NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的關(guān)系

賈欽堯，宋珊，王濤，陳紹平

1川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科

支氣管哮喘是一種以可逆性氣流受限和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道炎癥性疾病，長期氣道阻塞和炎癥反應(yīng)可引起阻塞性肺氣腫、肺心病等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-3］。糖皮質(zhì)激素是目前治療支氣管哮喘最有效的藥物，但長期使用可引起機(jī)體一系列不良反應(yīng)［4-5］。因此，臨床醫(yī)師一直在積極地尋找能夠替代或輔助糖皮質(zhì)激素的藥物。阿奇霉素是第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能夠通過抑制細(xì)菌蛋白的合成而發(fā)揮抗菌作用，可用于支氣管哮喘的輔助治療［6］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）是體內(nèi)固有免疫的重要受體。有研究報道，NLRP3炎癥小體被激活后，可使無活性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，活化的Caspase-1能夠?qū)L-1β、IL-18前體裂解為具有生物活性的IL-1β和IL-18，從而啟動瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重支氣管哮喘病情［7］。在臨床治療中發(fā)現(xiàn)，不同支氣管哮喘患者相同方案的治療效果差異顯著。這可能與NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性有關(guān)。本研究觀察了NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月—3月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者180例。所有患者符合《中國支氣管哮喘防治指南（基層版）》［8］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期為慢性持續(xù)期；②年齡18～65歲；③病程>1年；④接受阿奇霉素治療且規(guī)律服藥；⑤臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因其他呼吸系統(tǒng)疾病引起的咳嗽、喘息等癥狀者；②合并造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)等疾病者；③合并心、腎、肝等重要臟器功能障礙者；④治療依從性差者。所有患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予阿奇霉素治療3個月，根據(jù)《中國支氣管哮喘防治指南（基層版）》［8］中的哮喘控制測試（ACT）評分分為控制組（ACT評分≥19分）100例和未控制組（ACT評分<19分）80例。其中，控制組男54例、女46例，年齡20～64（52.79±7.47）歲，病程2～8（6.37±1.88）年；未控制組男45例、女35例，年齡22～61（53.54±7.31）歲，病程3～9（6.41±1.92）年。同期另選在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢健康的志愿者100例（對照組），男51例、女49例，年齡25～60（52.92±7.14）歲。三組性別、年齡具有可比性，控制組與未控制組病程亦具有可比性。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：202101040038），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者根據(jù)具體病情，給予解痙、平喘、祛痰、擴(kuò)張支氣管等常規(guī)對癥支持治療，同時給予阿奇霉素口服，每次0.25 g，一周2次。當(dāng)慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者最大呼氣峰流速（PEF）或第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（FEV1%）恢復(fù)至個人最佳值60%以上時，可出院回家繼續(xù)治療。連續(xù)治療至少3個月。

1.3 NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性檢測 控制組與未控制組連續(xù)治療3個月后末次隨訪時，對照組體檢當(dāng)日，征求研究對象或其家屬同意后進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測?？刂平M、未控制組和對照組分別有90、75、92例同意參與檢測。采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，-80℃超低溫冰箱凍存。待標(biāo)本成批后，提取全血基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計鑒定，提取的基因組DNA純度和濃度合格，可用于后續(xù)實驗。借助SNP browser軟件，選擇NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，采用TaqMan探針法檢測基因型。根據(jù)檢測位點(diǎn)，設(shè)計PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR延伸引物，并由廣州擎科生物技術(shù)有限公司合成。按DNA擴(kuò)增試劑盒說明配制反應(yīng)體系，并借助熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃10 min，95℃15 s、60℃1 min共40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束，借助SDS2.0軟件采集反應(yīng)信號，然后劃分基因型。若僅存在1個熒光信號增強(qiáng)，則為純合子；若存在2個熒光信號增強(qiáng)，則為雜合子。若熒光信號增強(qiáng)不明顯，則需重復(fù)測定。

1.4 肺功能檢測 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者連續(xù)治療3個月后末次隨訪時，于靜息狀態(tài)下，采用捷斯特CHESTGRAPHHI-10便攜式肺功能儀檢測FEV1%、第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）、PEF。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料先行Shapiro-Wilk檢驗，確定符合正態(tài)分布后以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。群體代表性分析采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三 組NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型分布比較 三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型的期望值和觀測值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），見表1。

表1 三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型分布比較（例）

2.2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的關(guān)系 以阿奇霉素治療后支氣管哮喘是否控制（是=1，否=0）為 因 變 量，以NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位 點(diǎn) 基 因 型（GG=0，GC=1，CC=2）為自變量，納入Logistic回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)各基因型均為慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的影響因素（P均<0.05），見表2。

表2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型對慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果影響的Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較 見表3～5。

