還沒有報道，因為通過這種途徑生產(chǎn)酯的過程會積累醛，而醛對細(xì)胞具有毒性，因此具有挑戰(zhàn)性[31]。此外，半縮醛的形成是自發(fā)的，需要酸催化劑，這在生理的中性條件下是不存在的。

BVMOs將環(huán)酮生物轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯(環(huán)酯)已得到廣泛研究[37]，但是這種體外過程依賴于昂貴的輔因子外部供應(yīng)，如NAD(P)H。因此，從更便宜的底物如糖直接合成酯可能更經(jīng)濟(jì)，而且BVMO催化的酯生產(chǎn)也依賴于酮的供應(yīng)，而酮不是常見的微生物代謝物。

2.1 利用醇?；D(zhuǎn)移酶直接胞內(nèi)合成短鏈脂肪酸酯

2.1.1 乙酸乙酯的天然合成

目前短鏈脂肪酸酯的天然合成主要集中在乙酸乙酯(表1)。已經(jīng)有大量研究報道了各種酵母可以通過內(nèi)源性AATs的催化作用，天然酯化?；鵆oA和乙醇形成乙酸乙酯。然而，使用這種策略的乙酸乙酯產(chǎn)量特別低。主要原因可能是前體?；鵆oA優(yōu)先流向三羧酸(TCA)循環(huán)，而不是積累形成乙酸乙酯。因此假設(shè)當(dāng)乙酰CoA在線粒體中積累時，大量乙酸乙酯的形成是代謝物溢出的現(xiàn)象[38]。具有從糖大量生產(chǎn)乙酸乙酯能力的酵母可以在胞質(zhì)溶膠中將糖氧化成丙酮酸，然后在有氧條件下將丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。在線粒體中，丙酮酸被氧化成乙酰CoA，然后流入TCA循環(huán)。如果TCA循環(huán)被破壞，乙酰CoA將在線粒體中積累，因為它不能進(jìn)入TCA循環(huán)。在這種條件下，積累的乙酰CoA將通過AAT與乙醇形成乙酸乙酯。因此，抑制TCA循環(huán)積累乙酰CoA是增加乙酸乙酯產(chǎn)量的關(guān)鍵步驟。有研究采用鐵限制作為合成乙酸乙酯的觸發(fā)因素，在70 L攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行中試發(fā)酵，使用馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)從乳清中合成乙酸乙酯[39]。由于參與TCA循環(huán)的烏頭酸酶(aconitase)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)的活性依賴于鐵，在鐵限制條件下TCA循環(huán)將被破壞。當(dāng)培養(yǎng)基中的初始鐵濃度從182 μg/L降低到53 μg/L時，乙酸乙酯的產(chǎn)量從4.7 g/L提高到10.9 g/L，最終產(chǎn)率為 51.4%。L?bs等[40]采用CRISPR干擾系統(tǒng)(CRISPRi)可以實現(xiàn)精確的轉(zhuǎn)錄控制和途徑優(yōu)化，同時抑制馬克斯克魯維酵母中TCA循環(huán)的烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶亞基1和2的基因表達(dá)。最終，重組菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量達(dá)到野生菌株的3.8倍。綜上所述，TCA循環(huán)對乙酰CoA積累的干擾可以提高乙酸乙酯的生產(chǎn)效率。

表1 生物發(fā)酵法合成乙酸乙酯的比較

電子傳輸鏈(ETC)是參與乙酸乙酯合成的另一個主要因素[41]。培養(yǎng)基中銅的缺乏不利于ETC工作，從而減緩NADH氧化NAD+，而乙酰CoA由于線粒體NAD+含量低，很難進(jìn)入TCA循環(huán)[42]。ETC由4種多酶復(fù)合物組成，稱為復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。已經(jīng)有研究[41]證明ETC抑制劑可以提高馬克斯克魯維酵母中的乙酸乙酯產(chǎn)量。ETC抑制劑羧苷能抑制復(fù)合物Ⅱ活性，輕度影響酵母生長和糖分消耗，乙酸乙酯的產(chǎn)量隨羧化蛋白濃度的增加而增加。補(bǔ)充較低量的抗霉素A和氰化物(0.01 μmol/L抗霉素A和0.1 mmol/L氰化物)也可以提高最終乙酸乙酯的產(chǎn)量，但是過量會降低乙酸乙酯的產(chǎn)量。盡管ETC抑制劑可以有效地提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，但由于其毒性和高成本，阻礙了其大規(guī)模生產(chǎn)。為了克服這個障礙，可以采用無害的CRISPRi來敲除ETC相關(guān)基因，包括琥珀酸脫氫酶亞基2(SDH2)、鐵硫蛋白(RIP1)和轉(zhuǎn)錄激活因子MSS51，此時乙酸乙酯的產(chǎn)量可分別提高39%、52%和42%[40]。

