玉屏風(fēng)散對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠肥大細(xì)胞成熟及活化的影響

陸越悅 何晗昳 滕堯樹(shù) 金衛(wèi)東

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是機(jī)體暴露于變應(yīng)原后主要由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥，已成為主要的呼吸道慢性炎癥疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球AR 患者人數(shù)超過(guò)5億，患病率為10%～25%[1]。肥大細(xì)胞能產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)B 細(xì)胞IgE 合成，并能通過(guò)肥大細(xì)胞-IgE-高親和力受體（FcεRI）級(jí)聯(lián)自我激活，在AR 的發(fā)病中起著重要作用[2]。研究表明，玉屏風(fēng)散具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)控包括肥大細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，被廣泛用于治療支氣管哮喘、AR 及呼吸道反復(fù)感染等疾病，但其藥物作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全清楚[3-4]。本研究通過(guò)玉屏風(fēng)散干預(yù)卵白蛋白（ovalbumin，OVA）制備的AR 模型，探索玉屏風(fēng)散對(duì)AR 小鼠肥大細(xì)胞分化、成熟及活化的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 BALB/c 近交系小鼠30 只，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量約25.0g，SPF 級(jí)。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)：20170005036437。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對(duì)濕度范圍40%～70%。飲用水為滅菌二級(jí)超純水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2015-0008。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批（審批編號(hào)：HB201601208）。

1.2 玉屏風(fēng)散配置 按《中華人民共和國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)配置玉屏風(fēng)散[5]。取黃芪300g，白術(shù)、防風(fēng)各100g（比例3∶1∶1），加水3000mL（按每克生藥加水6mL），冷水浸泡30min，煮沸后再文火慢煎40min，趁熱過(guò)濾，濾液自然滴盡；二煎加水2000mL（按每克生藥加水4mL），煮沸后，文火慢煎40min，趁熱過(guò)濾濾液，自然滴盡?；旌? 次濾液，濃縮配成1.0g/mL 的玉屏風(fēng)散水煎液，置4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 OVA（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)SLBQ 9036V），氫氧化鋁Al（OH）3（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120629），組胺酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)JL10420），白介素-13（IL-13）ELISA 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)SEKM-0014），甲苯胺藍(lán)染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G3663），兔抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab151757），酶標(biāo)山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PV-6001），Anti-mouse CD117-FITC 抗體（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)105816），Anti-mouseFcεRI-APC 抗體（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)134316），紅細(xì)胞裂解液（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)MR0504-500）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 將30 只BALB/c 近交系小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、AR 模型組和玉屏風(fēng)散組，每組10 只。致敏階段：AR模型組和玉屏風(fēng)散組均于第0、7、14 天腹腔注射OVA（25μg）+Al（OH）3（1mg）混懸液0.2mL，正常對(duì)照組按上述方法腹腔注射生理鹽水0.2mL。激發(fā)階段：從第21～27 天（共連續(xù)7 天）分別對(duì)AR 模型組和玉屏風(fēng)散組用OVA（25mg/mL）進(jìn)行滴鼻激發(fā)，每天1次，每次20μL，正常對(duì)照組則用等量生理鹽水滴鼻。玉屏風(fēng)散干預(yù)階段：玉屏風(fēng)散組于激發(fā)前1 天開(kāi)始用玉屏風(fēng)散水煎劑灌胃（25g·kg-1·d-1）治療，連續(xù)8天，正常對(duì)照組和AR 模型組則用等量生理鹽水灌胃。

2.2 行為學(xué)觀察 末次激發(fā)后，觀察15min 內(nèi)小鼠噴嚏、撓鼻和流涕，并進(jìn)行評(píng)分，采用疊加量化記分法計(jì)算總分，從而評(píng)估各組AR 發(fā)病率及嚴(yán)重程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[6]。

表1 小鼠鼻部癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 ELISA 檢測(cè)血漿組胺和IL-13 水平 末次激發(fā)后24h，摘除小鼠眼球取血，置于肝素抗凝管中，室溫下靜置1h，離心（離心半徑13.49cm，轉(zhuǎn)速3500r/min）10min，取上清為待測(cè)血漿。按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿組胺和IL-13 水平。