表3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

表3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs10754558位點(diǎn)基因型CC CG GG n 44 84 37 FEV1%（%）67.15±6.13*#60.23±7.25*54.76±6.43 FEV1/FVC（%）65.55±6.25*#61.62±6.43*56.56±6.38 PEF（L/min）385.72±31.57*#346.32±40.47*309.74±41.36

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病。氣道炎癥幾乎是所有類型支氣管哮喘的共同特征，也是其臨床癥狀和氣道高反應(yīng)性的基礎(chǔ)。糖皮質(zhì)激素是治療支氣管哮喘最常用、最有效的藥物，其強(qiáng)效抗炎作用能夠抑制氣道炎癥反應(yīng)、降低氣道高反應(yīng)性。但在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素的使用劑量個體差異較大，長期使用可引起機(jī)體一系列不良反應(yīng)［4-5］。因此，治療期間往往需要輔助用藥。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除了具有抑菌作用外，還具有降低氣道高反應(yīng)性、抑制炎癥介質(zhì)釋放等作用。阿奇霉素是第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其在支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化等疾病中的治療效果已得到驗證。REITER等［9］研究報道，支氣管哮喘患者經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后，雖然FEV1較治療前變化不明顯，但能夠明顯改善PEF，降低氣道高反應(yīng)性，緩解臨床癥狀。因此，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有可能成為支氣管哮喘的輔助治療藥物。張茂榮等［6］Meta分析發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上使用阿奇霉素能夠改善支氣管哮喘患者FEV1、PEF，但僅能預(yù)防部分支氣管哮喘患者急性發(fā)作，在減少支氣管哮喘藥物使用、改善臨床癥狀方面效果并不明顯。因此，阿奇霉素對支氣管哮喘的治療效果仍有待于進(jìn)一步研究。

表4 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

表4 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs10925019位點(diǎn)基因型CC CG GG n 80 62 23 FEV1%（%）64.12±6.46*#61.64±6.24*55.38±6.72 FEV1/FVC（%）63.52±5.69*#60.78±6.41*57.89±6.48 PEF（L/min）378.48±38.26*#352.36±42.17*312.34±33.12

表5 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

表5 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位點(diǎn)不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs4925648位點(diǎn)基因型CC CG GG n 117 42 6 FEV1%（%）61.25±6.63*60.22±7.41*53.14±6.68 FEV1/FVC（%）63.55±6.45*#59.63±6.42*54.47±6.32 PEF（L/min）369.74±33.75*#332.35±42.85*294.54±36.15

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型代表，主要由C端亮氨酸重復(fù)序列、N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域和中間的NACHT結(jié)構(gòu)域三部分組成，通過亮氨酸重復(fù)序列識別三磷酸腺苷、內(nèi)毒素、胞壁酰二肽等信號分子，使其構(gòu)象發(fā)生變化，同時其N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域通過募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白、Caspase-1，最終形成NLRP3炎癥小體，進(jìn)而引起機(jī)體異常炎癥反應(yīng)［10-11］。NLRP3炎性小體異常激活已被證實與慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肺纖維化等炎癥性疾病密切相關(guān)［12-13］。有證據(jù)表明，NLRP3炎性小體在支氣管哮喘氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［14］。急性發(fā)作期支氣管哮喘患者肺組織NLRP3 mRNA表達(dá)高于慢性持續(xù)期，經(jīng)有效治療后NLRP3 mRNA表達(dá)可明顯降低。因此，NLRP3 mRNA表達(dá)能夠反映支氣管哮喘嚴(yán)重程度和治療效果［13］。

本研究選擇NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)［13，15］，并對控制組、未控制組和對照組這三個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個位點(diǎn)基因型的期望值和觀測值具有可比性，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明研究對象具有群體代表性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，控制組、未控制組和對 照 組NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘發(fā)生有關(guān)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)各基因型均為慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的影響因素，證實NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與阿奇霉素治療慢性持續(xù)期支氣管哮喘的臨床效果有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)不同基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因三個位點(diǎn)純合子CC基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF水平最佳。提示NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)基因型與慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者的肺功能關(guān)系密切。胡向陽等［16］研究報道，冠狀動脈粥樣硬化患者NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)GG、GC基因型者血清ET-1、E選擇素水平明顯高于CC基因型者，而血清NO水平明顯低于CC基因型者，表明GG、GC基因型可能通過激活炎癥反應(yīng)而促進(jìn)疾病進(jìn)展。由此推測，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)GG或GC基因型能夠激活NLRP3炎性小體，促進(jìn)炎癥因子釋放，通過激活炎癥反應(yīng)而促進(jìn)支氣管哮喘病情進(jìn)展，繼而影響阿奇霉素的治療效果。但對于NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)影響慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素的治療效果密切相關(guān)；NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點(diǎn)純合子CC基因型越多，阿奇霉素的治療效果越好。