2.1.2 代謝工程實現(xiàn)短鏈脂肪酸酯的合成

最常用的生物合成短鏈脂肪酸酯的方法仍然是通過AATs催化，研究比較充分的AATs是來自釀酒酵母ATF1和ATF2。ATF1占釀酒酵母乙酸乙酯產(chǎn)量的50%[46]。過量表達(dá)ATF1可顯著提高乙酸乙酯滴度，而ATF2和Lg-ATF1效果不明顯。然而，缺乏ATF1和ATF2的釀酒酵母菌株仍然保留了50%的乙酸乙酯產(chǎn)量。此外，ATF1、ATF2及其同源物似乎位于胞質(zhì)溶膠或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而乙酸乙酯的產(chǎn)生主要發(fā)生在線粒體中。這一現(xiàn)象表明其他關(guān)鍵酶應(yīng)該負(fù)責(zé)乙酸乙酯的合成。為了提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，Dong等[43]通過插入強(qiáng)啟動子PGK1p和終止子PGK1t分別過量表達(dá)了磷酸泛酸半胱氨酸連接酶(CAB2)、乙酰CoA合成酶(ACS2)和ATF1，以增加乙酰CoA的積累。利用基因工程釀酒酵母生產(chǎn)乙酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到610.26 mg/L，比搖瓶中原始菌株的9.22 mg/L高出60多倍。

最近，一個新的AATs家族被發(fā)現(xiàn)并命名為Eat1。乳酸克魯維酵母中乙酸乙酯產(chǎn)量的80%應(yīng)歸功于Eat1的同源物，這些同源物存在所有已知的大量乙酸乙酯生產(chǎn)酵母中，如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母和異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)[11]。Eat1已被證明位于酵母的線粒體中，其在酵母線粒體中的定位支持了乙酸乙酯合成利用線粒體乙酰CoA作為前體的假設(shè)。為證明Eat1在乙酸乙酯生物合成中的重要性，Kruis等[11]分別在釀酒酵母中過量表達(dá)Eat1、ATF1和ATF2。結(jié)果，過量表達(dá)Eat1的釀酒酵母的乙酸乙酯產(chǎn)量比其他兩個代謝工程菌株高26倍。然而，釀酒酵母中乙酸乙酯產(chǎn)量低(理論途徑最大值的1.32%)表明它可能不是最佳的生產(chǎn)宿主。這可能是因為釀酒酵母中的主要碳流量繞過線粒體，有利于細(xì)胞溶質(zhì)乙醇的形成。出人意料的是，當(dāng)在大腸桿菌中過量表達(dá)密碼子優(yōu)化的Eat1后，最終可從20 g/L葡萄糖和5.9 g/L乙醇產(chǎn)生4.87 g/L乙酸乙酯，最大途徑收率為(32.93±0.11)%，表明大腸桿菌有潛力用于乙酸乙酯生產(chǎn)。研究表明當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時，Eat1的穩(wěn)定性可以通過修剪被鑒定為線粒體靶向信號的N末端前序列來提高。因為原核宿主無法處理線粒體前序列，這可能導(dǎo)致Eat1異源表達(dá)受阻，從而使乙酸乙酯產(chǎn)量受損。Bohnekamp等[44]通過過量表達(dá)截短的Eat1變體(來源于異常威克漢姆酵母)并破壞乙酸激酶(ackA)和乳酸脫氫酶(ldhA)來改造大腸桿菌菌株，使其達(dá)到乙酸乙酯代謝通量最大化。因此，該工程菌株可以從55 mmol/L葡萄糖厭氧產(chǎn)生42.8 mmol/L(3.8 g/L)乙酸乙酯，為最大途徑產(chǎn)量的72%。大腸桿菌中乙酸乙酯的高產(chǎn)量可能是由于大腸桿菌沒有線粒體，乙酸乙酯的合成直接發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，從而減少了副產(chǎn)物途徑的碳流量。