2.4 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)鼻黏膜肥大細(xì)胞浸潤(rùn) 末次激發(fā)后24h，將小鼠脫頸椎處死，取下含鼻腔的小鼠頭部，用4%多聚甲醛4.0℃固定24h，然后用10%EDTA 緩沖液脫鈣28 天，隔日換液，最后將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色10～15min，0.5%冰乙酸分化，直到細(xì)胞核和顆粒清晰可見(jiàn)。計(jì)數(shù)3 個(gè)高倍鏡下鼻黏膜組織切片中肥大細(xì)胞數(shù)量的平均值，評(píng)估肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)鼻黏膜類胰蛋白酶表達(dá)將鼻腔組織的石蠟切片脫蠟水化，經(jīng)高壓修復(fù)抗原后加兔抗小鼠類胰蛋白酶單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，用酶標(biāo)山羊抗兔IgG 二抗37℃孵育30min，DBA顯色，蘇木素復(fù)染。每組隨機(jī)取3 個(gè)視野，用Image-Pro Plus 測(cè)量樣本免疫組化陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞表面標(biāo)志物CD117、FcεRI 表達(dá) 末次激發(fā)后24h，取小鼠股骨和脛骨，以1mL 注射器針頭反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，獲取單細(xì)胞懸液，離心（離心半徑14cm，轉(zhuǎn)速1000r/min）5min，獲取細(xì)胞沉淀，加入3mL 紅細(xì)胞裂解液重選細(xì)胞，室溫裂紅5min，離心5min，棄去上清，每支離心管再加入2mL 紅細(xì)胞裂解液；離心5min，棄去上清，1mL 1640 培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞。按操作說(shuō)明書(shū)加入Anti-mouse CD117-FITC抗體和Anti-mouse FcεRI-APC 抗體，4℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩采用Bonferroni法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 玉屏風(fēng)散對(duì)AR 模型小鼠撓鼻和噴嚏的影響與正常對(duì)照組比較，AR 模型組小鼠的撓鼻、噴嚏及流清涕評(píng)分和鼻部癥狀總評(píng)分均顯著增加（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風(fēng)散組可明顯改善小鼠的撓鼻、噴嚏及流清涕評(píng)分和鼻部癥狀總評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠AR 鼻部癥狀評(píng)分比較（分，）

表2 各組小鼠AR 鼻部癥狀評(píng)分比較（分，）

注：正常對(duì)照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風(fēng)散組給予玉屏風(fēng)散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態(tài)性鼻炎；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

3.2 玉屏風(fēng)散對(duì)AR 模型小鼠血漿組胺和IL-13 水平的影響 與正常對(duì)照組比較，AR 模型組小鼠血漿組胺和IL-13 水平顯著增加（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風(fēng)散組可明顯降低小鼠血漿中組胺和IL-13 的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血漿組胺和IL-13 水平比較（）

表3 各組小鼠血漿組胺和IL-13 水平比較（）

注：正常對(duì)照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風(fēng)散組給予玉屏風(fēng)散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態(tài)性鼻炎；IL-13 為白介素-13；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

3.3 玉屏風(fēng)散對(duì)AR 模型小鼠鼻黏膜組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 各組小鼠鼻黏膜組織經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，肥大細(xì)胞呈藍(lán)紫色。與正常對(duì)照組比較，AR 模型組鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風(fēng)散組鼻黏膜組織肥大細(xì)胞數(shù)量則顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖1。

表4 各組小鼠鼻黏膜組織肥大細(xì)胞數(shù)量及類胰蛋白酶表達(dá)比較（）

表4 各組小鼠鼻黏膜組織肥大細(xì)胞數(shù)量及類胰蛋白酶表達(dá)比較（）

注：正常對(duì)照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風(fēng)散組給予玉屏風(fēng)散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態(tài)性鼻炎；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

圖1 各組小鼠鼻黏膜組織甲苯胺藍(lán)染色（×400）

3.4 玉屏風(fēng)散對(duì)AR 模型小鼠鼻黏膜組織類胰蛋白酶表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，AR 模型組鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風(fēng)散組鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖2。

圖2 各組小鼠鼻黏膜組織中類胰蛋白酶免疫組化染色（×200）

3.5 玉屏風(fēng)散對(duì)AR 模型小鼠骨髓細(xì)胞表達(dá)CD117和FcεRI 的影響 各組小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，AR 組小鼠骨髓CD117和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與AR 模型組比較，玉屏風(fēng)散組小鼠骨髓中CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例則顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表5，圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠骨髓細(xì)胞中CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例