為了實現(xiàn)從可發(fā)酵糖直接生物合成乳酸酯，Lee等[47]提出了一個微生物轉(zhuǎn)化平臺。他們在大腸桿菌內(nèi)設(shè)計了一個丙酮酸-乳酸酯模塊，該模塊通過乳酸脫氫酶(ldhA)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶(pct)將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酰CoA，以及醇酰基轉(zhuǎn)移酶將乳酰CoA和醇縮合生成乳酸酯而組成。通過生成一個包含5個具有不同分配系數(shù)的丙酮酸-乳酸酯模塊的文庫，篩選出能夠在外部醇供應(yīng)下生產(chǎn)各種線性、支化和芳香族乳酸酯的最佳模塊。通過將丙酮酸-乳酸酯模塊和醇(即乙醇、異丁醇)模塊共同引入模塊化大腸桿菌(底盤)細(xì)胞中，首次展示了直接從葡萄糖微生物生物合成乳酸乙酯和乳酸異丁酯。為提高乳酸乙酯的產(chǎn)量，Lee等[47]將該途徑重新模塊化：產(chǎn)生乙醇和乳酸前體的上游模塊和產(chǎn)生乳酰CoA并將其與乙醇濃縮以產(chǎn)生目標(biāo)乳酸乙酯的下游模塊。通過質(zhì)粒拷貝數(shù)、啟動子、核糖體結(jié)合位點和環(huán)境干擾來控制上游和下游模塊的代謝通量，能夠通過將乳酸乙酯產(chǎn)量提高4.96倍來探測和緩解代謝瓶頸。該研究發(fā)現(xiàn)AAT是乳酸酯生物合成中最限速的步驟，這可能是由于它對非天然底物乳酰CoA和醇的低活性和特異性造成的。

除了乙酸乙酯和乳酸酯，近年來也有大量研究探索了在溶劑梭菌拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和大腸桿菌中構(gòu)建醇酰基轉(zhuǎn)移酶合成途徑來實現(xiàn)丁酯的合成。在基因工程改造的微生物中，作為合成的前體，丁醇和酰基CoA可通過葡萄糖分解代謝或外部補(bǔ)充獲得。拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌中存在天然的丁醇和?；鵆oA合成途徑，而模式微生物大腸桿菌缺乏?；鵆oA或丁醇的合成途徑，因此需要在大腸桿菌中構(gòu)建合成途徑。

野生型拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌可在胞內(nèi)合成高濃度的乙醇、丁醇，而在胞內(nèi)可合成乙酰CoA和丁酰CoA。這些都是醇?；D(zhuǎn)移酶用來合成短鏈脂肪酸酯的底物，使之成為合成丁酸丁酯很有前途的宿主。最近，釀酒酵母的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因ATF1被引入拜氏梭菌NCIMB 8052中，使其能夠從葡萄糖直接生產(chǎn)乙酸丁酯[48]。通過一系列優(yōu)化，在48 h 內(nèi)可以從38.2 g/L葡萄糖中生成5.57 g/L乙酸丁酯(包括在水相中的1.03 g/L和在有機(jī)相中的45.3 g/L，水/非水相的體積比為10∶1)，比以前的報道結(jié)果高665倍。同樣地，在丙酮丁醇梭菌中表達(dá)AAT酶的基因?qū)μ烊划a(chǎn)生水果酯如乙酸丁酯、乙酸乙酯和丁酸丁酯是可行的選擇[49]。其中，丁酰CoA和丁醇是由4種酶依次轉(zhuǎn)化2個乙酰CoA分子形成的，分別為硫酶(thiolase)、3羥基丁酰CoA脫氫酶(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase)、巴豆酶(crotonase)和丁酰CoA脫氫酶(butyryl-CoA dehydrogenase)[50-51]。另外，丁酰CoA也可以通過CoA轉(zhuǎn)移酶對丁酸的再甲基化而形成[52]。在最近一項研究中，選擇具有強(qiáng)碳通量產(chǎn)生丁醇和丁酰CoA的丙酮丁醇梭菌ATCC 824被用作宿主，并通過引入來自草莓屬(Fragaria×ananassa)或蘋果屬(Malussp.)的醇?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行工程改造[53]。其中，密碼子優(yōu)化的SAAT和AAAT基因可在thl啟動子的控制下表達(dá)。表達(dá)草莓SAAT基因的工程化丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT通過分批培養(yǎng)可以合成50.07 mg/L的丁酸丁酯，占產(chǎn)生總酯的84.8%。同樣的，表達(dá)蘋果AAAT基因的工程化丙酮丁醇梭菌菌株CaAAAT可以合成40.60 mg/L的丁酸丁酯，丁酸丁酯的選擇性為87.4%。這項研究證明在工程改造的丙酮丁醇梭菌中從葡萄糖一步發(fā)酵丁酸丁酯的可行性，也是首次利用一步發(fā)酵法直接合成丁酸丁酯的研究報道。目前，Noh等[54]使用的丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT和CaAAAT在丁酸丁酯滴度和選擇性方面均表現(xiàn)出最佳性能。在酶和前體方面，應(yīng)考慮其特異性對丁酸丁酯的產(chǎn)率影響，在丙酮丁醇梭菌的進(jìn)一步工程改造中，用于高效生產(chǎn)丁酸丁酯。在這項工作中，證明通過利用草莓或蘋果中的AAT與丙酮丁醇梭菌中C4途徑的組合，選擇性地生產(chǎn)丁酸丁酯。此外，在工程菌株的培養(yǎng)過程中，實現(xiàn)丁酸丁酯生產(chǎn)無需包括丁醇和丁酰CoA在內(nèi)的前體外源。另外還發(fā)現(xiàn)在丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT和CaAAAT之間，丁酸丁酯在丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)中的選擇性沒有顯著差異，并且這些工程改造的丙酮丁醇梭菌菌株可以作為開發(fā)其他菌株的平臺[55-58]。因此這些菌株進(jìn)一步提高了丁酸丁酯的滴度和選擇性。

與丙酮丁醇梭菌不同，大腸桿菌沒有形成丁醇和丁酰CoA的天然途徑。因此，如果選擇大腸桿菌作為底盤細(xì)胞合成丁酸丁酯，必須異源引入代謝模塊以合成丁醇和丁酰CoA。丙酸梭菌pct基因編碼的?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶被用于取代丁酰CoA生產(chǎn)模塊[5]。工程大腸桿菌中的?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶將外部補(bǔ)充的丁酸轉(zhuǎn)化為丁酰CoA。Layton等[5]使用adhB和pdc基因編碼的醇生產(chǎn)酶，并測試突變大腸桿菌中酯化反應(yīng)的5種不同的醇?；D(zhuǎn)移酶。在工程改造的大腸桿菌菌株中，含有SAAT和VAAT的菌株分別產(chǎn)生47.63 mg/L和 2.76 mg/L的丁酸丁酯，以及 134.43 mg/L和141.60 mg/L的丁酸乙酯。相反表達(dá)ATF1、ATF2和AeAT9(Actinidiaeriantha)的菌株產(chǎn)生約0.17～0.28 mg/L的丁酸丁酯。據(jù)報道[59-63]，當(dāng)提供合適的底物時，乙酸異戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯和丁酸丁酯是通過在大腸桿菌中表達(dá)釀酒酵母基因ATF1或ATF2和草莓基因SAAT而產(chǎn)生的。提高添加到反應(yīng)中的醇的濃度通?？梢蕴岣啧サ漠a(chǎn)量。Horton等[54]在大腸桿菌和丙酮丁酸梭菌中異源表達(dá)釀酒酵母基因ATF1或ATF2和由SAAT編碼草莓的醇乙?；D(zhuǎn)移酶基因，以建立通過微生物生物合成產(chǎn)生幾種酯的方案。在相同培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)ATF1表達(dá)比ATF2表達(dá)或SAAT表達(dá)能產(chǎn)生更多的乙酸異戊酯和乙酸丁酯。此外，SAAT表達(dá)比ATF2表達(dá)能產(chǎn)生更多的乙酸異戊酯和乙酸丁酯。丁酸丁酯是由含有SAAT而不是ATF1或ATF2的大腸桿菌的無細(xì)胞提取物產(chǎn)生的。盡管ATF2在酵母中似乎是多余的，但是這兩個基因均適用于探索大腸桿菌和丙酮丁醇梭菌的代謝通量。研究表明，最終產(chǎn)品丁酸丁酯是需要在丙酮丁醇梭菌中生產(chǎn)的，盡管表達(dá)ATF1和ATF2的大腸桿菌培養(yǎng)物中的無細(xì)胞提取物不產(chǎn)生丁酸丁酯，但是當(dāng)檢查大腸桿菌SAAT菌株的無細(xì)胞提取物時，發(fā)現(xiàn)草莓醇酰基CoA轉(zhuǎn)移酶確實利用了丁酰CoA，并且可以生產(chǎn)丁酸丁酯。草莓SAAT利用高濃度丁醇和丁酰CoA的能力表明，它將是在丙酮丁醇梭菌中表達(dá)的理想酶。結(jié)果表明，ATF2可以在丙酮丁醇梭菌中表達(dá)并具有酶促活性，因此證明使用轉(zhuǎn)基因丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)酯的可行性。