表5 各組小鼠骨髓細(xì)胞CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例比較（%，）

表5 各組小鼠骨髓細(xì)胞CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例比較（%，）

注：正常對(duì)照組及AR 模型組給予等量生理鹽水灌胃；玉屏風(fēng)散組給予玉屏風(fēng)散水煎劑（25g·kg-1·d-1）灌胃；AR 為變態(tài)性鼻炎；CD117 為特異性受體；FcεRI 為肥大細(xì)胞-IgE-高親和力受體；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AR 模型組比較，bP＜0.05

4 討論

AR 是以特應(yīng)性個(gè)體接觸致敏原后經(jīng)IgE 介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒為開(kāi)端的，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的鼻黏膜Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，肥大細(xì)胞源自CD34+骨髓前體細(xì)胞，干細(xì)胞因子能與特異性受體（CD117）結(jié)合，使上述前體細(xì)胞分化為肥大細(xì)胞。特應(yīng)性個(gè)體吸入變應(yīng)原，經(jīng)氣道黏膜中的抗原提呈細(xì)胞識(shí)別，提呈給T 淋巴細(xì)胞，促使Th0 向Th2 轉(zhuǎn)換，Th2 通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-13 等炎性因子，促進(jìn)氣道變應(yīng)性炎癥的發(fā)生、發(fā)展，并誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性B細(xì)胞增殖、分化以及合成特異性IgE，與聚集在鼻黏膜組織中成熟肥大細(xì)胞表面FcεRI 相結(jié)合[7-8]。當(dāng)機(jī)體再次接觸相同變應(yīng)原時(shí)，變應(yīng)原與錨定在肥大細(xì)胞表面的IgE 分子交聯(lián)，活化肥大細(xì)胞，導(dǎo)致組胺等預(yù)貯存在肥大細(xì)胞顆粒物中的炎性介質(zhì)釋放，引起速發(fā)相反應(yīng)；肥大細(xì)胞還能分泌白三烯等細(xì)胞炎性因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌黏附分子、趨化因子及細(xì)胞因子等，募集和活化嗜酸粒細(xì)胞及Th2 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，參與遲發(fā)相反應(yīng)[2，9-10]。因此，肥大細(xì)胞作為AR 的重要效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)控其分化、成熟及活化過(guò)程，對(duì)于抑制AR 速發(fā)相和遲發(fā)相反應(yīng)具有重要價(jià)值。

AR 歸屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，AR 患者的臨床發(fā)病往往屬于虛證，其中肺氣虛型患者最為常見(jiàn)。玉屏風(fēng)散組方中的黃芪能滋補(bǔ)肺脾之氣，固表止汗；白術(shù)益氣健脾，防風(fēng)祛風(fēng)御邪，全方共奏益氣實(shí)衛(wèi)之功效[11]。研究表明，玉屏風(fēng)能優(yōu)化機(jī)體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞亞群分布比例，繼而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫的功能，已廣泛用于AR、支氣管哮喘、呼吸道感染性疾病以及慢性阻塞性肺疾病[3，12]。玉屏風(fēng)散能使AR大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和調(diào)節(jié)激活正常T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子表達(dá)降低，減少AR 大鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕鼻黏膜的變應(yīng)性炎癥[13]。

肥大細(xì)胞脫顆粒是肥大細(xì)胞區(qū)別于其他細(xì)胞的一種特異性功能狀態(tài)，為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中肥大細(xì)胞活化的重要標(biāo)志。組胺、類胰蛋白酶、β 己糖胺酶常被用作定量測(cè)定肥大細(xì)胞脫顆粒水平的生物標(biāo)志物[14-15]。CD117 和FcεRI 的表達(dá)水平可以用來(lái)分析肥大細(xì)胞的成熟度和純度[16-17]。本研究結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散可明顯改善AR 模型小鼠的鼻部癥狀，減輕其鼻黏膜組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，降低鼻黏膜組織中類胰蛋白酶表達(dá)、血漿組胺和IL-13 水平，以及骨髓細(xì)胞CD117 和FcεRI 雙陽(yáng)細(xì)胞的比例等提示肥大細(xì)胞成熟和活化的指標(biāo)。因此，我們認(rèn)為，玉屏風(fēng)散不僅能抑制肥大細(xì)胞的分化、成熟及組織浸潤(rùn)，也能通過(guò)降低肥大細(xì)胞脫顆粒及炎性因子分泌水平達(dá)到抑制肥大細(xì)胞活化的目的，從而改善AR 的鼻部癥狀。但其具體機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路尚不明確，有待細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，玉屏風(fēng)散對(duì)AR 具有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控肥大細(xì)胞的分化、成熟以及脫顆粒和分泌細(xì)胞因子水平有關(guān)。