因此，通過將酰基CoA和醇合成的子模塊與AAT生產(chǎn)子模塊結(jié)合起來在體內(nèi)進(jìn)行代謝可以實現(xiàn)一步法合成短鏈脂肪酸酯。同時，該策略還可以設(shè)計生成獨(dú)特短鏈酯的組合庫，如丁酸乙酯和丁酸丁酯等。但是，盡管可以以合理的水平生產(chǎn)一些短鏈脂肪酸酯，但使用該策略的酯的終濃度特別低。較低的滴度可能反映了固有底物(?；鵆oA和醇)可用性有限，這使得構(gòu)建體內(nèi)高短鏈脂肪酸酯產(chǎn)率的合成途徑成為主要挑戰(zhàn)[64-65]。

2.2 胞外補(bǔ)充脂肪酶合成短鏈脂肪酸酯

與催化醇與?；鵆oA酯化的醇?；D(zhuǎn)移酶不同，脂肪酶催化醇與酸的酯化。在脂肪酶介導(dǎo)的短鏈脂肪酸酯的生產(chǎn)過程中，醇和酸被用作前體(圖3)。通過酯酶進(jìn)行酯的工業(yè)生產(chǎn)通常是在非水系統(tǒng)中使用有機(jī)溶劑或高底物濃度進(jìn)行的[66]。因為化學(xué)反應(yīng)只有在導(dǎo)致吉布斯能量(G)降低的情況下，才能在給定方向上維持通量，而在水相中酯化反應(yīng)吉布斯自由能變(ΔG)大于0。也就是說，由于反應(yīng)引起的吉布斯能變(ΔG)必須是負(fù)的，酯化反應(yīng)才成立[67]。因此在脂肪酶介導(dǎo)的短鏈脂肪酸酯的生產(chǎn)過程中必須添加有機(jī)萃取劑，在添加萃取劑后，酯化反應(yīng)吉布斯自由能變小 于0，說明添加萃取劑后反應(yīng)可朝正向進(jìn)行[68]。

目前，基于胞外補(bǔ)充脂肪酶合成短鏈脂肪酸酯的研究主要集中在丁酸丁酯中。由于梭狀芽孢桿菌可以產(chǎn)生用于生產(chǎn)丁酸丁酯的前體，因此，一些研究采用丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、酪丁酸梭菌與脂肪酶一起產(chǎn)生丁酸丁酯。

2.2.1 基于產(chǎn)丁醇梭菌丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵合成丁酸丁酯

在溶劑梭菌丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol, ABE)發(fā)酵途徑過程中，酸的合成和溶劑的合成依次發(fā)生，即溶劑梭菌先合成乙酸和丁酸，然后合成丙酮、丁醇和乙醇，并且在產(chǎn)酸期合成的乙酸丁酸可誘導(dǎo)丁醇合成酶基因的表達(dá)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成醇。丁醇是一種脂溶性的化合物，過高的濃度會裂解細(xì)胞膜，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此在ABE發(fā)酵過程中丁醇的濃度都低于20 g/L。過低的丁醇濃度也導(dǎo)致下游丁醇的分離成本過高。因此，若能通過ABE發(fā)酵將丁醇進(jìn)一步衍生為更高附加值的丁酸丁酯，為丁醇的高值化衍生提供新的思路；且丁酸丁酯對細(xì)胞沒有毒性作用，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化可用于高濃度丁酸丁酯的生物合成[32]，因此溶劑梭菌是丁酸丁酯生產(chǎn)的一個極佳平臺。

雖然溶劑梭菌在ABE發(fā)酵過程中會有丁酸的合成，然而在溶劑合成期，大多數(shù)丁酸在醇脫氫酶的作用下會被用于丁醇的合成，這會導(dǎo)致丁酸和丁醇的比例非常低。因此，即使在外源添加脂肪酶的催化下，基于溶劑梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸丁酯的產(chǎn)量也可以忽略不計?？朔@一瓶頸的方法是在ABE發(fā)酵的指數(shù)期或發(fā)酵后期向培養(yǎng)基中外源添加丁酸，以維持足夠的丁酸和丁醇水平，保證合成丁酸丁酯的化學(xué)平衡持續(xù)向合成方向進(jìn)行。另一個問題就是溶劑梭狀不能分泌脂肪酶，必須通過添加外源脂肪酶以驅(qū)動酯化反應(yīng)的進(jìn)行。由于脂肪酶優(yōu)先在油水界面催化酯化反應(yīng)，因此必須連續(xù)從反應(yīng)混合物中除去丁酸丁酯，以推動平衡達(dá)到合成。為了促進(jìn)酯化過程，可以在發(fā)酵過程中加入無毒的萃取劑，如十六烷，以此提高丁酸丁酯的分配系數(shù)。

基于上述想法，Berg等[69]設(shè)計了通過耦合溶劑梭菌ABE發(fā)酵、脂肪酶催化酯化和原位萃取、以葡萄糖為底物一鍋法生產(chǎn)短鏈酯的原理驗證實驗。在丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)ABE的過程中，通過外源添加丁酸、脂肪酶和萃取劑十六烷，可實現(xiàn)將發(fā)酵產(chǎn)物丁醇衍生合成丁酸丁酯。最終結(jié)果表明：在進(jìn)行梭菌發(fā)酵時產(chǎn)生的丁醇直接酯化為丁酸丁酯，并且通過萃取劑被萃取到上層。十六烷是一種對細(xì)胞無毒，并且對丁酸丁酯具有高分配系數(shù)的萃取劑，因此即使在發(fā)酵液pH值較低和丁醇濃度相對較低的情況下，丁酸丁酯在十六烷中的高分配系數(shù)也會將酯化反應(yīng)拉向產(chǎn)物一側(cè)。最終，該體系可在十六烷相中合成5 g/L的丁酸丁酯，這也是首次報道的基于溶劑梭菌ABE發(fā)酵合成丁酸丁酯的研究。雖然丁酸丁酯的產(chǎn)量低于包括反應(yīng)和分配平衡數(shù)學(xué)模型的預(yù)期數(shù)值[70-72]，但是一鍋法生產(chǎn)短鏈脂肪酸酯普遍適用于通過原位酯化來克服發(fā)酵過程中對酸或醇的產(chǎn)物抑制。并且，其原理可以擴(kuò)展到更廣泛的酯的合成，尤其是一些長鏈脂肪酸酯。

盡管Berg等[69]通過一鍋法增加了丁酸丁酯的濃度，但是，發(fā)酵后必須從十六烷中提取丁酸丁酯，而且5 g/L仍不能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，迫切需要能夠有效地將有機(jī)酸和醇轉(zhuǎn)化為目標(biāo)酯的新策略和新型生物催化劑。最近，Xin等[73]篩選到一株擁有天然脂肪酶活性的溶劑梭菌菌株BOH3，且溶劑梭菌BOH3可通過ABE發(fā)酵合成高濃度的丁醇，并共產(chǎn)核黃素。研究發(fā)現(xiàn)，通過外源添加植物油，如橄欖油等可以誘導(dǎo)溶劑梭菌BOH3胞內(nèi)脂肪酶的表達(dá)。因此，在向發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加20%的橄欖油的情況下，該菌株可利用木糖直接合成約1.2 g/L的丁酸丁酯，消除了外源脂肪酶的添加。為進(jìn)一步提高丁酸丁酯的產(chǎn)量，作者優(yōu)化了萃取劑類型和發(fā)酵工藝，最終選擇可在培養(yǎng)基中形成乳濁液的Bio-OSR。Bio-OSR對細(xì)胞的生物沒有毒性，且乳濁液的形成進(jìn)一步增加了油水的接觸面積，增強(qiáng)了脂肪酶的活性。最終，通過優(yōu)化溶劑梭菌BOH3發(fā)酵過程中丁酸和脂肪酶的添加量，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵(持續(xù)補(bǔ)充7.9 g/L的丁酸)，在萃取劑柴油中丁酸丁酯的含量提高到22.4 g/L，這是利用溶劑梭菌ABE發(fā)酵法合成丁酸丁酯含量的最高報道。溶劑型梭狀芽孢桿菌在進(jìn)行ABE發(fā)酵過程中，菌株就會形成芽孢，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束，這大大限制了發(fā)酵時間，并影響最終丁酸丁酯的合成[69]。將來，若能利用無芽孢形成能力的溶劑梭菌進(jìn)行ABE發(fā)酵，并耦合原位萃取和補(bǔ)料發(fā)酵工藝，就可延長發(fā)酵時間，進(jìn)一步提高丁酸丁酯的產(chǎn)量。

2.2.2 基于產(chǎn)丁酸梭菌丁酸發(fā)酵合成丁酸丁酯

Spo0A是一種主調(diào)節(jié)因子，控制溶劑梭菌(如拜氏梭菌)的代謝轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)范圍涉及芽孢形成革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌和梭菌的孢子形成、菌落形態(tài)、運(yùn)動和趨化性等。因此，破壞可能導(dǎo)致Spo0A潛在引起細(xì)胞生理和代謝模式的重大改變。Spo0A還通過控制溶劑生產(chǎn)所必需的代謝酶表達(dá)，參與從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的代謝轉(zhuǎn)變。如拜氏梭菌中spo0A基因的破壞，會導(dǎo)致在pH控制下生物反應(yīng)器中細(xì)胞的生長情況改變，造成糖吸收和酸積累[56]?；趕po0A突變體有產(chǎn)生丁醇和丁酸的獨(dú)特能力，其被認(rèn)為是有希望生產(chǎn)丁酸丁酯的宿主。然而，在發(fā)酵過程中的“酸崩潰”會導(dǎo)致糖的不完全利用和細(xì)胞代謝的抑制；為了研究spo0A基因破壞在拜氏梭菌中的特定作用，Seo等[56]構(gòu)建了一個拜氏梭菌spo0A突變體，涉及262 bp基因組DNA片段的缺失，包括啟動子區(qū)spo0AORF的初始部分，使用基于CRISPR/Cas9的基因組工程。將pH值控制在6.5的分批發(fā)酵中，spo0A突變體從60 g/L葡萄糖中積累的丁酸和丁醇分別高達(dá)8.96 g/L和3.32 g/L，表現(xiàn)出丁酸和丁醇在高濃度下均會積累spo0A突變體的獨(dú)特表型。在脂肪酶的存在下，ABE發(fā)酵過程中丁酸和丁醇的縮合可形成β-淀粉。在以十六烷為原料的小規(guī)模批量提取發(fā)酵的初步試驗中，在添加脂肪酶CalB的提取劑中，由于丁酸鹽的積累，使spo0A突變體遭受酸破壞，因此僅產(chǎn)生98 mg/L丁酸丁酯。為了減輕丁酸的毒性，在雙相培養(yǎng)基中添加了10 g/L的CaCO3和5 g/L丁醇。然后在十六烷層中丁酸丁酯的產(chǎn)量增加到2.73 g/L。當(dāng)進(jìn)行連續(xù)攪拌以增強(qiáng)丁酸丁酯的酯化和萃取時，在十六烷層中獲得3.32 g/L的丁酸丁酯。在這項研究中，Seo等[56]成功地證明通過同時進(jìn)行ABE發(fā)酵、濃縮和萃取，拜氏梭菌spo0A突變體可用于丁酸丁酯的生產(chǎn)，但是該收率低于用產(chǎn)生高丁醇的梭狀芽孢桿菌獲得的濃度。

表2 生物發(fā)酵法合成丁酸丁酯的比較

酪丁酸梭狀芽孢桿菌(ATCC25755)是一種天然的丁酸鹽高產(chǎn)菌，可以產(chǎn)生丁酸，乙酸的產(chǎn)量低到忽略不計，因此具有極高的丁酸丁酯的選擇性(91%)。此外，它比其他梭菌具有更高的丁酸耐受性。Zhang等[68]利用該菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中外源補(bǔ)充脂肪酶和丁醇，并且通過原位酯化可實現(xiàn)丁酸丁酯的高效生產(chǎn)。通過優(yōu)化提取劑類型，脂肪酶負(fù)載量、攪拌、pH和丁醇補(bǔ)充策略后，最終從50 g/L的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生了 34.7 g/L丁酸丁酯。消除副產(chǎn)品和生產(chǎn)高含量丁酸丁酯是有助于提高其丁酸丁酯的生產(chǎn)效率。在該研究中，其獲得的丁酸丁酯產(chǎn)量是目前間歇發(fā)酵過程中最高的。這個結(jié)果證明從低價值碳源生產(chǎn)到可再生丁酸丁酯的絕佳生物學(xué)平臺的可能性。

2.2.3 基于微生物共培養(yǎng)策略合成短鏈脂肪酸酯

溶劑梭菌 ABE發(fā)酵產(chǎn)生的酯通常集中在丁酸丁酯上，而丙酮通常是主要副產(chǎn)物(占產(chǎn)品的30%)。丙酮不能作為酯化反應(yīng)的反應(yīng)物，并且由于其對發(fā)動機(jī)橡膠部件的腐蝕性和較差的燃油性能，常被視為不良的燃油產(chǎn)品[76]。由于次級醇脫氫酶(secondary alcohol dehydrogenase)的參與，一些梭菌可以產(chǎn)生異丙醇而不是丙酮，相關(guān)發(fā)酵過程也稱為異丙醇-丁醇-乙醇(isopropanol-butanol-ethanol, IBE)發(fā)酵。與丙酮相比，異丙醇理論上可以轉(zhuǎn)化為丁酸異丙酯等酯類。拜氏梭菌BGS1是IBE發(fā)酵最優(yōu)的菌株之一，其以葡萄糖為底物時可以生產(chǎn)丁醇(約10.2 g/L)和異丙醇(約3.4 g/L)[77]。因此，拜氏梭菌BGS1可以在南極假絲酵母脂肪酶B的催化下生產(chǎn)酯。當(dāng)在120 h的培養(yǎng)物中加入50 g/L丁酸鈉時(pH 3)，可以得到11.0 g/L丁酸丁酯和1.3 g/L丁酸異丙酯。

由于ABE發(fā)酵過程不能產(chǎn)生足夠的丁酸，需要外源添加丁酸鹽，可以構(gòu)建共培養(yǎng)體系引入另一種菌株來過量生產(chǎn)丁酸。酪丁酸梭菌ATCC 25755可以生產(chǎn)大量的丁酸，因此當(dāng)兩個菌株共培養(yǎng)時，可以得到比拜氏梭菌BGS1單一培養(yǎng)更高的酯濃度。當(dāng)酪丁酸梭菌ATCC 25755與拜氏梭菌BGS1共培養(yǎng)時，可以最終產(chǎn)生0.2 g/L丁酸異丙酯和5.1 g/L丁酸丁酯。這是關(guān)于從IBE發(fā)酵和兩個梭菌共培養(yǎng)生產(chǎn)丁酸異丙酯的首次報道，其強(qiáng)調(diào)脂肪酶和共培養(yǎng)策略在酯生產(chǎn)中的潛在用途[78]。

3 結(jié)論

已經(jīng)有大量研究使用酵母、溶劑梭菌以及工程改造的大腸桿菌等生產(chǎn)短鏈脂肪酸酯。在這些過程中，醇?；D(zhuǎn)移酶和脂肪酶分別催化醇與?；鵆oA、醇和酸酯化，產(chǎn)生短鏈脂肪酸酯。許多研究表明在梭狀芽胞桿菌中，丁醇、?；鵆oA、丁酸和乙酸等作為代謝物形成，因此這些菌株是生產(chǎn)丁酯的希望宿主，如丁酸丁酯和乙酸丁酯。另一方面，由于野生型大腸桿菌不產(chǎn)生醇和酰基CoA，因此需要在工程菌株中構(gòu)建合成模塊以形成短鏈脂肪酸酯生產(chǎn)的前體。

工程和/或外部補(bǔ)充的醇?；D(zhuǎn)移酶和脂肪酶在這些一鍋法中可以正常發(fā)揮作用，但迄今獲得的酯產(chǎn)量不足以使這些策略取代目前的催化和酶法。為克服這一障礙，有必要通過進(jìn)化酶工程來提高醇酰基轉(zhuǎn)移酶對醇和?；鵆oA的親和力。對涉及脂肪酶的過程，系統(tǒng)代謝工程可用于優(yōu)化梭菌的代謝途徑，例如，可以適當(dāng)?shù)那绑w比例調(diào)控生產(chǎn)醇和酸，進(jìn)一步提高短鏈脂肪酸酯的產(chǎn)量。利用微生物共培養(yǎng)可以消除底物的添加，通過調(diào)節(jié)接種時間和比例等，可以實現(xiàn)從頭合成丁酸丁酯(圖4)。此外，針對廉價碳源、固定化脂肪酶、細(xì)胞表面展示技術(shù)等方面開展研究，進(jìn)一步降低短鏈脂肪酸酯生物合成成本。

圖4 共培養(yǎng)酪丁酸梭菌和丙酮丁醇梭菌合成丁酸丁酯Figure 4 Synthesis of butyl butyrateusingco-cultivation of C.tyrobutyricum and C.acetobutylicum